全基因組測(cè)序在耐甲氧西林金黃色葡萄球菌流行病學(xué)調(diào)查中的應(yīng)用*

儲(chǔ)丹丹 綜述，單 斌△ 審校

(1.昆明醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)科，云南昆明 650032；2.云南省檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，云南昆明 650032)

耐甲氧西林金黃色葡萄球菌(MRSA)是一種高致病性革蘭陽(yáng)性菌，常定植在健康人體鼻腔、咽喉、皮膚等部位[1]，當(dāng)機(jī)體免疫力低下時(shí)可引起呼吸道、皮膚軟組織、血液及醫(yī)療器械相關(guān)性感染，是引起醫(yī)院和社區(qū)感染的重要病原菌之一[2]。MRSA具有多重耐藥性，并且常攜帶多種毒力因子，由它所致的感染多呈流行或暴發(fā)，治療困難大，病死率高，增加了社會(huì)經(jīng)濟(jì)和醫(yī)療負(fù)擔(dān)[2]。因此，快速、可靠地鑒別及追溯醫(yī)院和社區(qū)MRSA感染的源頭，獲得其分子特性，掌握疾病流行擴(kuò)散的趨勢(shì)，對(duì)于指導(dǎo)臨床治療和疾病防控至關(guān)重要[2-3]。本文就MRSA常規(guī)分型方法、細(xì)菌全基因組測(cè)序(WGS)概述、WGS用于MRSA流行病調(diào)查實(shí)例等方面進(jìn)行簡(jiǎn)要綜述。

1 MRSA的常規(guī)分子分型方法

目前對(duì)MRSA流行病學(xué)的研究主要采用脈沖場(chǎng)凝膠電泳(PFGE)、多位點(diǎn)序列分型(MLST)、spa分型、SCC mec分型等技術(shù)[4-6]。PFGE利用限制性內(nèi)切酶對(duì)細(xì)菌染色體DNA片段進(jìn)行酶切，再將酶切片段電泳分離，最后對(duì)所得酶切圖譜進(jìn)行比對(duì)，分析各菌株間的相關(guān)性。MLST通過(guò)對(duì)MRSA染色體上的管家基因進(jìn)行PCR擴(kuò)增，并將測(cè)序結(jié)果與MLST數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行比對(duì)，從而根據(jù)堿基序列的差異及等位基因的不同組合類型分析菌株間的同源性和進(jìn)化關(guān)系[7]。spa分型通過(guò)擴(kuò)增編碼葡萄球菌A蛋白(SPA)基因片段的X區(qū)來(lái)對(duì)MRSA進(jìn)行分型。SCC mec分型則是利用多重PCR擴(kuò)增SCC mec元件中的特有序列，與質(zhì)控菌株比較得到分型結(jié)果[8]。但是，這些傳統(tǒng)分子分型方法都是從細(xì)菌DNA片段或特殊位點(diǎn)入手，結(jié)果僅能反映細(xì)菌基因組的局部遺傳信息，在高度克隆化的菌株或進(jìn)行長(zhǎng)時(shí)間跨度的流行病學(xué)研究時(shí)分辨能力有限[9]。此外，這些傳統(tǒng)方法在實(shí)際操作時(shí)不僅費(fèi)時(shí)，且不能在分型的同時(shí)獲得耐藥基因、毒力基因等反映致病性的重要信息，故在實(shí)際應(yīng)用中稍顯不足。

2 WGS概述

下一代測(cè)序(NGS)是一種允許數(shù)千到數(shù)十億個(gè)DNA片段獨(dú)立或同時(shí)進(jìn)行高通量、大規(guī)模并行測(cè)序的方法[10]，近年來(lái)NGS的應(yīng)用已經(jīng)從研究工具過(guò)渡到診斷方法，并在臨床微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室中的應(yīng)用越來(lái)越普遍。WGS是最重要的一種NGS技術(shù)，已逐漸成為研究細(xì)菌流行病學(xué)特征的重要手段[11]。

相較于Sanger測(cè)序，WGS不需要針對(duì)不同DNA片段或細(xì)菌種屬設(shè)計(jì)特定引物，而是通過(guò)大規(guī)模隨機(jī)序列擴(kuò)增和實(shí)時(shí)檢測(cè)合成信號(hào)以獲得大量原始數(shù)據(jù)，再通過(guò)各種生物信息學(xué)工具來(lái)分析序列數(shù)據(jù)的質(zhì)量，并將未精確排序的原始測(cè)序數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)換為完整的基因組序列信息。尤其是細(xì)菌完成圖的繪制可以非常清晰地了解基因組的結(jié)構(gòu)，為研究細(xì)菌的功能和進(jìn)化提供數(shù)據(jù)參考[12-13]。此外，WGS不僅可獲得純菌落的基因組信息，還可獲得混合標(biāo)本的基因組信息，故可以區(qū)分高度相關(guān)的譜系，具有其他方法沒(méi)有的分辨率和精度。通過(guò)WGS技術(shù)，不僅可獲得近乎完整的細(xì)菌 DNA信息，包括種屬、耐藥基因和毒力因子的攜帶情況、可移動(dòng)元件等信息，還可對(duì)多個(gè)細(xì)菌間的基因組信息進(jìn)行比較，對(duì)于耐藥菌株的分子流行病學(xué)和傳播機(jī)制研究至關(guān)重要[13]。

WGS在細(xì)菌流行病學(xué)調(diào)查中的應(yīng)用與生物信息學(xué)技術(shù)的發(fā)展密不可分[3]。多種生物信息學(xué)工具的開(kāi)發(fā)和成熟使微生物基因組序列分析工作日趨簡(jiǎn)便。目前，運(yùn)用WGS數(shù)據(jù)進(jìn)行菌株分型和溯源主要通過(guò)篩選細(xì)菌核心基因組的單核苷酸多態(tài)性(SNP)位點(diǎn)差異，以SNP差異數(shù)量的多少反映菌株基因組之間的差異，進(jìn)而分析其同源性[12,14-15]。通常暴發(fā)流行菌株基因組之間的差異主要體現(xiàn)在單個(gè)堿基的變異，同源性比較接近，而散發(fā)菌株基因組之間差異較大，可能存在大片段序列的插入或缺失，所以SNP可以準(zhǔn)確衡量菌株之間的差異。因此，在比較基因組SNP差異前，需要先確定菌株的核心基因組。簡(jiǎn)而言之，利用WGS溯源分析主要步驟包括：(1)獲取WGS原始序列數(shù)據(jù)；(2)挑選合適的參考基因組序列；(3)確定所有基因組序列的核心基因組；(4)用SNP差異構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)生樹(shù)，找到菌株之間的同源關(guān)系等。WGS應(yīng)用于感染暴發(fā)菌株分析時(shí)，可以利用其基因組數(shù)據(jù)的強(qiáng)大分辨率和大量菌株信息，在進(jìn)行充分分型的基礎(chǔ)上對(duì)暴發(fā)菌株同源性的遠(yuǎn)近進(jìn)行精確判斷，并分辨出不同的進(jìn)化路線，甚至可推算出基因組堿基突變需花費(fèi)的時(shí)間[6,11]。

3 WGS在MRSA流行病學(xué)調(diào)查中的實(shí)踐應(yīng)用

近年來(lái)，WGS技術(shù)的廣泛應(yīng)用使人們能夠?qū)RSA的傳播模式進(jìn)行更詳細(xì)的研究，包括分析過(guò)去無(wú)記錄的傳播和全面、詳細(xì)的菌株進(jìn)化過(guò)程[16-18]。隨著該技術(shù)的日益普及和成本的降低，WGS將不再局限于科學(xué)研究，而將越來(lái)越多地應(yīng)用于常規(guī)臨床實(shí)驗(yàn)室，為日常醫(yī)療和科研工作帶來(lái)便利。目前，WGS已經(jīng)在醫(yī)院、其他醫(yī)療機(jī)構(gòu)和社區(qū)的流行病調(diào)查中發(fā)揮重要作用，為醫(yī)院和社區(qū)的疾病預(yù)防和溯源工作做出前所未有的貢獻(xiàn)。

3.1醫(yī)院內(nèi)MRSA流行病學(xué)調(diào)查 新生兒和兒童免疫系統(tǒng)發(fā)育不成熟，一旦感染MRSA會(huì)造成嚴(yán)重的后果。因此，在新生兒科或兒科，WGS已被用于跟蹤MRSA的傳播和評(píng)價(jià)早期感染控制措施的效果。KOSER等[19]利用WGS證實(shí)MRSA在英國(guó)某院嬰兒特護(hù)病房?jī)?nèi)部、產(chǎn)后病房和社區(qū)中傳播，并證實(shí)一名醫(yī)務(wù)人員攜帶的MRSA在病房?jī)?nèi)的播散使暴發(fā)感染發(fā)展為持續(xù)感染，同時(shí)證明了抗菌藥物耐藥基因和耐藥表型檢測(cè)結(jié)果之間的一致性。EARLS等[20]利用WGS證實(shí)發(fā)生在愛(ài)爾蘭某院新生兒重癥監(jiān)護(hù)病房的兩次MRSA暴發(fā)均由同一個(gè)型別且高度克隆的菌株引起，通過(guò)與國(guó)際菌株的比較，推斷此次暴發(fā)菌株很可能來(lái)源于澳大利亞，因?yàn)樵撔蛣e是澳大利亞的流行克隆菌株類別之一。DURAND等[18]通過(guò)WGS發(fā)現(xiàn)法國(guó)兩次不同的新生兒MRSA暴發(fā)之間存在的傳播證據(jù)，也同時(shí)排除了某些型別造成大規(guī)模地方性聚集感染的可能性，由此說(shuō)明WGS具有足夠分辨力來(lái)證實(shí)或排除由傳統(tǒng)流行病學(xué)調(diào)查方法確定的暴發(fā)事件。

除新生兒科外，WGS在醫(yī)院其他科室的菌株流行病學(xué)調(diào)查中同樣重要。KONG等[21]采用WGS和傳統(tǒng)分子分型方法對(duì)江蘇某醫(yī)院神經(jīng)外科發(fā)生的一起疑似MRSA疫情進(jìn)行研究，鑒定了此次疫情中的暴發(fā)菌株和散發(fā)菌株，此外WGS結(jié)果還證實(shí)耐藥基因的存在與否與耐藥表型檢測(cè)結(jié)果基本一致，這是傳統(tǒng)分子分型方法無(wú)法做到的。CUNNINGHAM等[22]用WGS聯(lián)合PFGE對(duì)某院燒傷科分離的MRSA進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)雖然PFGE為同一型別，但WGS可將菌株分為高度克隆株和非克隆株，可見(jiàn)WGS具有遠(yuǎn)超于常規(guī)方法的分辨率。TONG等[23]用WGS證實(shí)了泰國(guó)某院病房?jī)?nèi)和病房間的感染傳播事件，并證明每個(gè)病房中均有1例患者充當(dāng)了暴發(fā)中傳播源頭的角色。RUBIN等[24]運(yùn)用WGS證實(shí)長(zhǎng)期攜帶MRSA的醫(yī)務(wù)人員和感染預(yù)防控制工作中的偶然疏漏導(dǎo)致了MRSA間歇性小范圍的醫(yī)院傳播。

3.2社區(qū)及其他醫(yī)療機(jī)構(gòu)間MRSA流行病學(xué)調(diào)查 雖然醫(yī)院感染預(yù)防和控制部門的重點(diǎn)范圍是醫(yī)院內(nèi)部，但感染有時(shí)可能發(fā)生在醫(yī)院外，比如來(lái)自其他醫(yī)院、其他國(guó)家的患者，特別是曾在國(guó)外住院的患者。美國(guó)一項(xiàng)研究利用WGS對(duì)來(lái)自美國(guó)22個(gè)州及地區(qū)和其他7個(gè)國(guó)家的357株MRSA進(jìn)行調(diào)查，詳細(xì)分析了菌株在賓夕法尼亞州的起源及其隨后的傳播范圍[25]。FLUIT等[26]將美國(guó)1株ST80 MRSA與歐洲分離的其他3株ST80型進(jìn)行比對(duì)，發(fā)現(xiàn)所有菌株來(lái)源于約20年前的同一菌株，可見(jiàn)WGS對(duì)長(zhǎng)時(shí)間大范圍的院外傳播具有很好的分析能力。HARRIS等[27]證明WGS可以用來(lái)研究MRSA的洲際和局部傳播，揭示優(yōu)勢(shì)菌株的流行和微觀進(jìn)化，還證實(shí)該技術(shù)在追蹤MRSA院內(nèi)傳播方面的潛力。

隨著人口老齡化，老年患者從醫(yī)院到其他醫(yī)療機(jī)構(gòu)(如養(yǎng)老院)，從一家醫(yī)院到另一家醫(yī)院，從入院到出院的速度比以前更快，許多研究都重點(diǎn)關(guān)注到MRSA在這些過(guò)程中的傳播[28-31]。一項(xiàng)研究用WGS對(duì)英國(guó)和愛(ài)爾蘭的MRSA進(jìn)行比較，結(jié)果表明在同一轉(zhuǎn)診區(qū)域內(nèi)的醫(yī)院檢出的菌株有相似性，且在一家醫(yī)院內(nèi)的菌株傳播是由從另一家醫(yī)院轉(zhuǎn)診的患者引起的[32]。此外，在倫敦兩家國(guó)家衛(wèi)生服務(wù)醫(yī)院和一家地區(qū)綜合醫(yī)院中進(jìn)行的一項(xiàng)研究發(fā)現(xiàn)，醫(yī)院頻繁收治患者會(huì)導(dǎo)致醫(yī)院內(nèi)以病房為單位的傳播[33]。

此外，WGS在MRSA定植與感染的研究中發(fā)揮著同樣重要的作用[34]。在對(duì)荷蘭一家腫瘤醫(yī)院進(jìn)行的一項(xiàng)醫(yī)務(wù)人員無(wú)癥狀鼻腔細(xì)菌定植的研究中，WGS證實(shí)了MSSA和MRSA菌株在暴發(fā)中的相似性[35]。MOORE等[36]證明在MRSA的定植和感染研究中，WGS對(duì)其他方法無(wú)法區(qū)分的菌株具有很高的分辨率。

4 WGS在MRSA流行病學(xué)中的應(yīng)用展望

WGS技術(shù)為醫(yī)院、社區(qū)和其他醫(yī)療機(jī)構(gòu)中MRSA的流行病學(xué)調(diào)查提供了新的分析手段，可以單獨(dú)或聯(lián)合傳統(tǒng)方法對(duì)疑似暴發(fā)菌株進(jìn)行分析，獲得菌株的遺傳信息、親緣關(guān)系、傳播路徑、耐藥性和毒力等特征，極大地?cái)U(kuò)展了對(duì)MRSA臨床和流行病學(xué)方面的認(rèn)識(shí)，包括醫(yī)院和社區(qū)中傳播克隆的共性及耐藥決定因素的演變。隨著該技術(shù)的發(fā)展，其價(jià)格越來(lái)越低，快速、精確、全面的優(yōu)點(diǎn)將使得該技術(shù)越來(lái)越多地被應(yīng)用到流行病調(diào)查中，通過(guò)對(duì)不同菌株所有遺傳信息的比對(duì)，發(fā)現(xiàn)菌株之間的遺傳特性差異及同源性，從而幫助院感科和疾控部門制訂更準(zhǔn)確、更詳細(xì)的疫情防控方案，進(jìn)而提高對(duì)MRSA暴發(fā)和流行的了解和控制。