銅綠假單胞菌的群感效應(yīng)及大環(huán)內(nèi)酯類藥物的臨床治療研究進(jìn)展

董穎 程思珺 金麗媛 傅方潔 劉俊秀 陳愉

中國醫(yī)科大學(xué)附屬盛京醫(yī)院呼吸與危重癥醫(yī)學(xué)科,沈陽110004

古希臘著名思想家亞里士多德觀察到螞蟻排隊(duì)搬運(yùn)食物、鰹魚遇到危險(xiǎn)時(shí)會(huì)云集的現(xiàn)象,在其 《動(dòng)物史》一書中首次提出動(dòng)物社會(huì)行為,即動(dòng)物個(gè)體間能夠傳遞信息,當(dāng)組成群體時(shí)可以發(fā)揮個(gè)體無法實(shí)現(xiàn)的作用和功能。關(guān)于微生物的社會(huì)性在20 世紀(jì)60～70 年代才初見端倪。Tomasz[1]發(fā)現(xiàn)肺炎鏈球菌的某個(gè)基因可以表達(dá),且僅在細(xì)菌增殖達(dá)到一定數(shù)量時(shí)才表達(dá),并快速出現(xiàn)一個(gè)高峰,這種基因表達(dá)可以通過細(xì)菌分泌的一種激素樣的小分子在同種細(xì)菌間相互傳遞。該研究是群感效應(yīng)學(xué)說的基石,此后科學(xué)家們通過發(fā)光細(xì)菌確立了該學(xué)說,并進(jìn)行了深入探討。銅綠假單胞菌是群感效應(yīng)研究最為深入的細(xì)菌,本文就該方面研究進(jìn)展以及大環(huán)內(nèi)酯類藥物的臨床治療作一簡要介紹。

1 微生物的群感效應(yīng)

1.1 群感效應(yīng)的概念 夏威夷短尾魷魚有發(fā)光的生物特性,而發(fā)光來自于與之共生的費(fèi)氏弧菌產(chǎn)生的熒光素。Nealson等[2]在1970年通過對海洋發(fā)光細(xì)菌費(fèi)氏弧菌的發(fā)光機(jī)制研究,提出細(xì)菌借助自身分泌的小分子物質(zhì)進(jìn)行彼此之間的信息交流。細(xì)菌是否發(fā)光以及發(fā)光的強(qiáng)弱與熒光素合成酶基因的表達(dá)有關(guān),研究發(fā)現(xiàn)細(xì)菌數(shù)量少時(shí)該基因不表達(dá),而在指數(shù)生長期細(xì)菌增殖達(dá)到一定量后基因才被激活,快速合成熒光素酶繼而發(fā)光,控制熒光素酶的合成是在轉(zhuǎn)錄水平。由于該現(xiàn)象無外界干預(yù),而由細(xì)胞生長自身所致,故首次提出 “自誘導(dǎo)”的概念[2],傳遞信息的信號分子被稱為自誘導(dǎo)物。1981年應(yīng)用高效液相色譜法首次從費(fèi)氏弧菌超亮菌株 (MJ-1)中分離出自誘導(dǎo)物,其化學(xué)成分是N-3-氧己酰基-L-高絲氨酸內(nèi)酯 (3OC6-HSL),人工合成的化合物加入極低亮菌株 (B-61)中能夠誘導(dǎo)其發(fā)光[3]。

基于對發(fā)光細(xì)菌的研究,進(jìn)而擴(kuò)展到其他細(xì)菌?？茖W(xué)家們發(fā)現(xiàn)當(dāng)細(xì)菌產(chǎn)生的信號分子達(dá)到一定數(shù)量且達(dá)閾值時(shí),細(xì)菌可以在感受到自己以及其他細(xì)菌產(chǎn)生的信號后通過調(diào)節(jié)相關(guān)基因表達(dá)來調(diào)整菌群的整體行為[4],例如細(xì)菌能動(dòng)性、毒力和抗生素的產(chǎn)生[5],這種現(xiàn)象被稱為群感效應(yīng),是依賴細(xì)胞密度的細(xì)胞信息交流現(xiàn)象。近年來,隨著科學(xué)研究的進(jìn)展,有研究表明群感效應(yīng)也存在于真菌和病毒中[6-8]。在植物和動(dòng)物病原體中,群感效應(yīng)基因突變體毒力明顯降低[9-11]。

1.2 群感效應(yīng)調(diào)控通路 對費(fèi)氏弧菌發(fā)光機(jī)制的研究揭示了群感效應(yīng)的經(jīng)典通路luxI-lux R 系統(tǒng)[12]。在群感效應(yīng)系統(tǒng)未被激活的情況下,細(xì)胞中的信號分子合成酶可以生成少量的信號分子 (自誘導(dǎo)物),這些信號分子可自由通過細(xì)胞膜,因其濃度低,不與轉(zhuǎn)錄調(diào)控蛋白結(jié)合[13-14]。伴隨著細(xì)菌的增殖,當(dāng)環(huán)境中的信號分子數(shù)量達(dá)到閾值時(shí),會(huì)重返細(xì)胞內(nèi),與轉(zhuǎn)錄調(diào)控蛋白形成轉(zhuǎn)錄調(diào)控蛋白信號分子聚合物,該聚合物進(jìn)一步激活信號分子合成酶基因 (luxI)和轉(zhuǎn)錄調(diào)控蛋白基因 (lux R),從而合成更多的信號分子,形成正反饋循環(huán),同時(shí)激活下游的操縱子和發(fā)光基因的表達(dá)。多數(shù)革蘭陰性桿菌群感效應(yīng)通過luxI-luxR 系統(tǒng)進(jìn)行調(diào)控。其他信號系統(tǒng)還有肽信號系統(tǒng),涉及多數(shù)革蘭陽性球菌;部分革蘭陰性和陽性菌通過AI-2系統(tǒng)進(jìn)行調(diào)控,用于種系間的交流。自誘導(dǎo)物具有種的特異性,迄今為止,已發(fā)現(xiàn)了8種不同化學(xué)結(jié)構(gòu)的自誘導(dǎo)物[12]。

2 銅綠假單胞菌的群感效應(yīng)

2.1 銅綠假單胞菌群感效應(yīng)的調(diào)控通路 銅綠假單胞菌是目前在群感效應(yīng)方面研究最為深入的致病菌,其群感效應(yīng)系統(tǒng)被激活后可以調(diào)節(jié)300多個(gè)毒性因子的基因表達(dá)[15-16]。銅綠假單胞菌的群感效應(yīng)核心通路為lasI-lasR 和rhlI-rhlR 2個(gè)系統(tǒng),這2個(gè)系統(tǒng)的調(diào)節(jié)機(jī)制與發(fā)光細(xì)菌相似,此外還有近期發(fā)現(xiàn)的喹諾酮類信號分子系統(tǒng)。lasI和rhlI基因是信號分子合成酶基因,lasR 和rhlR 基因是轉(zhuǎn)錄調(diào)控蛋白基因。當(dāng)細(xì)菌感知信號分子密度達(dá)到閾值時(shí),轉(zhuǎn)錄調(diào)控蛋白與信號分子結(jié)合形成聚合物,進(jìn)一步激活I(lǐng)基因和R 基因以及下游操縱子基因,形成基因表達(dá)的正反饋及多種毒性因子的表達(dá)。Las系統(tǒng)和Rhl系統(tǒng)的信號分子化學(xué)成分以及調(diào)控的基因有所不同,Las系統(tǒng)的信號分子是3OC12-HSL,主要調(diào)節(jié)堿性蛋白酶、外毒素A、彈性蛋白酶等毒性因子的基因表達(dá)。Rhl系統(tǒng)的信號分子是C4-HSL,主要調(diào)節(jié)鼠李糖脂溶血素、幾丁質(zhì)酶、氰化物、綠膿菌素等次級代謝物的產(chǎn)生[17-19]。Rhl系統(tǒng)受Las系統(tǒng)調(diào)控。

2.2 銅綠假單胞菌群感效應(yīng)與生物被膜 目前研究發(fā)現(xiàn)微生物的社會(huì)行為至少有2種,一種是群感效應(yīng),另一種是生物被膜的形成。生物被膜是指當(dāng)一定數(shù)量的細(xì)菌聚集在一起時(shí),可由細(xì)菌分泌的多糖聚合物形成被膜包繞細(xì)菌,對內(nèi)部細(xì)菌起到保護(hù)作用,以此抵御外來物入侵,使抗菌藥物難以發(fā)揮作用,從而造成感染慢性化。銅綠假單胞菌感染后在體內(nèi)常形成生物被膜,使細(xì)菌難以清除。Davies等[20]用銅綠假單胞菌野生株 (WT)、群感效應(yīng)信號基因突變株 (lasI/rhlI、rhlI、lasI)、lasI突變株+自誘導(dǎo)物對比各組生物被膜形成情況。研究發(fā)現(xiàn)WT 株的生物被膜呈結(jié)構(gòu)松散的蘑菇狀,內(nèi)部菌落之間形成水通道,可運(yùn)輸氧氣、代謝產(chǎn)物以及營養(yǎng)物質(zhì)。而lasI突變株形成薄的板層樣生物被膜,細(xì)胞間連接致密,加入自誘導(dǎo)物 (3OC12-HSL)后恢復(fù)WT 株形態(tài)。黏附于固體表面是形成生物被膜的重要環(huán)節(jié)。該研究發(fā)現(xiàn)加入洗滌劑十二烷基硫酸鈉后,lasI突變株的生物被膜5 min便脫離玻璃表面,而WT 株和lasI突變株加入自誘導(dǎo)物后的生物被膜19 h仍黏附。以上結(jié)果說明群感效應(yīng)系統(tǒng)影響生物被膜的形成[20],是生物被膜上游調(diào)控系統(tǒng)之一。

3 大環(huán)內(nèi)酯類藥物對銅綠假單胞菌群感效應(yīng)的作用及臨床治療研究

3.1 大環(huán)內(nèi)酯類藥物抑制銅綠假單胞菌群感效應(yīng) Tateda等[21]研究發(fā)現(xiàn)阿奇霉素可抑制銅綠假單胞菌群感效應(yīng)系統(tǒng)中l(wèi)asR/rhlR 基因的轉(zhuǎn)錄,加入自誘導(dǎo)物后部分恢復(fù);同時(shí)抑制lasI/rhlI的基因表達(dá),使自誘導(dǎo)物3OC12-HSL 和C4-HSL生成減少;導(dǎo)致毒性因子彈性蛋白酶減少,加入自誘導(dǎo)物后也可部分恢復(fù)。大環(huán)內(nèi)酯類藥物通過抑制銅綠假單胞菌自誘導(dǎo)物的產(chǎn)生,阻斷了群感效應(yīng),進(jìn)而抑制了生物被膜的形成及毒性因子的釋放[22]。大環(huán)內(nèi)酯類藥物具有基本的內(nèi)酯環(huán)結(jié)構(gòu),按其內(nèi)酯結(jié)構(gòu)母核上含碳數(shù)目不同,可分為14、15和16元環(huán)大環(huán)內(nèi)酯。研究發(fā)現(xiàn)14元環(huán)大環(huán)內(nèi)酯 (紅霉素、羅紅霉素)、15元環(huán)大環(huán)內(nèi)酯 (阿奇霉素)對銅綠假單胞菌的生長具有抑制作用,而16元環(huán)大環(huán)內(nèi)酯(交沙霉素、竹桃霉素)沒有抑制作用[23]。

3.2 大環(huán)內(nèi)酯類藥物對結(jié)構(gòu)性肺病治療的臨床研究 結(jié)構(gòu)性肺病是指導(dǎo)致肺部結(jié)構(gòu)不可逆改變的肺疾病,如支氣管擴(kuò)張癥、囊性纖維化 (cystic fibrosis,CF)、COPD、慢性肺膿腫、導(dǎo)致肺結(jié)構(gòu)改變的肺結(jié)核等。銅綠假單胞菌是伴有結(jié)構(gòu)性肺病患者肺部感染的常見致病菌,常常導(dǎo)致細(xì)菌難以清除、感染慢性化,反復(fù)急性感染誘發(fā)細(xì)菌耐藥性增強(qiáng),使臨床治療困難。銅綠假單胞菌生物被膜的形成以及毒性因子的釋放關(guān)系到細(xì)菌的耐藥性和感染的嚴(yán)重性,當(dāng)銅綠假單胞菌發(fā)展成多重耐藥菌、泛耐藥菌或全耐藥菌時(shí),臨床可選擇的抗菌藥物有限甚至無可選擇。有多項(xiàng)臨床研究評估了低劑量的大環(huán)內(nèi)脂類藥物對結(jié)構(gòu)性肺病的臨床療效。新西蘭EMBRACE研究是評價(jià)阿奇霉素預(yù)防非CF 支氣管擴(kuò)張癥患者急性加重的隨機(jī)雙盲安慰劑對照研究,入選標(biāo)準(zhǔn)為既往1年內(nèi)至少1次急性加重需要抗菌藥物治療的支氣管擴(kuò)張癥患者,應(yīng)用阿奇霉素500 mg (3次/周)口服6個(gè)月。結(jié)果顯示,阿奇霉素組急性加重次數(shù)為0.59次/人,而安慰劑組為1.57次/人 (P ＜0.000 1),作者提出阿奇霉素是預(yù)防支氣管擴(kuò)張癥急性加重的新的選擇[24]。美國23個(gè)中心針對CF銅綠假單胞菌感染的隨機(jī)對照研究顯示阿奇霉素治療168 d,第1秒用力呼氣容積明顯改善,未出現(xiàn)急性加重者在阿奇霉素組明顯增多[25]。在BLESS研究中,Burr等[26]通過嚴(yán)格篩選進(jìn)一步對臨床分離出的銅綠假單胞菌進(jìn)行了研究,入選病例為觀察結(jié)束時(shí)患者有痰,銅綠假單胞菌培養(yǎng)陽性,菌株管家基因m RNA 充分表達(dá)。安慰劑組15例,紅霉素組11例。結(jié)果顯示,與安慰劑組相比,治療組分離的銅綠假單胞菌群感效應(yīng)基因LasR、Pqs A 表達(dá)水平降低,從臨床角度驗(yàn)證了大環(huán)內(nèi)酯類藥物可抑制群感效應(yīng)。美國17個(gè)醫(yī)療中心前瞻平行安慰劑對照研究,觀察口服阿奇霉素250 mg 1年預(yù)防COPD 急性加重的作用,結(jié)果顯示阿奇霉素組初次加重的中位時(shí)間為266 d,安慰劑組為174 d (P ＜0.001);與安慰劑組相比,阿奇霉素組急性加重頻率減少 (P =0.01),生活質(zhì)量評分改善 (P =0.004)[27]。Fan等[28]對非CF患者長期應(yīng)用大環(huán)內(nèi)酯類藥物的療效進(jìn)行了薈萃分析,結(jié)果顯示大環(huán)內(nèi)酯組急性加重次數(shù)減少、肺功能改善、生活質(zhì)量提高,但腹瀉癥狀增加,對大環(huán)內(nèi)酯耐藥的流感嗜血桿菌、金黃色葡萄球菌、肺炎鏈球菌較安慰劑組增加 (P ＜0.001)。

3.3 臨床治療指南或共識 2017年歐洲成人支氣管擴(kuò)張癥治療指南中推薦每年急性加重≥3次患者可應(yīng)用長期抗菌藥物治療 (≥3個(gè)月),有慢性銅綠假單胞菌感染者推薦吸入抗菌藥物治療如多黏菌素等,而對吸入藥物有禁忌、不耐受、不可行者,推薦大環(huán)內(nèi)酯類藥物 (阿奇霉素、紅霉素),若吸入抗菌藥物仍頻繁加重者,推薦加用大環(huán)內(nèi)酯類藥物或替換原吸入藥物,同時(shí)應(yīng)關(guān)注其腹瀉及耐藥等不良反應(yīng)[29]。2019版COPD 全球倡議提出阿奇霉素或紅霉素長期治療1年以上可減少COPD 急性加重,但阿奇霉素的治療與細(xì)菌耐藥及聽力障礙有關(guān)[30]。

綜上所述,銅綠假單胞菌群感效應(yīng)機(jī)制在其感染過程中影響著毒力及耐藥性,大環(huán)內(nèi)酯類藥物可抑制群感效應(yīng)系統(tǒng),其非抗菌作用在銅綠假單胞菌慢性感染的結(jié)構(gòu)性肺病治療中發(fā)揮一定作用。在應(yīng)用大環(huán)內(nèi)酯類藥物時(shí)應(yīng)掌握其適應(yīng)證,關(guān)注藥物不良反應(yīng)。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突