miRNA-548a-5p在預測特發(fā)性肺動脈高壓患者血流動力學惡化的作用

吳粵 孫媛媛 王嵐 趙勤華 宮素崗 袁平 劉錦銘

1同濟大學附屬上海市肺科醫(yī)院檢驗科200433；2同濟大學附屬上海市肺科醫(yī)院肺循環(huán)科200433

特發(fā)性肺動脈高壓 (idiopathic pulmonary arterial hypertension,IPAH)是由多種因素引起肺小血管重構(gòu),肺循環(huán)阻力進行性增高,右心負荷增加進而導致右心衰竭致患者死亡的惡性心血管疾病[1]。確診IPAH 的金標準是右心導管檢查(right heart catheterization,RHC),其多項血流動力學指標如肺血管阻力 (pulmonary vascular resistance,PVR)是評價預后的重要因素[2]。近年來許多研究表明微小 RNA (microRNA,miRNA)在IPAH 疾病發(fā)生發(fā)展過程中起著重要作用[3]。有研究發(fā)現(xiàn),miRNA-548 或其他亞型可以參與多種疾病的免疫反應[4-5],但miRNA-548a-5p在IPAH 的研究尚未見報道。本研究通過篩選出IPAH 患者和健康人群的血漿中差異表達的miRNA,觀察其表達量和患者的血流動力學參數(shù)相關性,探討血漿miRNA 是否可以作為預測患者血流動力學指標惡化的生物標志物。

1 對象與方法

1.1 研究對象 本研究回顧性地納入了從2010年5月至2017年6 月入住上海市肺科醫(yī)院的IPAH患者和健康對照人群各12例。納入標準：所有患者均經(jīng)RHC明確診斷。入選標準根據(jù)文獻[6]：靜息狀態(tài)下,平均肺動脈壓(mean pulmonary artery pressure,mPAP)≥25 mm Hg (1 mm Hg=0.133 kpa),肺小動脈楔壓 (pulmonary arterial wedge pressure,PAWP)≤15 mm Hg。排除標準：排除其他類型的肺動脈高壓患者,如慢性血栓性肺動脈高壓、左心疾病及呼吸系統(tǒng)疾病引起的肺動脈高壓;排除合并有其他肺部疾病的患者;排除患有影響激素代謝的慢性或急性疾病的患者;排除正在使用或既往使用過激素藥物及影響激素的藥物的患者;排除神經(jīng)精神疾病的患者。對照組人群是疑似IPAH 患者,經(jīng)RHC 明確排除IPAH,且無其他慢性疾病的相對健康的人群。

該研究經(jīng)上海市肺科醫(yī)院倫理委員會批準(K19-069Y)。所有參與者均簽署知情同意書。

1.2 方法

1.2.1 一般臨床資料 記錄IPAH 患者和對照組人群的年齡、身高、體質(zhì)量,并計算體質(zhì)量指數(shù)(body mass index,BMI),比較2組基線資料的差異。同時收集患者的相關臨床參數(shù),包括：世界衛(wèi)生組織心功能分級 (World Health Organization functional class,WHO-FC)、6 分鐘步行距離、氨基末端腦利鈉肽前體等。

1.2.2 主要檢測參數(shù) 右心導管參數(shù)包括平均右心房壓 (mean right atrial pressure,m RAP)、mPAP、PAWP、 心輸出量 (cardiac output,CO)、 肺 血 管 阻 力 (pulmonary vascular resistance,PVR)等。

1.2.3 miRNA 提取及芯片檢測 抽取每例患者外周抗凝血約4 ml,以3 000 r/min (離心半徑10 cm)離心5 min分離得血漿標本。按照Trizol試劑說明書提取總RNA,并用miRNeasy提取試劑盒 (QIAGEN)提取miRNA。應用NanoDrop 1000檢測RNA 純度及質(zhì)量。采用丹麥EXiqon公司生產(chǎn)的18.0版miRCURYTMLNA 芯片。芯片篩選2 組間差異表達的 miRNA 分子,并用Targetscan、Miranda和Pictar等靶基因軟件預測其靶基因。

1.3 統(tǒng)計學分析 采用SPSS 20.0軟件進行數(shù)據(jù)分析。符合正態(tài)分布的連續(xù)變量用±s 表示,組間比較采用獨立樣本t檢驗;分類變量采用構(gòu)成比表示,組間比較采用χ2檢驗。相關性分析采用Pearson相關檢驗。采用線性回歸及多重線性回歸分析預測因子。P ＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 一般資料 2組間一般情況差異無統(tǒng)計學意義?；颊叩腤HO-FC、6分鐘步行距離及血流動力學參數(shù)m RAP、mPAP、PAWP、PVR、CO 等見表1。

2.2 miRNA 檢測結(jié)果 IPAH 患者與對照組血漿中miRNA 芯片檢測結(jié)果顯示,滿足Fold change≥2,且P ＜0.05條件的差異miRNA 有797個上調(diào),有42個下調(diào),其中miRNA-548a-5p表達差異最顯著,因此選擇miRNA-548a-5p 進行后續(xù)的研究。IPAH 組miRNA-548a-5p表達明顯高于對照組(t=3.038,P ＜0.05);IPAH 組男性患者的miRNA-548a-5p表達水平高于對照組男性 (t=2.466,P ＜0.05);IPAH 組 女 性 患 者miRNA-548a-5p表達水平與對照組女性比較差異無統(tǒng)計學意義。見表1。

表1 2組患者的一般資料比較

2.3 miRNA-548a-5p表達與血流動力學參數(shù)的相關性 在IPAH 患者的miRNA-548a-5p表達量和血流動力學參數(shù)的相關性分析中,miRNA-548a-5p表達量分別與m RAP、m PAP、PAWP和PVR 呈輕到中度正相關 (r 值分別為0.477、0.616、0.607、0.517,P 值均＜0.05),但是與CO 及心指數(shù)未見顯著相關性。見表2。

表2 IPAH 患者miRNA-548a-5p與血流動力學參數(shù)的相關性

2.4 miRNA-548a-5p對血流動力學惡化的預測情況 將miRNA-548a-5p 表達量作為自變量,和miRNA-548a-5p表達量相關的血流動力學mPAP、PVR 分別作為因變量,采用線性回歸及逐步多重線性回歸分析,結(jié)果發(fā)現(xiàn)在所有IPAH 患者中,校正了年齡、性別、體質(zhì)量指數(shù)和WHO-FC 后,miRNA-548a-5p表達升高可作為mPAP、PVR 升高的獨立預測因子。見表3、4。

表3 單因素線性回歸分析miRNA-548a-5p預測血流動力學升高的情況

表4 多重線性回歸分析miRNA-548a-5p預測血流動力學升高的情況

2.5 miRNA-548a-5p 的受試者工作特征(receiver operating characteristic,ROC)曲線分析結(jié)果 為更進一步探討差異化表達miRNA-548a-5p的意義,本文采用了ROC 曲線分析方法測試了miRNA-548a-5p對IPAH 組和對照組的鑒別效能。結(jié)果得出,ROC 曲線下面積為0.799。通過最佳臨界值分析得出,miRNA-548a-5p的敏感度為91.7%,特異度為66.7%。臨界值為10.5 (表5)。血漿miRNA-548a-5p高表達組血流動力學相關參數(shù)m RAP、mPAP、PAWP 和PVR均高于miRNA-548a-5p 低表達組 (t 值分別為1.969、3.010、1.861、2.250,P 值均＜0.05)(表6)。

3 討論

miRNA 作為近年來較為成熟的分子標志物,其表達會受到人體各種生理病理變化的影響。本研究證實,IPAH 患者血漿中miRNA-548a-5p 的表達顯著升高,并首次證明其表達量還可以獨立預測m PAP和PVR 的升高。

最近研究表明,患者血漿中多項miRNA 表達對肺動脈高壓的診斷和預后分析都有很大的價值[7]。Kheyfets等[8]通過檢測14例兒童肺動脈高壓患者血漿中miRNA 表達的變化,之后通過PCR技術水平驗證,找到了32個循環(huán)的miRNA 和肺血管功能相關參數(shù)有相關性,這些miRNA 是預測兒童肺動脈高壓患者的血管功能標志物。也有學者證明miRNA-150水平是獨立于年齡、6分鐘步行距離、病程、紅細胞分布寬度等多項指標的肺動脈高壓預后標志物[9]。Jin等[10]發(fā)現(xiàn)在左心疾病相關肺動脈高壓人群中,miRNA-206和肺動脈收縮壓呈顯著相關性,說明其可以預測此部分人群的疾病嚴重程度。Sarrion等[11]選取了12例患者和10名健康者進行對照,發(fā)現(xiàn)了61 個差異顯著的miRNA,尤其是 miRNA-23a,作者不僅發(fā)現(xiàn)miRNA-23a和肺功能具有相關性,還通過沉默miRNA-23a發(fā)現(xiàn)促進了下游PGC1α的表達。

本 研 究 主 要 發(fā) 現(xiàn),IPAH 患 者 中miRNA-548a-5p表達明顯上調(diào),這提示血漿中miRNA-548a-5p可能參與了患者的疾病進展,進而導致患者和健康人群血漿中miRNA-548a-5p表達差異顯著。目前國內(nèi)外關于miRNA-548a-5p在肺動脈高壓患者中表達水平罕有報道,筆者只是觀察到miRNA-548a-5p在IPAH 患者血漿中表達明顯上調(diào),其在肺組織和肺動脈平滑肌細胞中的表達以及對肺動脈高壓疾病進展中的作用機制仍需后續(xù)深入實驗加以明確。

影響IPAH 患者預后的因素很多,PVR 是反映IPAH 患者疾病嚴重程度的重要指標,受PAWP、mPAP及CO 的影響 [PVR= (m PAPPAWP)/CO][12],PVR 升高會限制右心室射血入肺動脈,從而影響肺血流的灌注和全身血液的供應。本研究的線性回歸模型提示miRNA-548a-5p的表達量是預測PVR 和m PAP 升高的獨立指標,ROC曲線分析表明,ROC 曲線下面積為0.799,通過最佳臨界值分析得出,miRNA-548a-5p 的敏感度 為91.7%, 特 異 度 為66.7%, 說 明miRNA-548a-5p在診斷IPAH 可能具有較高的敏感性和特異性。

綜上所述,本研究結(jié)果提示IPAH 患者較對照人群的miRNA-548a-5p表達顯著升高,并顯示miRNA-548a-5p是預測患者mPAP 和PVR 升高的獨立預測因子,可以為臨床診斷和判斷IPAH患者疾病惡性程度提供參考。

表5 多重線性回歸分析miRNA-548a-5p預測血流動力學升高的情況

表6 按照miRNA-548a-5p的臨界值分組后2組血流動力學差異情況 (±s)

表6 按照miRNA-548a-5p的臨界值分組后2組血流動力學差異情況 (±s)

注：1 mm Hg=0.133 k Pa

組別例數(shù)平均右心房壓(mm Hg)平均肺動脈壓(mm Hg)肺小動脈楔壓(mm Hg)肺血管阻力(Wood units)心輸出量(L/min)心指數(shù)(L·min-1·m-2)miR-548a-5P ＜10.5 8 1.6±1.1 15.9±9.9 5.3±1.8 2.6±2.4 6.6±2.5 3.9±1.5 miR-548a-5p≥10.5 16 5.3±5.1 52.3±33.1 8.0±3.9 10.6±9.1 5.2±1.9 3.2±1.2 t 值1.969 3.010 1.861 2.250-1.508-1.287 P 值0.018 0.001 0.048 0.016 0.146 0.212

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突