應(yīng)用順鉑聯(lián)合長春瑞濱后常規(guī)二維超聲、ARFI以及病理對照綜合評價對家兔肝損害的實驗研究

吳珊珊 李鵬 栗雯霏 龍小雪 栗建輝

1河北大學(xué)附屬醫(yī)院超聲科,保定071000；2河北省人民醫(yī)院超聲科,石家莊050051

據(jù)2018年的統(tǒng)計數(shù)據(jù)顯示,肺癌是我國男性發(fā)病率和病死率均為第一位的癌癥,也是我國女性發(fā)病率第二、病死率第一的癌癥[1],其中非小細胞肺癌 (non-small cell lung cancer,NSCLC)占多數(shù)。手術(shù)治療以及術(shù)后化療已成為肺癌的主要治療手段,但有部分患者經(jīng)過幾個化療周期后在超聲復(fù)檢時出現(xiàn)肝臟形態(tài)飽滿,實質(zhì)回聲致密增強,肝后部不同程度回聲衰減,類似脂肪肝的超聲圖像表現(xiàn),有學(xué)者認為是化療性脂肪肝[2],而脂肪肝病變嚴(yán)重者可影響肝臟功能,可發(fā)展成為脂肪性肝炎、肝纖維化,繼而肝硬化,甚至導(dǎo)致整個化療方案的失敗。為了探究這一現(xiàn)象的原因,盡早干預(yù),本研究根據(jù)NSCLC常用化療藥方案進行了兔肝動物實驗,并聯(lián)合多種數(shù)據(jù)對比,探討化療后肝臟損害的情況,尤其是對脂肪變性的病理改變進行評價,現(xiàn)報道如下。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 30只健康雄性新西蘭白兔 [北京興隆實驗動物養(yǎng)殖場提供,生產(chǎn)許可證號SCXK(京)2016-0003],體質(zhì)量 (2.1±0.10)kg,應(yīng)用簡單隨機法將兔分為A、B、C組,每組10只。在恒溫飼養(yǎng)室[溫度 (20±3)℃,濕度 (55±5)%]單籠喂養(yǎng)1周,以適應(yīng)實驗環(huán)境。本研究符合《赫爾辛基宣言》的原則。

1.2 實驗方法 A 組給予普通飼料+淀粉,B 組給予化療藥(順鉑1.5 mg/kg+長春瑞濱2.2 mg/kg)及普通飼料喂養(yǎng),C 組給予化療藥 (順鉑1.5 mg/kg+長春瑞濱2.2 mg/kg)及高脂飼料喂養(yǎng)。B組和C組家兔每3周兔耳緣靜脈給予化療藥1次,連續(xù)6個周期。每組兔均于實驗前、實驗結(jié)束時抽耳緣靜脈血查血清總膽固醇 (total cholesterol,TC)、甘油三酯 (triglyceride,TG)、丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶 (alanine aminotransferase,ALT)、 天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶 (aspartate aminotransferase,AST),同時行肝臟常規(guī)超聲檢查及肝實質(zhì)聲輻射力脈沖成像 (acoustic radiation force impulse imaging,ARFI)測定,即剪切波速度值測量。實驗結(jié)束時腹腔注射氨基甲酸乙酯處死家兔,剖腹取肝臟,福爾馬林溶液固定,由2名病理科高年資主任醫(yī)師觀察切片,觀察結(jié)果與肝臟聲像圖進行對照研究。

1.3 超聲檢查 應(yīng)用德國Siemens S2000彩超儀,選擇高頻 (4.0～9.0 MHz)線陣探頭掃查,探查深度5.0 cm。實驗兔腹部去毛后使其仰臥,首先觀察兔肝的大小、形態(tài)、包膜光滑度、內(nèi)部實質(zhì)回聲情況、肝內(nèi)外管道走行、管徑變化及管壁回聲強度等情況,然后啟動ARFI鈕,在右肋間門脈長軸切面距體表1.5 cm 處,避開肝內(nèi)管道系統(tǒng)測量肝實質(zhì)的剪切波速度值。隨機取3個等深點測量,每個等深點測3次,取9個數(shù)值平均后進行統(tǒng)計學(xué)處理。

1.4 統(tǒng)計學(xué)分析 應(yīng)用SPSS 22.0統(tǒng)計軟件處理數(shù)據(jù)。計量資料以±s 表示,采用配對t 檢驗、F檢驗和SNK-q 檢驗進行比較。P ＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 用藥前后肝功能比較 A 組用藥前后AST和ALT 差異均無統(tǒng)計學(xué)意義,B組和C 組用藥后AST 和ALT 均較用藥前升高 (P 值均＜0.05);用藥后B 組和C 組AST 和ALT 均高于A 組,C組AST 和ALT 高于B 組,差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(F =1 204.517、5 695.501,P 值均＜0.001)。見表1。

2.2 用藥前后血脂比較 A 組和B 組用藥前后TC、TG 差異均無統(tǒng)計學(xué)意義,C 組用藥后TC、TG 均較用藥前升高(t=441.536、10.506,P 值均＜0.05),用藥后C組TC、TG 均高于A 組和B組(F =122 890.902,75.943,P 值均＜0.001)。見表2。

2.3 超聲表現(xiàn) A 組應(yīng)用普通飼料及淀粉后超聲未見異常;B組應(yīng)用化療藥后肝臟常規(guī)超聲顯示肝包膜稍增厚,體積無明顯變化,肝實質(zhì)回聲不同程度增強,回聲不均勻,膽管壁及門脈壁回聲增強(圖1);C 組肝體積稍大,內(nèi)部回聲情況同B 組,還可見肝實質(zhì)回聲稍致密增強,類似輕度脂肪肝的表現(xiàn)(圖2)。A 組用藥前后ARFI測定值差異無統(tǒng)計學(xué)意義,B組和C組用藥后ARFI測定值均較用藥前增加 (t =18.30、23.92,P 值均＜0.001),用藥后B 組和C 組ARFI測定值均高于A 組,C 組 ARFI 測定值高于B 組 (F =159.103,P ＜0.001),見表3。

表1 3組兔用藥前后天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶和丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶比較 (±s,U/L)

表1 3組兔用藥前后天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶和丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶比較 (±s,U/L)

注：A組為對照組;B組為化療組;C組為化療+高脂飼料組;與A 組比較,a P ＜0.05;與B組比較,b P ＜0.05;與用藥前比較,c P ＜0.001

組別只數(shù)天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶用藥前用藥后用藥前用藥后A 組10 26.88±4.19 29.38±2.87 31.83±1.42 30.92±1.47 B組10 28.75±4.20 69.69±3.39ac 33.81±4.81 71.12±1.07ac C組10 26.91±2.45 101.35±3.56abc 29.49±1.28 94.21±2.88abc F 值0.833 1 204.517 0.348 5 695.501 P 值0.446＜0.001 0.709＜0.001

表2 3組兔用藥前后總膽固醇和甘油三酯比較 (±s,U/L)

表2 3組兔用藥前后總膽固醇和甘油三酯比較 (±s,U/L)

注：A組為對照組;B組為化療組;C組為化療+高脂飼料組;與A 組比較,a P ＜0.05;與B組比較,b P ＜0.05;與用藥前比較,c P ＜0.001

組別只數(shù)總膽固醇甘油三酯用藥前用藥后用藥前用藥后A 組10 1.69±0.33 1.90±0.45 1.33±0.43 1.42±0.32 B組10 1.97±0.25 2.00±0.37 1.31±0.33 1.30±0.32 C組10 1.65±0.34 99.26±0.65abc 1.36±0.29 3.07±0.43abc F 值3.113 122 890.902 0.057 75.943 P 值0.061＜0.001 0.945＜0.001

2.4 用藥后病理檢查結(jié)果 A 組用藥前后無明顯異常。B組可見肝細胞水腫,輕微散在脂肪變性,匯管區(qū)炎細胞浸潤,部分炎細胞浸潤血管壁和膽管壁,少許淤血及淤膽,點狀壞死及少許纖維化(圖3)。C組除有B 組病理損害外,還顯示體積稍大,出現(xiàn)較多大泡型和小泡型脂肪變性及少許輕度再生結(jié)節(jié)(圖4)。

圖1 化療組兔超聲顯示肝包膜稍增厚,肝實質(zhì)回聲不同程度增強,回聲不均勻,膽管壁及門脈壁回聲增強

圖2 化療+高脂飼料組兔超聲顯示肝體積稍增大,實質(zhì)回聲增強,不均勻,略致密,膽管壁及門脈壁回聲增強

表3 3組兔用藥前后聲輻射力脈沖成像測定值比較 (±s,m/s)

表3 3組兔用藥前后聲輻射力脈沖成像測定值比較 (±s,m/s)

注：A 組為對照組;B 組為化療組;C 組為化療+高脂飼料組;與A 組比較,a P ＜0.05;與B 組比較,b P ＜0.05;與用藥前比較,c P ＜0.001

組別只數(shù)用藥前用藥后A 組10 0.93±0.03 0.94±0.58 B組10 0.95±0.03 1.20±0.06ac C組10 0.95±0.04 1.50±0.09abc F 值1.867 159.103 P 值0.174＜0.001

3 討論

肺癌是目前全球發(fā)病率和病死率最高的癌癥之一[3],其中NSCLC (鱗癌、腺癌及大細胞癌)占80%～85%,其早期癥狀無明顯特異性,多數(shù)患者在就診時已處于中晚期,臨床治療以手術(shù)+術(shù)后輔助化療或化療為主。多年來,專家指南均推薦含鉑兩藥為治療NSCLC的一線化療方案,其中順鉑療效肯定,長春瑞濱與順鉑具有協(xié)同作用,二者合用成為治療NSCLC 最常見且療效確切的經(jīng)典方案,在臨床上應(yīng)用廣泛[4]。本實驗用順鉑聯(lián)合長春瑞濱給家兔進行6個周期注射,觀察化療后造成肝損害的病理所見,尤其注意脂肪性肝損害的情況。臨床上經(jīng)常觀察到,有一部分腫瘤患者應(yīng)用幾個周期的化療藥后在超聲檢查時出現(xiàn)肝實質(zhì)回聲增強、不均勻、后方回聲衰減等類似脂肪肝的超聲表現(xiàn),這種表現(xiàn)是否由于化療藥引起,故做本實驗加以證實。

圖3 化療組兔6個月后肝病理表現(xiàn) HE ×400 A：肝小葉部損害;B：肝匯管區(qū)損害

圖4 化療+高脂飼料組兔6個月后肝病理表現(xiàn) HE A：肝脂肪變性 ×200;B：肝再生結(jié)節(jié)及脂肪變性 ×100

大多數(shù)化療藥除了引起胃腸道反應(yīng)、骨髓抑制、腎毒性等不良反應(yīng)外,均可引起肝臟損害。這主要是因為化療藥一般都在肝臟代謝,除了藥物本身成分的毒性損害外,藥物代謝產(chǎn)物也可引起肝臟損害。多名中外學(xué)者應(yīng)用順鉑對小鼠(大鼠)所做的實驗顯示,肝轉(zhuǎn)氨酶有不同程度升高,超氧化物歧化酶及谷胱甘肽過氧化物酶降低,丙二醛升高,肝組織出現(xiàn)肝細胞水腫、空化,中央靜脈擴張、淤血、靜脈周圍竇擴張,點片狀炎性細胞浸潤和壞死等,同時給予丹參或牛樟芝溶液灌胃可減輕順鉑對肝臟的損害[5-7]。葉冬梅等[8]將長春瑞濱注射于小鼠尾靜脈內(nèi),給藥第3天即出現(xiàn)肝細胞損害,50%為中到大量脂肪變性,20%出現(xiàn)點狀肝細胞壞死,壞死灶周圍有炎性細胞浸潤,12.5%出現(xiàn)瘀膽,AST、堿性磷酸酶、直接膽紅素較對照組明顯升高;肝組織丙二醛較對照組明顯升高,還原型谷胱甘肽則顯著降低,表明肝損害與氧化應(yīng)激有關(guān)。張彩霞等[9]應(yīng)用長春瑞濱對Beagle犬進行了肝、腎毒性實驗,其中AST、ALT、總膽紅素、總蛋白及白蛋白有劑量依賴性降低,肝組織有較多脂肪空泡及匯管區(qū)輕度炎細胞浸潤。本研究B組、C組肝功能指標(biāo)有不同程度升高,表明化療藥產(chǎn)生了一定的肝損害;C組TC和TG 有明顯升高,表明引起了血脂異常,可能是高脂飼料引起高血脂造成的。有學(xué)者研究顯示,化療藥可引起血脂增高,且血脂增高的患者更容易造成肝功能損害[10]。本研究表明B 組雖然沒有引起血脂增高,但病理上造成輕微散在脂肪變性,而C 組不但血脂增高,且肝功指標(biāo)還高于B 組,病理上出現(xiàn)了更為高級別損害的再生結(jié)節(jié),提示血脂增高容易引起肝功能異?；蚣又馗喂δ軗p害。上述肝損害的機制可能與下述原因有關(guān)：(1)血脂增高后肝臟不能及時轉(zhuǎn)運脂肪組織,使其過多沉積于肝臟造成脂肪肝,進而影響肝功能,肝細胞受損,導(dǎo)致結(jié)締組織增生和肝纖維化,甚至硬化[11]。 (2)大多數(shù)化療藥具有細胞毒性和免疫抑制性,可直接引起肝損害[12]。脂質(zhì)代謝異?；颊叱０橛新愿螕p害,導(dǎo)致藥物代謝能力下降,藥物本身及代謝產(chǎn)物進一步加重肝損害。(3)促炎細胞因子加劇肝損害?；熀竽[瘤可釋放腫瘤壞死因子,可引起肝損害甚至肝細胞壞死[13]。(4)氧化應(yīng)激反應(yīng)。過多的游離脂肪酸引起肝細胞線粒體內(nèi)氧化過度,產(chǎn)生大量活性氧,解偶聯(lián)蛋白2代償性增多,以便減少活性氧的產(chǎn)生,結(jié)果三磷酸腺苷大量消耗,導(dǎo)致肝細胞凋亡或壞死[14]。肝細胞壞死產(chǎn)生大量炎性因子,進而又促進自由基產(chǎn)生過多,造成肝細胞損害。

本實驗超聲方面B 組應(yīng)用化療藥后肝臟常規(guī)超聲顯示肝包膜稍增厚,肝實質(zhì)回聲不同程度增強,回聲不均勻,膽管壁及門脈壁回聲增強,這可能是由于肝產(chǎn)生病理損害后,細胞水腫,脂肪變性,匯管區(qū)、血管壁及膽管壁炎細胞浸潤,點片狀壞死及局限性纖維化,甚至再生結(jié)節(jié)出現(xiàn),致使肝組織結(jié)構(gòu)紊亂,產(chǎn)生雜亂的超聲界面,從而出現(xiàn)上述異常超聲表現(xiàn)。而C 組除了化療藥,還增加了高脂飼料,在B 組病理基礎(chǔ)上出現(xiàn)較多大泡型及小泡型脂肪變性,使肝組織脂肪浸潤較多,從而造成肝體積稍大;內(nèi)部回聲除了B 組的表現(xiàn)外,還可見肝實質(zhì)回聲稍致密增強,類似輕度脂肪肝的表現(xiàn)。

ARFI是新近研究出來的一種評價彈性 (硬度)的非侵入性檢查技術(shù),探頭通過瞬時聲輻射力發(fā)出短脈沖并產(chǎn)生剪切波,使被檢測部位產(chǎn)生位移,并得到一個定量的剪切波回波,通過這個定量剪切波速度的測量就可確定被檢測部位組織結(jié)構(gòu)的彈性(硬度),硬度越大則剪切波速度越快,硬度越小則相反[15]。ARFI 是評價實質(zhì)組織器官病變[16]及非酒精性脂肪肝纖維化損害較為準(zhǔn)確的非侵入技術(shù)之一[17]。本研究B組、C組用藥后ARFI測定值增高也是由于肝臟受損后 (尤其是纖維化、再生結(jié)節(jié)形成),肝臟組織結(jié)構(gòu)失去原來柔軟均質(zhì)的特性,致使肝實質(zhì)輕度變硬,導(dǎo)致剪切波速度增快。

臨床上化療后超聲復(fù)檢時經(jīng)常發(fā)現(xiàn)患者肝臟類似脂肪肝樣改變,而脂肪肝嚴(yán)重可導(dǎo)致脂肪性肝炎,甚至纖維化、硬化,使整個化療失敗。有學(xué)者認為化療藥可直接作用于肝細胞,使其壞死,促使細胞色素P450酶的激活,激活后的代謝產(chǎn)物可充當(dāng)氧化劑長時間作用于肝臟,使其脂肪代謝能力下降,最終造成化療性脂肪肝[18]。目前,臨床上診斷脂肪肝的“金標(biāo)準(zhǔn)”依然是肝穿刺活檢的病理學(xué)診斷[19],但因其具有創(chuàng)傷性,不能作為常規(guī)方法。臨床上診斷脂肪肝的首選無創(chuàng)方法是超聲,其對脂肪變性的診斷效果具有60% ～94% 敏感度和66%～97%特異度,但對于脂肪變程度＜30%的病例則難以檢出[20]。此外還有血清指標(biāo) (包括ALT、AST、TC及TG 等)、CT、MRI等檢查方法,但CT 有放射性損害,MRI價格昂貴,不適于臨床首選。

綜上所述,本動物實驗應(yīng)用順鉑聯(lián)合長春瑞濱6個周期后,化療藥對肝臟可以造成類似肝炎的不同程度損害,但B 組在病理上肝臟脂肪變并不明顯,在超聲上未顯示出脂肪肝的聲像圖表現(xiàn),而C組病理上除了有B 組的損害外,還出現(xiàn)了較多大泡型及小泡型脂肪變性,在超聲上也呈現(xiàn)了輕度脂肪肝的聲像圖表現(xiàn)。據(jù)此認為,臨床上化療患者出現(xiàn)的脂肪肝超聲圖像改變很大程度上可能是由于營養(yǎng)過剩所致,因在化療過程中或之后,患者常遵醫(yī)囑加強飲食營養(yǎng),進食較多高能量食物,而造成脂質(zhì)在肝組織內(nèi)沉積,最終形成脂肪肝。ARFI對于化療后肝損害評價有一定價值,值得在臨床上推廣。

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