垂盆草配方顆粒的HPLC 指紋圖譜研究

★ 董玉娟 周敏 胥愛麗 李素梅

（1.廣東省第二中醫(yī)院 廣州 510095；2.廣東省中醫(yī)藥工程技術(shù)研究院 廣州 510095）

垂盆草配方顆粒是采用符合質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的垂盆草飲片經(jīng)一系列的提取、濃縮、干燥、制粒等制備方法制粒而成，具有清熱解毒、利濕退黃功效。目前對垂盆草藥材、配方顆粒及含垂盆草藥材復(fù)方制劑的質(zhì)量控制研究大多采用薄層色譜法鑒別，高效液相色譜法或紫外吸收法測定含量［1-10］等，尚未見垂盆草配方顆粒指紋圖譜相關(guān)研究，且未見垂盆草配方顆粒與其飲片之間的關(guān)聯(lián)性研究。本實驗采用高效液相色譜法（HPLC）建立了垂盆草配方顆粒HPLC 指紋圖譜的分析方法，研究不同批次的樣品，并比較了配方顆粒與飲片之間的差異。本研究為垂盆草配方顆粒質(zhì)量的整體有效控制提供了科學(xué)方法與實驗依據(jù)。

1 儀器與試藥

1.1 儀器Waters e2695-2998型高效液相色譜儀，Empower 2 數(shù)據(jù)處理軟件系統(tǒng)；SHISEIDO Capcell park MC C18（4.6mm×250mm，5μm） 色 譜 柱；KQ5200DE 型數(shù)控超聲波清洗器；Mettler XS205DU電子天平；MilliPore Advantage A10 自動純水機。

1.2 試藥垂盆草藥材由廣東一方制藥有限公司提供，劉法錦研究員鑒定為景天科植物垂盆草Sedum sarmentosumBunge 的干燥全草；蘆丁對照品（批號：100080-200707）購于中國食品藥品檢定研究院；垂盆草配方顆粒（1.2g 相當(dāng)于15g 飲片）樣品購于廣東一方制藥有限公司，批號見表1。

甲醇、乙腈為色譜純；液相用水為超純水；其余試劑均為分析純。

表1 垂盆草配方顆粒批號

2 方法與結(jié)果

2.1 對照品溶液的制備精密稱取4.46mg 蘆丁對照品，置于容量瓶中，加入甲醇制成每1mL 含44.6μg 蘆丁的對照品溶液，置冰箱內(nèi)保存，備用。

2.2 垂盆草配方顆粒供試品溶液的制備精密稱取樣品S1～S10 各約1.0g，置于錐形瓶中，加入25mL 50%甲醇，稱重，超聲處理30min，取出，放冷，補重，搖勻，取0.45μm 微孔濾膜續(xù)濾液。

2.3 垂盆草藥材供試品溶液的制備取10g 藥材，加入200mL 水，煮沸30min，蒸發(fā)至干，加1.0g 硅藻土攪拌均勻，置于錐形瓶中，同“2.2”項的方法制備垂盆草藥材供試品溶液。

2.4 色譜條件的建立采用Waters XbridgeTMC18（4.6mm×250mm，5μm）色譜柱；以甲醇（A）- 0.4%磷酸（B）為基礎(chǔ)流動相，研究了樣品提取方法、檢測波長、色譜柱、流動相體系、柱溫及流速，以確立最佳色譜條件。

經(jīng)試驗，建立本實驗的最佳色譜條件為：SHISEIDO Capcell park MC C18（4.6mm×250mm，5μm）色譜柱；流動相：甲醇（A）- 0.1%磷酸（B），按表2 進行梯度洗脫；檢測波長：265nm；流速：1.0 mL/min；柱溫：30℃；進樣體積：10μL。

表2 流動相梯度

2.5 方法學(xué)考察

2.5.1 精密度試驗制備垂盆草配方顆粒供試品溶液（S7）并連續(xù)進樣6 次。中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)計算6 次所得指紋圖譜與共有模式圖譜的相似度均＞0.99；參照峰為指紋圖譜中的10 號峰，計算共有峰的相對保留時間和相對峰面積RSD 值均＜2%，表明測試儀器穩(wěn)定，精密度高。

2.5.2 重復(fù)性試驗取同一批號樣品（S7）6 份，制備供試品溶液，并進行檢測。計算6 次所得指紋圖譜與共有模式圖譜的相似度均＞0.99；共有峰的相對保留時間和相對峰面積RSD 值＜2%，表明該實驗中建立的方法具有良好的重復(fù)性。

2.5.3 穩(wěn)定性試驗取供試品溶液（S7），分別于0、4、8、12、16、24h 進樣。計算6 次所得指紋圖譜與共有模式圖譜的相似度均＞0.99；共有峰的相對保留時間和相對峰面積RSD 值＜2%，說明供試品溶液在24h 內(nèi)具有良好的穩(wěn)定性。

2.5.4 空白試驗及對照試驗將蘆丁對照品、垂盆草藥材以及垂盆草配方顆粒測得的HPLC 色譜圖進行比較。結(jié)果見圖1-3，并且第22 號峰確定為蘆丁，配方顆粒與藥材的相關(guān)性較好。

圖1 蘆丁對照品溶液HPLC色譜圖

圖2 垂盆草藥材HPLC色譜圖

圖3 垂盆草配方顆粒HPLC色譜圖

3 垂盆草配方顆粒指紋圖譜模型的建立

對10 批垂盆草配方顆粒指紋圖譜的色譜峰進行匹配，匹配結(jié)果見圖4，得出共有模式色譜圖見圖5。共確定了25 個共有峰，其中10 號峰為參照峰。10 批樣品共有峰的相對保留時間及相對峰面積數(shù)據(jù)見表3-4。與共有模式相比，不同批號垂盆草配方顆粒樣品的相似度數(shù)據(jù)，見表5。

表3 10批垂盆草配方顆粒共有峰相對保留時間

表4 10批垂盆草配方顆粒共有峰相對峰面積

圖4 10批垂盆草配方顆粒樣品指紋圖譜匹配色譜圖

圖5 不同批號垂盆草配方顆粒HPLC共有模式圖

表5 不同批號垂盆草配方顆粒樣品與共有模式比較的相似度

利用相似度評價軟件分析，得出垂盆草配方顆粒的HPLC 共有模式圖上有25 個共有峰。通過表觀分析，不同批號垂盆草配方顆粒都在6.8、7.4、8.8、9.4、13.0、15.3、21.6、23.7、24.2、26.9、28.1、34.2、38.5、40.2、41.3、49.3、57.1、65.9、70.2、83.3、88.0、90.4、91.0、93.3、94.9min 左右出峰，可以初步認為這是不同批次垂盆草配方顆粒指紋圖譜共有峰的保留時間。

4 討論

（1）本實驗考察了不同廠家的色譜柱，結(jié)合色譜圖的峰數(shù)、分離度、峰形、基線以及柱壓，最后選用SHISEIDO Capcell park MC C18（4.6mm×250mm， 5μm）色譜柱為本實驗用色譜柱。

研究流動相體系時，甲醇-水流動相獲得色譜峰的峰形與分離度較差，但在流動相體系中加酸后的甲醇-0.4%磷酸流動相，色譜峰的峰形得到改善，分離度良好；將甲醇換為乙腈按上述梯度進行洗脫，色譜峰分離差。最后，研究了不同濃度的酸在流動相中的作用，甲醇-0.4%磷酸與甲醇-0.1%磷酸的色譜圖基本一致，雖然兩種流動相體系的pH 值均在色譜柱的適用范圍內(nèi)，但考慮到酸的量較大會對色譜柱有一定的損害，因此，最終采用甲醇-0.1%磷酸作為實驗的流動相體系。

（2）比較垂盆草配方顆粒與藥材的指紋圖譜，結(jié)果基本一致，表明配方顆粒與藥材有很好的相關(guān)性，臨床上可以代替藥材使用。另外，從每個批號的垂盆草配方顆粒的HPLC 色譜圖上看出，每個批號的垂盆草配方顆粒中成分大致一樣，但含量有所不同，這可認為是與原料的生長環(huán)境、采收時間或制備工藝過程等因素影響有關(guān)。從表5 的相似度數(shù)據(jù)中，9 批樣品的相似度高于0.9，只有1 個批號樣品的相似度稍低于0.9，可能是由于投料所用垂盆草藥材與其余批號投料所用的垂盆草藥材產(chǎn)地及質(zhì)量不一樣所致，因此，原料藥材的來源應(yīng)在生產(chǎn)過程中固定，以保證垂盆草配方顆粒原料藥材質(zhì)量的穩(wěn)定性和一致性，才能保證其配方顆粒的質(zhì)量穩(wěn)定。