HPLC 法測定紅芽姜中3 種姜辣素類化合物的含量*

★ 張華 嚴國鴻 賴昕 劉永靜 徐偉 褚克丹* 孫承韜

（1.福建中醫(yī)藥大學藥學院 福州 350122；2.福建中醫(yī)藥大學附屬人民醫(yī)院 福州 350000）

紅芽姜，又稱青州竹根姜，生長分布于我國山東、福建、湖南，在福建省內主要種植于閩北、三明、漳州等地。其植株生長勢強，分枝數(shù)多。根莖皮淡黃色，芽淡紅色，根莖肉色蠟黃，纖維少。單株根莖重可達500g 左右，其中含有豐富的姜辣素，是傳統(tǒng)中藥炮制的優(yōu)質原料藥材［1］，生姜汁入藥始見于漢代張仲景《金匱玉函經(jīng)》是生姜搗絞取汁［2］。其作為炮制輔料始見于南北朝《劉涓子鬼遺方》 ，其歷代文獻中姜制飲片多達90 多種，姜制方法有生姜浸、生姜自然汁拌蒸、姜汁浸焙、姜汁炙（炒）、姜汁煮、姜汁浸、姜汁煨、生姜汁淬等。沿用至今多為姜汁炒、姜汁煮［3］。姜辣素是姜酚、姜醇、姜酮等生姜中辣味成分的總稱，具有抑制血小板聚集、抗氧化、改善心血管和胃腸道功能、增強免疫力等作用，其中以6-姜酚含量最高［4］?！吨袊幍洹?015 年版將以6-姜酚（C17H26O4）、8-姜酚（C19H30O4）和10-姜酚（C21H34O4）為代表的姜辣素類化合物作為生姜含量測定項下的指標性成分［5］，并規(guī)定6-姜酚的含量不得低于0.05%，8-姜酚和10-姜酚總量不得低于0.04%。

目前，對于福建閩產(chǎn)紅芽姜的品質評價研究尚未系統(tǒng)展開，本研究采用HPLC 法同時測定了福建省不同產(chǎn)地紅芽姜中6-姜酚、8-姜酚和10-姜酚這3 中姜辣素類化合物的含量，為建立以紅芽姜主要成分為基礎的質量標準提供科學依據(jù)，為保證以紅芽姜為炮制輔料的紅芽姜制半夏藥材品質，為閩產(chǎn)紅芽姜的進一步推廣應用奠定理論基礎。

1 儀器與試藥

1.1 儀器高效液相色譜儀（美國Thermo Sctentific公司，型號：UltiMate3000 型）；電子天平（梅特勒-托利多國際貿易（上海）有限公司，型號：XS105Du）；超純水機（密理博中國有限公司，型號：Milli-Q Advantage）；數(shù)控超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司，型號：KQ-500DE）。

1.2 試藥6- 姜酚標準品（批號：150623，四川維克奇生物科技有限公司）；8-姜酚（批號：111993-201601，中國食品藥品檢定研究院）；10-姜酚標準品（批號：111994-201501，中國食品藥品檢定研究院）；紅芽姜（不同產(chǎn)地批次藥材由福建承天藥業(yè)有限公司提供，經(jīng)福建中醫(yī)藥大學藥學院褚克丹教授鑒定為姜科植物姜（Zingiber officinaleRosc.）的新鮮根莖）；乙腈、甲醇為色譜純（美國DIKMA 公司）；實驗用水為超純水，其他試劑均為分析純。

2 方法與結果

2.1 色譜條件Diamonsil C18色譜柱（250mm×4.6 mm，5μm），流動相為乙腈（A）-0.1%磷酸水溶液（B），梯度洗脫（0～10min，A：25%→40%；10～25min，A：40%；25～40min，A：40%→80%；40～45min，A：80%→25%），檢測波長為282nm，進樣量為10μL，流速為1.0mL/min，柱溫為30℃。在上述色譜條件下，6-姜酚、8-姜酚和10-姜酚3 種成分色譜峰峰間分離度良好（各相鄰色譜峰的分離度均大于1.5），理論板數(shù)按6-姜酚峰計算不低于5000，結果見圖1。

圖1 對照品（A）及樣品（B）液相色譜圖

2.2 對照品溶液的制備分別精密稱取6-姜酚、8-姜酚和10-姜酚標準對照品適量，加甲醇制成濃度分別為0.74、0.63、0.88mg/mL 的對照品溶液，分別精密移取上述3 種對照品溶液4.0、1.0、1.0mL 置于25mL 量瓶中，甲醇定容至刻度，即得含有6-姜酚118.4μg/mL、8-姜酚25.2μg/mL 和10-姜酚35.2μg/mL 的混合對照品溶液，均置于4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

2.3 供試品溶液的制備取紅芽姜碎末5g，精密稱重，置于具塞錐形瓶中，精密加入甲醇50mL，稱定重量后超聲提取40min（300W，25kHz），冷卻后稱定重量，甲醇補足失重，搖勻后用0.45μm微孔濾膜過濾，取續(xù)濾液作為供試品溶液。

2.4 線性關系的考察分別精密吸取“2.2 項下”混合對照品溶液2，5，10，15，20μL 進樣分析，以進樣的樣品量（μg）為橫坐標（X），峰面積為縱坐標（Y），進行線性回歸得3 種成分的回歸方程和相關系數(shù)，見表1。由表1 可知，6-姜酚、8-姜酚和10-姜酚在相應范圍內，進樣量（μg）與峰面積呈良好的線性關系。

表1 3種姜辣素類成分標準曲線

2.5 精密度試驗精密吸取“2.2” 項下混合對照品溶液連續(xù)進樣6 次，分別記錄3 種姜辣素類成分的峰面積，計算得6-姜酚、8-姜酚和10-姜酚峰面積的RSD 值分別為1.03%、1.37%、1.74%（n=6），表明儀器的精密度良好。

2.6 重復性試驗取同一批次紅芽姜，照“2.3”項下方法平行制備6 份供試品溶液，記錄峰面積，計算紅芽姜中6-姜酚的含量平均值為1.16mg/g、8-姜酚的含量平均值為0.25mg/g、10-姜酚峰的含量平均值為0.38mg/g，RSD 值分別為1.88%、1.39%、1.72%（n=6），表明方法重復性良好。

2.7 穩(wěn)定性試驗取同一批次紅芽姜，照“2.3”項下方法制備供試品溶液，分別于配制后0、2、4、8、12、24、36、48h 進樣，記錄峰面積，計算6-姜酚、8-姜酚和10-姜酚峰面積的RSD 值分別為1.50 %、1.69%、1.83%（n=8），表明處理后的供試品溶液在48h 內穩(wěn)定。

2.8 加樣回收率試驗稱取已知6-姜酚、8-姜酚和10-姜酚含量的紅芽姜樣品3g，共6 份，分別精密移取質量濃度為0.74 mg/mL 的6-姜酚對照品溶液5mL，0.63mg/mL 的8- 姜酚對照品溶液1.2mL 和0.88mg/mL 的10- 姜酚對照品溶液1.2mL。照“2.3”項下方法制備供試品溶液，按“2.1”項下色譜條件進樣，測定各成分峰面積，計算回收率。結果見表2，6-姜酚、8-姜酚和10-姜酚的平均回收率分別為100.71%，98.46%和99.23%；RSD 值分別為1.65%，1.28%和0.82%（n=6）。

表2 加樣回收率試驗結果（n=6）

2.9 樣品含量測定分別稱取不同產(chǎn)地各6 批次的紅芽姜樣品，照“2.3”項下方法平行制備6 份供試品溶液，按“2.1”項下色譜條件進樣，計算紅芽姜中6-姜酚、8-姜酚和10-姜酚的含量。結果表明，不同產(chǎn)地紅芽姜中姜辣素類成分含量均有一定差異，結果見表3。

表3 不同產(chǎn)地紅芽姜中3種姜辣素類化合物的平均含量（n=6）

3 討論

紅芽姜化學成分復雜，其中，姜辣素是生姜及其炮制品中的主要有效成分，其中含量最高的是姜酚類化合物，主要包括6-姜酚、8-姜酚和10-姜酚等10 余種成分，其中又以6-姜酚居多［6］。姜酚類化合物具有較高的生物活性和廣泛的藥理作用，可以作為評價紅芽姜藥物品質的重要指標，本研究前期采用單因素考察法，分別考察了提取溶劑（水、甲醇、乙醇、正丁醇），提取方法（加熱回流提取和超聲提?。┮约疤崛r間，利用HPLC 法進樣分析，最終采用超聲提取（超聲功率和頻率為：300W，25kHz），提取時間為40min，提取溶劑為甲醇的提取工藝。

色譜條件方面，紫外全波長掃描結果顯示：6-姜酚、8-姜酚和10-姜酚在282 nm 附近具有最大吸收，因此本實驗選擇282 nm 作為測定波長。同時，流動相體系方面，實驗比較了甲醇-水、乙腈-水、乙腈-0.1%磷酸水溶液和中國藥典2015 年版中生姜含量測定項下的乙腈-0.1%醋酸水溶液，最終結果表明，與使用乙腈-0.1%醋酸水溶液相比，乙腈-0.1%磷酸水溶液對三種姜酚類成分的分離度較高，且峰型較好、保留時間適宜，測定時間較藥典方法縮短了13min（藥典梯度洗脫時間為58min）。

本研究建立的HPLC 法所測得的3 種姜酚類化合物含量準確，且重現(xiàn)性好、專屬性強，說明該方法成熟可靠，測得結果表明，紅芽姜中3 種姜酚類化合物含量均滿足《中國藥典》對生姜項下含量測定的要求，其中6-姜酚含量遠高于藥典標準，保證了以紅芽姜為炮制輔料的紅芽姜制半夏的藥材品質，有利于紅芽姜在中藥市場上的推廣。同時，也為紅芽姜的品質評價研究提供了有效依據(jù)，為下一步質量標準的建立奠定了理論基礎。

本實驗通過考察閩產(chǎn)紅芽姜中3 種姜辣素類化合物的含量，對福建省內不同產(chǎn)地的紅芽姜進行測定。經(jīng)測定：福建建陽所產(chǎn)紅芽姜中的6-姜酚和8-姜酚含量最高，其中8-姜酚含量為為福建南靖所產(chǎn)紅芽姜的1.19 倍。福建光澤所產(chǎn)紅芽姜中的10-姜酚含量最高，為福建南靖所產(chǎn)紅芽姜的1.13 倍。綜上，3 種姜辣素類化合物中，產(chǎn)地差異最明顯的為8-姜酚，對比同類型文獻［7］，其姜辣素類成分（6-姜酚、8-姜酚和10-姜酚）含量較河南、山東等地所產(chǎn)生姜高。