鼠類膝骨性關節(jié)炎模型建立的研究進展*

★ 李威 楊鳳云

（江西中醫(yī)藥大學 南昌 330004）

KOA 是臨床常見退行性關節(jié)病，發(fā)病機制暫不明確，由多種不確定因素所致的關節(jié)軟骨退化損傷、關節(jié)邊緣和軟骨下骨反應性增生，臨床表現(xiàn)為關節(jié)疼痛、關節(jié)腫脹、活動受限和關節(jié)畸形等［1］。多發(fā)于中老年人，我國65 歲老年人KOA 患病率達8.1%，且呈上升趨勢［2-3］。為探尋其病因及發(fā)病機理，近年來大量的科研人員通過手術造模、膝關節(jié)制動造模、關節(jié)腔注射藥物造模等多種方法進行實驗，取得了不錯的成績，現(xiàn)對其研究現(xiàn)狀作如下闡述。

膝骨性關節(jié)炎模型常采用的實驗動物為鼠和兔，而鼠類關節(jié)組織結構與人類較接近， 骨性關節(jié)炎模型軟骨生化指標與人類患此病的情況相對較一致；在形態(tài)學方面，鼠類軟骨細胞凋亡方式與人類軟骨細胞凋亡方式相類似；同時鼠類具有易飼養(yǎng)、體積小、價廉的特點，故臨床上常用鼠類制備膝骨性關節(jié)炎模型［4］。膝骨性關節(jié)炎模型的建立大體可分為兩大類：一為自發(fā)性模型，即無人為干預、自發(fā)進行的過程，無需借助外力；另一類為干預誘發(fā)性模型：即通過人為的各種方法干預后誘導發(fā)生，需要借助外力。

1 自發(fā)性造模

與人類一樣，由于運動磨損，年老退化等原因鼠類也會罹患膝骨性關節(jié)炎；Silberberg 等［5］學者通過對黑鼠膝關節(jié)軟骨病理學研究，首次發(fā)現(xiàn)黑鼠關節(jié)軟骨退變與人類相似，在無人為干預的情況下，黑鼠會自發(fā)的患膝骨性關節(jié)炎。而目前最常用的自發(fā)性膝骨性關節(jié)炎模型是hartly 豚鼠的膝關節(jié)［6］，因為雄性hartly 豚鼠膝骨性關節(jié)炎病變方式與人類的相似，主要以負重區(qū)發(fā)生軟組織改變，便于實驗與研究。此方法缺點是時間長、造模慢、不好控制；優(yōu)點是經濟、無需人工干預。

2 干預誘發(fā)性造模

2.1 膝關節(jié)制動造模肢體的制動在臨床上常用于軟組織或骨折等創(chuàng)傷的治療手段，然而肢體制動也會造成新的損傷。膝關節(jié)制動造模是指將鼠類膝關節(jié)長時間固定幾周以上或短期的反復制動，通過限制關節(jié)活動而導致關節(jié)軟骨退行性改變；多采用過曲位和過伸位固定［7］，都可以取得不錯的造模效果。錢潔等［8］用石膏繃帶將棉脂墊固定于大鼠左側踝與髖關節(jié)之間，固定于過伸位；3 周后開始出現(xiàn)膝骨性關節(jié)炎的表現(xiàn)，成功建立KOA 模型。QIN J 等［9］通過固定Wistar 大鼠雙前肢及尾部來建立膝骨性關節(jié)炎模型，控制關節(jié)的活動，6 周后由于用進廢退導致關節(jié)退行性變化明顯，關節(jié)軟骨退化變硬，關節(jié)間隙變窄、僵硬、活動受限，也是一種模型建立的方法。

但此方法操作難度大，效果難以掌控，可重復性較低，關節(jié)制動需時刻觀察以防止制動工具松動或脫落，影響造模效果。

2.2 喂養(yǎng)造模Silberberg 等［10］通過給C57BL 小鼠喂養(yǎng)含高脂肪、高動物油脂的飼料，發(fā)現(xiàn)會增加其膝骨性關節(jié)炎的發(fā)病率，而且患關節(jié)炎的幾率與高脂肪飼料的用量有關。何建宜等［11］通過對C57BL/6J 雄鼠進行分組喂養(yǎng)，空白組用普通維持飼料，對照組用高脂飼料，16 周后對其行HE 及番紅O 染色染色處理，發(fā)現(xiàn)高脂組軟骨關節(jié)面不完整，軟骨細胞量減少。而且用Omega-3 脂肪酸代替必需脂肪酸Omega-6 會加速關節(jié)軟骨纖維改變。

喂養(yǎng)造模較少見，造模效果不明顯，不可控因素太多，難以達到較好的效果。

2.3 關節(jié)腔注射藥物造模

2.3.1 碘乙酸鈉關節(jié)腔內注射碘乙酸鈉造模是一種較常用的造模方法。其作用機理是：碘乙酸鈉是甘油醛-3-磷酸脫氫酶的抑制劑，注射后會使軟骨基質發(fā)生改變、軟骨發(fā)生降解和丟失，出現(xiàn)滑膜炎等癥狀，與人類產生的病變較為相似［12］。Hagmann 和Noriko 等［13-15］對雄性Wistar 大鼠的膝關節(jié)注射碘乙酸鈉，4 周后病理學觀察發(fā)現(xiàn)關節(jié)軟骨破壞嚴重、變性，有局部炎癥灶點，關節(jié)腔內有游離體形成，骨礦物質密度測量提示礦物質含量低于正常水平，以此建立膝骨性關節(jié)炎模型。張文強等［16］通過將0.1mL 4%碘乙酸鈉溶液50μL 注射到鼠膝關節(jié)腔內，觀察大鼠關節(jié)液內miR-34a 的量的表達情況（miR-34a 有抑制軟骨細胞生長的作用），8 周后分離軟骨細胞進行培養(yǎng)，用細胞流式儀檢測發(fā)現(xiàn)miR-34a 在軟骨細胞中的含量明顯增高。

此造模方法優(yōu)點在于模型建立時間短，操作簡便，易于控制，關節(jié)穩(wěn)定，模型較為典型，實用性強。

2.3.2 膠原酶關節(jié)腔內注射膠原酶也是經典的造模方法。其機理是：膠原酶能分解細胞間基質的膠原蛋白，從而分解關節(jié)軟骨、半月板及其他關節(jié)組織的膠原蛋白，從而破壞關節(jié)而達到膝關節(jié)炎的病理變化。梁霄等［17］通過分別在第1、3d 將10μL 含量1 或2 U 的膠原酶注射在遠交系雄性小鼠膝關節(jié)腔內，4 周后病理觀察后發(fā)現(xiàn)膝關節(jié)有明顯退變的痕跡，滑膜和關節(jié)軟骨發(fā)生不同程度的硬化和破壞，并且軟骨的退變逐漸加重，可以形成不錯的膝骨性關節(jié)炎模型；并且發(fā)現(xiàn)膠原酶的濃度差異也可以建立不同程度的模型，模型都會形成，只是效果會有所差異，可根據需要選擇濃度。

膠原酶造?？梢院芎玫挠^察關節(jié)炎發(fā)病過程，特異性強，對關節(jié)軟骨識別靈敏，有其特殊的優(yōu)越性，是一個不錯的選擇。

2.3.3 木瓜蛋白酶木瓜蛋白酶注射也是科研實驗中模型建立主要的方法之一。其原理是：木瓜蛋白酶能降解軟骨內的蛋白多糖，降低了對軟骨的保護作用。同時分解的多糖殘留進入關節(jié)內，會刺激關節(jié)而引發(fā)炎癥。段文秀等［18］學者通過用4%木瓜蛋白酶和L-半胱氨酸混合液對大鼠右膝關節(jié)腔內進行注射，造模后分別用透射電鏡觀察第1，2，4，6 周股骨內側髁關節(jié)軟骨超細微結構的變化。觀察到股骨內側髁關節(jié)軟骨隨著時間的推移而變化明顯，軟骨破壞不斷加重，其中造模后4 周左右改變最為明顯，滑膜明顯增生變性，關節(jié)間隙變窄，軟骨下骨硬化。

該造模方案會出現(xiàn)關節(jié)軟骨破壞、滑膜增生等典型的膝骨關節(jié)炎表現(xiàn)，而且此造模方法簡單，周期較短，重復性高，關節(jié)穩(wěn)定性好。

2.3.4 其他造模方法關節(jié)腔內注射造模方法還有很多，越來越多的方法出現(xiàn)，來源于科研學者們對實驗的執(zhí)著與熱愛，使得造模方法不斷地在發(fā)展與更新。其他主要方法還有聚乙烯亞胺（polyethyleneimine）、雌二醇（estradiol）、菲律賓菌素（filipin）尿激酶型纖溶酶原激活物（urinary plasminogen activator，uPA）、軟骨碎片或微粒、透明質酸酶、單體碘乙酸腎上腺皮質激素、乙烯亞胺多聚物、異物等關節(jié)腔內注射都可以建立KOA 模型［19-21］。

關節(jié)腔注射造模方法匯總如表1。

表1 關節(jié)腔內注射造模表

2.4 手術造模目前科學實驗中采用手術方法建立模型發(fā)展迅速，應用廣泛，其機理主要是破壞關節(jié)的動態(tài)穩(wěn)定，使關節(jié)受力不均，失去原有的平衡，導致關節(jié)內的磨損從而誘發(fā)關節(jié)軟骨的改變，形成關節(jié)炎。

如：Hulth 手術造模［22］，Hulth 法是較早出現(xiàn)的手術造模方法，而且也是手術建立模型較常用的方法。Stoop R等［23］通過打開關節(jié)腔，離斷內側副韌帶，內側半月板并切斷前交叉韌帶的手術方法，觀察5 周后關節(jié)變化，得到KOA 模型。改良Hulth 法：李文雄等［24］選擇從大鼠右膝關節(jié)內側切開并打開關節(jié)腔，離斷內側副韌帶，再離斷前后交叉韌帶，最后把內側半月板全部摘除，造模1 周后，每日驅趕大鼠活動30min 以上，并持續(xù)8 周，得到KOA 模型。孫先潤等［25］通過切斷大鼠前交叉韌帶建立KOA 模型，并于術后觀察其病理變化及特征，成功觀察到關節(jié)炎的病理變化。陳蔚東等［26］通過在SD 大鼠膝髕旁內側切開，直到關節(jié)腔，并把髕骨向外側推使之脫位，使膝關節(jié)處于最大屈曲位置，暴露關節(jié)腔，并剪掉內側半月板的1/3和前交叉韌帶，成功建立KOA 模型。張榮凱等和Hayami T 等［27-29］通過“內側副韌帶切斷+內側半月板切除”的方法，術后4 周觀察其病理、形態(tài)學等方面發(fā)現(xiàn)內側股骨髁均見明顯的軟骨面輕度糜爛，少部分關節(jié)潰瘍磨損，外側股骨髁軟骨面稍粗糙，外側脛骨平臺光滑如常，發(fā)生的變化與人類早期關節(jié)炎較為相似，而且干預時間較短，成功的幾率高。Ochiai 等［30］通過將雄性SD 大鼠的前交叉韌帶和內側副韌帶離斷的方法，4 周后打開關節(jié)腔觀察發(fā)現(xiàn)，膝關節(jié)退化嚴重，韌帶明顯縮短，炎癥明顯且修復較快，纖維組織增生明顯變硬，此實驗方法也可得到KOA 模型。

手術方法建立模型時間短，效果好，經濟且能較好模擬出關節(jié)炎的病理變化過程。但操作復雜，不好控制，且造模后關節(jié)不穩(wěn)定影響關節(jié)基本活動，有一定前期實驗基礎的可以優(yōu)先選擇此方法。

3 討論

目前科研實驗中對于使用鼠類建立KOA 模型的方法及技術相對成熟。但現(xiàn)階段科研與臨床的結合度還不是特別高，臨床上對于關節(jié)炎的了解還不夠深入，膝骨性關節(jié)炎的病因和發(fā)病機制還不明確，需要人們不斷地挖掘與創(chuàng)新。同時，大量實驗的探究使得這項技術不斷發(fā)展與完善，越來越多模型建立方法出現(xiàn)，卻出現(xiàn)一個新的問題，在各式各樣的方案面前，難以選擇合適的方案。模型建立是否成功或者成功需達到的水平都沒有一個評定的標準，建立一個合理的標準非常有必要；其次，把科研與臨床相結合迫在眉睫，目前現(xiàn)狀是臨床大多數(shù)醫(yī)生沒有接觸過科研，而科研人員又常常與臨床脫節(jié)，很難實現(xiàn)臨床與科研步調統(tǒng)一，導致科研結果不能在短時間內使臨床病人受益。

總之，各種造模方法大致的原理是類似的：都是模擬人類KOA 的發(fā)病機理、力學的改變、局部病理變化、關節(jié)軟骨的病變過程等［31］。同時，不同的模型建立方法均有其獨特之處，均有其不同的優(yōu)缺點及適用條件。所以，在實驗中需依照實際情況（如實驗條件，經費等）來選擇自己適用的建立方法，需盡量選擇一些與人類KOA 發(fā)病機理相似的建立方法，得到的模型更加符合疾病的病變過程，更加接近人體內部動態(tài)變化，從而更好的了解疾病，理解其病因和發(fā)病機制，完善臨床上的防治方法，達到實驗輔助臨床的目的［32］。