敲減STAT3基因表達對胰腺祖細胞增殖的影響*

李旭艷， 翟文君， 馬明君， 陳振寶， 孫玉林， 趙 娟， 李永芹

(1嶺南師范學(xué)院生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院， 廣東 湛江 524000； 2東北林業(yè)大學(xué)生命學(xué)院， 黑龍江 哈爾濱 150040)

隨著人們生活方式的改變和生活環(huán)境的變化，糖尿病和胰腺炎等胰腺相關(guān)疾病的發(fā)病率呈逐年上升趨勢，嚴重危害人類健康和生活質(zhì)量。糖尿病患者表現(xiàn)為胰島β細胞受損或胰島素抵抗，胰腺炎患者的胰腺腺泡細胞凋亡或壞死。補充受損或功能異常的胰島β細胞或腺泡細胞將是治療這類疾病的根本途徑。終末分化胰島細胞和胰腺腺泡細胞均起源于胚胎發(fā)育早期胰腺干細胞，研究發(fā)現(xiàn)，成體胰腺含有1%的胰腺干/祖細胞，激活成體胰腺干/祖細胞增殖分化，獲得終末分化胰腺內(nèi)、外分泌細胞，是胰腺疾病治療的新希望。

信號轉(zhuǎn)導(dǎo)及轉(zhuǎn)錄激活因子3(signal transducer and activator of transcription 3，STAT3)是重要的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)因子，參與干擾素、白細胞介素和生長因子等多種細胞因子的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)過程，是白細胞介素6/Janus 激酶(interleukin-6/Janus kinase，IL-6/JAK)和表皮生長因子受體(epidermal growth factor receptor，EGFR)等酪氨酸激酶信號通路效應(yīng)分子，STAT3被上游的蛋白激酶磷酸化，形成二聚體，進入細胞核內(nèi)調(diào)控促增殖、抗凋亡、免疫反應(yīng)等基因表達，調(diào)控細胞生長、分化、遷移、凋亡、自噬、免疫以及代謝等重要生命活動。正常生理條件下STAT3低表達或短暫性激活，而在胰腺疾病發(fā)生發(fā)展過程中STAT3被活化并持續(xù)激活。被激活的STAT3促進胰腺癌細胞異常增殖、轉(zhuǎn)移、生成新生血管[1]，炎癥在胰腺癌的進展過程中扮演重要角色，能顯著加速胰腺上皮腫瘤癌變，STAT3作為一種急性期反應(yīng)因子，參與調(diào)控胰腺炎和胰腺纖維化進程[2]，另外，STAT3參與糖尿病腎病、糖尿病心肌病和糖尿病視網(wǎng)膜病變的發(fā)生和發(fā)展的過程[3-5]。阻斷STAT3信號通路，能改善胰腺癌、胰腺炎和糖尿病并發(fā)癥癥狀，STAT3信號通路有可能成為治療胰腺疾病的藥物靶點。研究發(fā)現(xiàn)，STAT3對腫瘤干細胞、胚胎干細胞和成體干細胞的增殖、自我更新和重編程有重要調(diào)控作用。STAT3促進牙髓干細胞增殖、抑制分化[6]，促進甲狀腺癌干細胞細胞集落形成[7]，維持慢性髓細胞性白血病干細胞的特性[8]，STAT3是否調(diào)控胰腺干/祖細胞的功能尚未報道。本研究以小鼠胰腺祖細胞為研究對象，沉默STAT3基因表達，檢測STAT3基因?qū)σ认僮婕毎鲋车挠绊懀骄恳认僮婕毎鲋车臋C制，將為利用胰腺干/祖細胞開展疾病治療提供實驗依據(jù)。

材 料 和 方 法

1 細胞

小鼠成體胰腺祖細胞為東北林業(yè)大學(xué)發(fā)育生物學(xué)實驗室提供[9]。

2 主要試劑

DMEM/F12培養(yǎng)液、胰蛋白酶、雙抗和L-谷氨酰胺購自HyClone；B-27細胞培養(yǎng)添加劑和胎牛血清(fetal bovine serum，F(xiàn)BS)購自Gibco；細胞培養(yǎng)級別重組人胰島素和表皮生長因子(epidermal growth factor，EGF)購自Becton, Dickinson and Company；細胞轉(zhuǎn)染脂質(zhì)體Lipofectamine RNAiMAX購自Invitrogen；總RNA提取試劑Tripure和實時熒光定量PCR試劑RT-qPCR SYRB Green購自Roche；脫氧核糖核酸酶I(deoxyribonuclease I，DNaseI)和核糖核酸酶抑制劑(ribonuclease inhibitor，RI)購自TaKaRa；反轉(zhuǎn)錄試劑盒、抗β-肌動蛋白(β-actin)抗體(HC201-02)和辣根過氧化物酶標記的II抗(HS201-01)購自北京全式金生物技術(shù)有限公司；Cell Counting Kit-8(CCK8)試劑盒購自Dojindo Labratories；細胞周期檢測試劑盒、BCA蛋白濃度測定試劑盒和RIPA蛋白裂解液購自碧云天生物技術(shù)研究所；抗STAT3抗體(cst.9139)和抗細胞周期蛋白D2(cyclin D2，CCND2)抗體(cst. 3741)購自Cell Signaling Technology；β-巰基乙醇、過硫酸銨、丙烯酰胺、甲基雙丙烯酰胺和四甲基乙二胺購自Sigma；吐溫20、甲醇等常規(guī)生化試劑購自天津天大化學(xué)試劑廠。靶向STAT3的小干擾RNA[STAT3small interfering RNA (siRNA),siSTAT3][10]和對照siRNA(negative control，NC)由吉瑪基因股份有限公司合成，序列見表1。qPCR引物由金唯智基因公司合成，序列見表2。

表1 siRNAs序列

表2 qPCR引物序列

3 主要方法

3.1細胞培養(yǎng) 傳代胰腺祖細胞用10%貼壁培養(yǎng)液過夜培養(yǎng)，次日早更換2%生長培養(yǎng)液，置于37 ℃、5.0% CO2飽和濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每3 d更換生長培養(yǎng)液。貼壁培養(yǎng)液成分：含10% FBS、1%雙抗和1% L-谷氨酰胺的DMEM/F12培養(yǎng)液。生長培養(yǎng)液成分：含2% FBS、1%雙抗、1% L-谷氨酰胺、2% B-27、50 μmol/L β-巰基乙醇、10 mg/L重組人胰島素和20 μg/L EGF的DMEM/F12培養(yǎng)液。

3.2細胞轉(zhuǎn)染 取培養(yǎng)8代的胰腺祖細胞，96 孔和12 孔細胞培養(yǎng)板每孔分別接種3×103和1×105個細胞，生長培養(yǎng)液培養(yǎng)24 h后，細胞40%匯合后，每孔轉(zhuǎn)染50 nmol/L siSTAT3或NC，細胞轉(zhuǎn)染參照Lipofectamine RNAiMAX說明書操作。對照組和實驗組均設(shè)3個復(fù)孔。同時轉(zhuǎn)染陽性對照siRNA，qPCR檢測基因沉默效果， 間接判斷轉(zhuǎn)染效率。

3.3qPCR檢測各基因mRNA的表達 細胞轉(zhuǎn)染48 h，提取細胞總RNA，利用隨機引物反轉(zhuǎn)錄，獲得cDNA，qPCR檢測基因mRNA表達，所得數(shù)據(jù)通過2-ΔΔCt方法計算，β-actin作為內(nèi)參照，設(shè)置3個重復(fù)。

3.4Western blot檢測蛋白的表達 細胞轉(zhuǎn)染72 h，PBS洗滌，RIPA裂解細胞，收集裂解液，10 000×g離心10 min，取上清，測定蛋白濃度，分裝樣品凍存。樣品進行SDS-PAGE，轉(zhuǎn)膜，37 ℃封閉1 h，抗β-actin、STAT3和CCND2 抗體4 ℃孵育過夜，TBST洗膜3次，II抗室溫孵育1 h，Tanon 5200發(fā)光成像系統(tǒng)采集圖像，β-actin作為內(nèi)參照。

3.5活細胞計數(shù)檢測細胞增殖 24孔板接種胰腺祖細胞，生長至40%匯合，轉(zhuǎn)染siSTAT3或NC 72 h，胰酶消化為單細胞，收集到離心管定容到1 mL，稀釋后，在光學(xué)顯微鏡下用血細胞計數(shù)板計數(shù)。對照組和實驗組均設(shè)3個復(fù)孔。

3.6CCK8法檢測細胞活力 96 孔板接種胰腺祖細胞，生長至40%匯合，轉(zhuǎn)染siSTAT3或NC 72 h，棄去培養(yǎng)液，PBS洗滌細胞，補加110 μL含有10% CCK8的DMEM/F12培養(yǎng)液，置于37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2 h，通過酶標儀讀取各孔吸光度(A)值。對照組和實驗組均設(shè)3個復(fù)孔。

3.7流式細胞術(shù)檢測細胞周期分布 細胞轉(zhuǎn)染72 h，收集各組細胞1×106個，PBS洗滌2次，1 100×g離心5 min，70%冷乙醇4 ℃固定2 h，PBS洗2 次，30 mg/L RNAse A 37 ℃孵育30 min，50 mg/L PI避光孵育30 min，冷PBS洗2次，600 μL PBS重懸細胞，Accuri C6流式細胞儀檢測，隨機收集30 000個細胞，采集信號，采用ModFit 4.1流式數(shù)據(jù)分析軟件進行數(shù)據(jù)分析。

4 統(tǒng)計學(xué)處理

用GraphPad Prism 7軟件進行統(tǒng)計學(xué)處理，數(shù)據(jù)采用平均數(shù)±標準誤(mean±SEM)表示，兩組間比較采用獨立樣本t檢驗，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié) 果

1 敲減STAT3基因表達的效果

50 nmol/L siSTAT3或NC轉(zhuǎn)染胰腺祖細胞48 h和72 h后，分別提取RNA和蛋白，通過qPCR和Western blot檢測siRNA對STAT3基因的沉默效果。與對照組相比，實驗組胰腺祖細胞STAT3的mRNA和蛋白表達水平明顯下調(diào)(P<0.05)，mRNA的表達水平降低了(49.75±0.03)%，蛋白的表達水平降低了(78.62±0.08)%，見圖1。

Figure 1. The relative expression ofSTAT3gene in the pancrea-tic progenitor cells transfected withSTAT3siRNA. A: the mRNA expression of STAT3 was detected by qPCR after transfection for 48 h; B: the protein expression of STAT3 was determined by Western blot after transfection for 72 h. Mean±SEM.n=3.**P<0.01vsNC group.

圖1 轉(zhuǎn)染STAT3siRNA后胰腺祖細胞STAT3基因表達水平的變化

2 敲減STAT3基因表達對胰腺祖細胞增殖和活力的抑制作用

細胞轉(zhuǎn)染后，倒置顯微鏡下觀察，轉(zhuǎn)染72 h后，采集細胞圖像結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染STAT3siRNA的胰腺祖細胞孔板中細胞密度降低，見圖2A；活細胞計數(shù)結(jié)果顯示，敲減STAT3基因的表達使細胞數(shù)量減少了(45.62±0.03)%(P<0.01)，見圖2B。CCK8法檢測結(jié)果顯示敲減STAT3基因的表達使胰腺祖細胞活力減少了(43.68±0.05)%(P<0.05)，見圖2C。

Figure 2. The effects ofSTAT3silencing on the proliferation and viability of pancreatic progenitor cells. A: the images of cells under the inverted optical microscope after transfection for 72 h (×100); B: the effect ofSTAT3silencing on the proliferation of pancreatic progenitor cells was detected by cell counting after transfection for 72 h; C: the effect ofSTAT3silencing on the viability of pancreatic progenitor cells was measured by CCK8 assay after transfection for 72 h. Mean±SEM.n=3.*P<0.05,**P<0.01vsNC group.

圖2 沉默STAT3對胰腺祖細胞增殖和活力的影響

3 敲減STAT3的表達對胰腺祖細胞細胞周期分布的影響

細胞轉(zhuǎn)染72 h，經(jīng)流式細胞術(shù)檢測細胞周期分布。與對照組相比，轉(zhuǎn)染siSTAT3干擾片段的胰腺祖細胞其周期阻滯在G0/G1期,見圖3。

4 敲減STAT3的表達對CCND2蛋白表達的影響

細胞轉(zhuǎn)染72 h，Western blot 檢測結(jié)果可見轉(zhuǎn)染siSTAT3的胰腺祖細胞中CCND2蛋白表達水平明顯降低(P<0.05)，見圖4。

討 論

糖尿病發(fā)病率呈逐年上升趨勢，利用胚胎、多能性、成體干細胞誘導(dǎo)生成分泌胰島素的細胞是糖尿病干細胞治療的主要研究方向，激活內(nèi)源胰腺干/祖細胞生成功能細胞，將是一種更為有效和安全的治療方案，然而成體胰腺干/祖細胞數(shù)量少且常處于靜息狀態(tài)，因此，探究胰腺干/祖細胞的增殖機制具有重要的科學(xué)意義。研究表明，STAT3 在不同類型的細胞和組織中廣泛表達，參與細胞生長和凋亡等功能的調(diào)控，本研究利用RNAi技術(shù)成功敲減胰腺祖細胞STAT3基因表達，細胞計數(shù)和CCK8檢測結(jié)果表明，敲減STAT3抑制胰腺祖細胞增殖和細胞活力。

Figure 3. The effects ofSTAT3silencing on the cell cycle distribution of pancreatic progenitor cells were analyzed by flow cytometry after transfection for 72 h. Mean±SEM.n=3.*P<0.05,**P<0.01vsNC group.

圖3 流式細胞術(shù)檢測沉默STAT3對胰腺祖細胞細胞周期分布的影響

Figure 4. The effects ofSTAT3silencing on the protein expression of CCND2 in the pancreatic progenitor cells after transfection for 72 h. Mean±SEM.n=3.*P<0.05vsNC group.

圖4 沉默STAT3對胰腺祖細胞CCND2表達的影響

STAT3 是轉(zhuǎn)錄激活因子家族成員之一，在多種信號分子刺激下，STAT3被磷酸化激活，結(jié)合于靶基因DNA調(diào)控區(qū)，調(diào)控功能基因表達。STAT3活化后可通過激活其靶基因MYC原癌基因、細胞周期蛋白D1(cyclin D1，CCND1)、CCND2、存活蛋白(survivin)、基質(zhì)金屬蛋白酶2(matrix metalloproteinase-2，MMP2)、p21、p27等，調(diào)控細胞增殖、細胞周期進程、遷移、侵襲和凋亡[11-12]。通過慢病毒介導(dǎo)的短發(fā)夾RNA(short hairpin RNA，shRNA)沉默STAT3基因表達，可降低survivin基因表達，抑制成牙骨質(zhì)細胞分化，誘導(dǎo)細胞凋亡[13]。人工合成STAT3蛋白抗體SBT-100特異性抑制磷酸化STAT3功能，可抑制乳腺癌細胞增殖[14]；siRNA沉默STAT3基因表達可降低survivin和CCND1表達，抑制白細胞介素17(interleukin-17，IL-17)對人角質(zhì)形成細胞增殖的誘導(dǎo)作用[15]。研究表明，STAT3還通過調(diào)控下游基因表達影響干細胞增殖、自我更新和分化[16]。已報道，減弱JAK/STAT3信號活性抑制骨髓基質(zhì)細胞增殖和成骨分化[17]。激活STAT3基因，促進小鼠胚胎干細胞多潛能性調(diào)控因子MYC和Bcl-3表達，有利于維持細胞自我更新特性[18-19]。STAT3促進CD24、CD34、CD38、CD44、CD90和CD133等腫瘤干細胞標志性基因表達[20]，STAT3與CD44形成二聚物并乙酰化，入核后結(jié)合CCND2、MYC和TWIST1基因啟動子，激活細胞周期調(diào)控基因表達[21-22]。本研究顯示，在胰腺祖細胞中敲減STAT3基因可降低CCND2蛋白表達，使細胞周期進程阻滯在G0/G1期，抑制胰腺祖細胞細胞增殖。這表明，STAT3基因通過調(diào)控細胞周期蛋白CCND2的表達調(diào)控胰腺祖細胞增殖。

STAT3磷酸化能被多種途徑激活。EGF、血管內(nèi)皮生長因子等與相應(yīng)受體結(jié)合，使受體磷酸化，利用其內(nèi)源性酪氨酸激酶活性直接磷酸化STAT3；IL-6等細胞因子與細胞膜上相應(yīng)受體結(jié)合，募集JAK使受體的酪氨酸殘基磷酸化，募集STAT3并使其磷酸化。 研究表明，EGF是小鼠和人胚胎胰腺祖細胞、小鼠成體胰腺祖細胞維持體外增殖、自我更新和誘導(dǎo)分化的必需因子，用缺乏EGF的培養(yǎng)液培養(yǎng)胰腺祖細胞，使細胞增殖速度減慢[23-24]。EGF與其受體EGFR結(jié)合，使受體磷酸化，激活促進細胞增殖和細胞存活的信號通路，如JAK/STAT3、絲裂原活化蛋白激酶/細胞外信號調(diào)節(jié)激酶(mitogen-activated protein kinase/extracellular signal-regulated kinase，MAPK/ERK)和磷酯酰肌醇3-激酶/蛋白激酶B(phosphatidylinositol 3-kinase/protein kinase B，PI3K/AKT)信號通路。我們推測，敲減STAT3基因表達可能阻斷了上游EGFR/JAK/STAT3信號通路的傳導(dǎo)作用，從而抑制細胞增殖。

STAT3已成為轉(zhuǎn)錄因子、微小RNA(microRNA，miRNA)、長鏈非編碼RNA(long non-coding RNA，lncRNA)、小分子抑制劑和藥物調(diào)控細胞功能的靶點，如抗腫瘤藥CDK5抑制劑Roscovitine對大鼠血管平滑肌細胞增殖的抑制作用，以及l(fā)ncARSR(lncRNA activated in renal cell carcinoma with sunitinib resis-tance)對肝癌干細胞增殖的促進作用是通過調(diào)控STAT3途徑實現(xiàn)的[25-26]。STAT3信號通路在胰腺癌、胰腺炎和糖尿病并發(fā)癥中發(fā)揮重要功能，STAT3信號通路可能成為胰腺疾病治療的靶點。本研究揭示了STAT3調(diào)控胰腺祖細胞增殖的機制，為利用胰腺干/祖細胞開展疾病治療提供了實驗依據(jù)。