血必凈通過(guò)激活PI3K/Akt/mTOR信號(hào)通路減輕大鼠睪丸缺血再灌注損傷*

施 源， 李宏軍， 王君君， 李 堅(jiān)， 鄧新超， 魯 密， 張 輝

(武漢市第八醫(yī)院， 湖北 武漢 430010)

睪丸扭轉(zhuǎn)是泌尿外科中常見(jiàn)的臨床急癥之一，常為單側(cè)，主要表現(xiàn)為睪丸連同精索和附睪發(fā)生旋轉(zhuǎn)，精索內(nèi)血流不暢導(dǎo)致睪丸缺血，睪丸內(nèi)細(xì)胞凋亡等，最終易導(dǎo)致患者生殖能力受損或缺失，多發(fā)生于幼兒和青少年時(shí)期[1-2]。睪丸扭轉(zhuǎn)后出現(xiàn)缺血再灌注(ischemia/reperfusion，I/R)損傷是睪丸損傷的主要病理生理過(guò)程，其可使睪丸生殖細(xì)胞凋亡增加，最終導(dǎo)致睪丸萎縮和精子生發(fā)功能障礙[3-4]。因此，發(fā)生睪丸扭轉(zhuǎn)后盡早進(jìn)行手術(shù)恢復(fù)睪丸血供并配合有效的藥物保護(hù)可減輕其損傷。血必凈(Xuebijing，XBJ)注射液是一種中藥復(fù)方靜脈制劑，其具有拮抗內(nèi)毒素、抗炎癥、抗氧化以及改善微循環(huán)等多種功能[5-6]。已有研究表明，血必凈能減輕I/R損傷[7-8]。但血必凈對(duì)睪丸扭轉(zhuǎn)引起的I/R損傷的具體作用和相關(guān)機(jī)制還未見(jiàn)報(bào)道。因此，本研究旨在探討血必凈對(duì)大鼠睪丸扭轉(zhuǎn)復(fù)位I/R損傷的作用和相關(guān)機(jī)制，為臨床治療睪丸扭轉(zhuǎn)，減輕睪丸I/R損傷提供一定的理論依據(jù)。

材 料 和 方 法

1 實(shí)驗(yàn)材料與試劑

健康雄性SD大鼠購(gòu)自湖北省疾控中心(合格證號(hào)：No.42000600023890)，體質(zhì)量(200±20)g。地塞米松(dexamethasone, Dex)購(gòu)自Sigma；血必凈注射液購(gòu)自天津紅日藥業(yè)股份有限公司；蘇木素-伊紅(hematoxylin-eosin,HE)染色試劑盒購(gòu)自碧云天生物技術(shù)公司；丙二醛(malondialdehyde，MDA)、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)、一氧化氮(nitric oxide，NO)和內(nèi)皮素1(endothelin-1，ET-1)檢測(cè)試劑盒購(gòu)自南京建成生物工程研究所；兔抗人p53多克隆抗體、兔抗人cyclin D1單克隆抗體、兔抗人cyclin依賴性激酶2(cyclin-dependent kinase 2, CDK2)單克隆抗體、兔抗人cyclin B1單克隆抗體、兔抗人cleaved caspase-3多克隆抗體、兔抗小鼠Fas多克隆抗體、兔抗人FasL多克隆抗體、兔抗人Bax多克隆抗體、兔抗人Bcl-2多克隆抗體、兔抗大鼠PI3K單克隆抗體、兔抗人p-PI3K多克隆抗體、兔抗人AKT多克隆抗體、兔抗人p-AKT多克隆抗體、兔抗人mTOR多克隆抗體、兔抗人p-mTOR單克隆抗體、兔抗人S6K單克隆抗體和兔抗人p-S6K多克隆抗體均購(gòu)自Abcam；兔抗人GAPDH多克隆抗體購(gòu)自Proteintech；HRP標(biāo)記的山羊抗兔IgG購(gòu)自Bioswamp；二辛可寧酸(bicinchoninic acid，BCA)法蛋白質(zhì)定量試劑盒購(gòu)自上海碧云天生物技術(shù)有限公司。

2 主要方法

2.1動(dòng)物模型建立與分組 45只大鼠隨機(jī)分為5組：對(duì)照(control)組、模型(I/R)組、血必凈低劑量(XBJ at low dose, XBJ-LD)組、血必凈高劑量(XBJ at high dose, XBJ-HD)組和地塞米松(Dex)組，每組9只。所有大鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后進(jìn)行動(dòng)物實(shí)驗(yàn)，除對(duì)照組大鼠外，其它4組大鼠均采用Turner法構(gòu)建睪丸扭轉(zhuǎn)模型[9]，具體操作如下：采用3%戊巴比妥鈉(30 mg/kg)腹腔注射麻醉大鼠，取大鼠仰臥位，固定四肢及頭部，采用常規(guī)備皮、乙醇消毒，取左側(cè)陰囊切口約3 cm，逐層切開(kāi)皮膚、皮下組織及肉膜，從切口擠出左側(cè)睪丸并游離，分離筋膜至附睪，結(jié)扎并切斷睪丸引帶，順時(shí)針扭轉(zhuǎn)睪丸720°，維持1 h后復(fù)位并于陰囊壁固定，關(guān)閉切口。低劑量和高劑量組大鼠在睪丸扭轉(zhuǎn)手術(shù)后分別按照0.5 mL·kg-1·d-1和2 mL·kg-1·d-1的劑量腹腔注射血必凈注射液；地塞米松組大鼠術(shù)后腹腔注射0.5 mL·kg-1·d-1地塞米松；每日給藥1次。對(duì)照組采用相同的方式切開(kāi)陰囊皮膚，不進(jìn)行睪丸扭轉(zhuǎn)，術(shù)后注射相同體積的生理鹽水。

2.2標(biāo)本的采集 分別于給藥3、7、14 d后，每組隨機(jī)處死3只大鼠，取各組大鼠的左側(cè)睪丸組織，將所有睪丸標(biāo)本沿中軸切開(kāi)分兩部分，分別置于-80 ℃冰箱中保存。

2.3HE染色 將睪丸組織置于10%中性甲醛溶液中固定24 h，常規(guī)石蠟包埋后連續(xù)切片，設(shè)定切片厚度為4 μm，水浴展片和高溫烤片后，通過(guò)常規(guī)脫蠟至水后進(jìn)行HE染色，最后采用封片處理，光學(xué)顯微鏡后觀察各組大鼠睪丸組織的病理組織學(xué)變化。

2.4生化檢測(cè) 將收集的睪丸組織進(jìn)行勻漿，3 000 r/min離心10 min，收集上清，分別采用硫代巴比妥酸法檢測(cè)MDA含量，采用羥胺法測(cè)定SOD活性，采用硝酸還原酶法檢測(cè)NO含量，采用放射免疫分析法檢測(cè)ET-1含量，具體操作依據(jù)試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行。

2.5Western blot實(shí)驗(yàn) 將保存于-80 ℃的各組大鼠的睪丸采用RIPA裂解液提取組織蛋白，采用BCA法測(cè)定蛋白濃度，每孔上樣30 μL蛋白樣品，采用12%的SDS-PAGE進(jìn)行凝膠電泳分離后，轉(zhuǎn)印至PVDF膜上，使用5%脫脂奶粉進(jìn)行室溫封閉1 h，經(jīng)TBST洗滌后分別加入一抗，4 ℃孵育過(guò)夜；TBST再次洗滌后，加入特異性 II 抗IgG，進(jìn)行室溫孵育1 h，洗膜，ECL化學(xué)發(fā)光試劑對(duì)其曝光顯影，拍照保存。每組實(shí)驗(yàn)進(jìn)行3次重復(fù)。

3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS 22.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示，多組間比較采用單因素方差分析，均數(shù)間兩兩比較采用SNK-q檢驗(yàn)。以P<0.05表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 血必凈減輕I/R大鼠的睪丸損傷

各組大鼠睪丸組織的HE染色結(jié)果顯示，對(duì)照組睪丸曲細(xì)精管排列緊密，生殖細(xì)胞排列有序，結(jié)構(gòu)層次清晰；I/R模型組睪丸曲細(xì)精管排列疏松，生殖細(xì)胞排列紊亂，細(xì)胞明顯減少、脫落；隨著作用時(shí)間的增加，XBJ低劑量組和高劑量組以及地塞米松組均可見(jiàn)生精細(xì)胞排列逐漸恢復(fù)正常，細(xì)胞層次逐漸清晰明了，少數(shù)腔內(nèi)可見(jiàn)脫落細(xì)胞，其中高劑量組病理改善效果較低劑量更為顯著,見(jiàn)圖1。上述結(jié)果表明血必凈減輕I/R大鼠睪丸損傷的作用具有時(shí)間依賴性和劑量依賴性。

2 血必凈改變I/R大鼠睪丸中MDA、SOD、ET-1和NO的水平

生化檢測(cè)結(jié)果顯示,與對(duì)照組比較，I/R模型組大鼠睪丸組織中的SOD活性顯著降低，MDA、ET-1和NO的含量顯著增加(P<0.05)；與I/R組比較，血必凈低劑量組、高劑量組以及地塞米松組大鼠睪丸組織中的SOD含量明顯升高，MDA、ET-1和NO的含量降低(P<0.05),見(jiàn)表1、2。這些結(jié)果表明，血必凈可升高I/R大鼠睪丸組織中SOD活性，降低MDA、ET-1和NO含量，抑制I/R損傷組織中的氧化應(yīng)激。

Figure 1. The pathological changes of the rat testis in each group (HE staining, ×200).

圖1 各組大鼠睪丸的病理變化觀察

表1 各組大鼠不同時(shí)點(diǎn)睪丸組織中MDA含量和SOD活性的比較

*P<0.05vscontrol group;#P<0.05vsI/R group;&P<0.05vsXBJ-LD group;▲P<0.05vsthe same group at 3 d;■P<0.05vsthe same group at 7 d.

表2 各組大鼠不同時(shí)點(diǎn)睪丸組織中ET-1和NO含量的比較

*P<0.05vscontrol group;#P<0.05vsI/R group;&P<0.05vsXBJ-LD group;▲P<0.05vsthe same group at 3 d;■P<0.05vsthe same group at 7 d.

3 血必凈對(duì)I/R損傷睪丸細(xì)胞周期相關(guān)蛋白的影響

同一時(shí)點(diǎn)，與對(duì)照組比較，I/R模型組大鼠睪丸組織中CDK2、cyclin B1、cyclin D1和cyclin E的表達(dá)水平顯著降低，p53的表達(dá)水平顯著升高；與I/R組比較，血必凈低劑量組、高劑量組以及地塞米松組大鼠睪丸組織中CDK2、cyclin B1、cyclin D1和cyclin E的表達(dá)水平顯著升高，p53的表達(dá)水平顯著降低，且血必凈高劑量組的效果更顯著。與第3天相比，血必凈低劑量組和高劑量組及地塞米松組第7天和14天大鼠的CDK2、cyclin B1、cyclin D1和cyclin E的表達(dá)水平顯著升高，p53的表達(dá)水平顯著降低，且呈時(shí)間依賴性(P<0.05),見(jiàn)圖2。

Figure 2. The expression of cell cycle-related proteins in the rat testicular tissues of each group detected by Western blot. Mean±SD.n=9.*P<0.05vscontrol group at 3 d;#P<0.05vsI/R group；▲P<0.05vsthe same group at 3 d.

圖2 Western blot檢測(cè)各組大鼠睪丸組織中細(xì)胞周期相關(guān)蛋白的表達(dá)

4 血必凈對(duì)I/R損傷睪丸凋亡相關(guān)蛋白的影響

同一時(shí)點(diǎn)，與對(duì)照組比較，I/R組大鼠睪丸組織中cleaved caspase-3、Bax、Fas和FasL的蛋白水平顯著升高，Bcl-2的表達(dá)水平顯著降低；與I/R模型組比較，血必凈低劑量組和高劑量組以及地塞米松組大鼠睪丸組織中cleaved caspase-3、Bax、Fas和FasL的蛋白水平顯著降低，Bcl-2的表達(dá)水平顯著升高，且血必凈高劑量組的效果更顯著(P<0.05),見(jiàn)圖3。與第3天相比，血必凈低劑量組和高劑量組及地塞米松組第7天和14天大鼠的cleaved caspase-3、Bax、Fas和FasL的蛋白水平顯著降低，Bcl-2的表達(dá)水平顯著升高，且呈時(shí)間依賴性。這些結(jié)果表明，血必凈能夠降低I/R大鼠睪丸生殖細(xì)胞的凋亡水平，其效應(yīng)呈時(shí)間依賴性和劑量依賴性。

5 血必凈對(duì)I/R大鼠睪丸組織中PI3K/Akt/mTOR信號(hào)通路相關(guān)蛋白的影響

同一時(shí)點(diǎn)，與對(duì)照組比較，I/R模型組大鼠睪丸組織中p-PI3K、p-AKT、p-mTOR和p-S6K的蛋白水平顯著降低；與I/R組比較，血必凈低劑量組和高劑量組以及地塞米松組大鼠睪丸組織中p-PI3K、p-AKT、p-mTOR和p-S6K的蛋白水平顯著升高，且血必凈高劑量組的效果更顯著。與第3天相比，血必凈低劑量組和高劑量組及地塞米松組第7天和14天大鼠的p-PI3K、p-AKT、p-mTOR和p-S6K的蛋白水平顯著升高，其效應(yīng)呈時(shí)間依賴性(P<0.05)，見(jiàn)圖4。

Figure 3. The protein levels of apoptosis-related molecules in the rat testicular tissues of each group detected by Western blot. Mean±SD.n=9.*P<0.05vscontrol group at 3 d;#P<0.05vsI/R group;▲P<0.05vsthe same group at 3 d.

圖3 Western blot檢測(cè)各組大鼠睪丸組織中凋亡相關(guān)蛋白水平的變化

Figure 4. The protien levels of PI3K/Akt/mTOR signaling pathway-related molecules in the rat testicular tissues of each group detected by Western blot. Mean±SD.n=9.*P<0.05vscontrol group at 3 d;#P<0.05vsI/R group;▲P<0.05vsthe same group at 3 d.

圖4 Western blot檢測(cè)各組大鼠睪丸組織中PI3K/Akt/mTOR信號(hào)通路相關(guān)蛋白水平的變化

討 論

發(fā)生睪丸扭轉(zhuǎn)后應(yīng)及時(shí)進(jìn)行復(fù)位手術(shù)以恢復(fù)睪丸供血，避免患者因睪丸損傷或壞死而影響生育能力[10]。然而臨床和基礎(chǔ)研究均顯示睪丸扭轉(zhuǎn)復(fù)位也是一種I/R過(guò)程，睪丸缺血恢復(fù)供氧后可引起活性氧簇(reactive oxygen species，ROS)過(guò)度生成，同時(shí)產(chǎn)生高濃度的活性氮基團(tuán)，導(dǎo)致細(xì)胞凋亡增加，引起睪丸損傷以及生精功能障礙。血必凈是在中醫(yī)中藥理論的指導(dǎo)下由多種傳統(tǒng)中草藥研制而成的，主要包含紅花、當(dāng)歸、川穹、丹參以及赤芍等，具有活血化瘀、抗炎、抗氧化、增強(qiáng)免疫力、清熱解毒等作用[7-8]，對(duì)膿毒癥、重度肺炎、全身炎癥反應(yīng)綜合征以及I/R損傷等均具有一定的治療作用[10-13]。本研究構(gòu)建大鼠睪丸扭轉(zhuǎn)復(fù)位模型，結(jié)果表明血必凈可明顯減輕大鼠睪丸扭轉(zhuǎn)復(fù)位的I/R損傷，且其作用具有時(shí)間依賴性和劑量依賴性。

ROS通過(guò)攻擊生物膜上的不飽和脂肪酸，引發(fā)脂質(zhì)過(guò)氧化作用而產(chǎn)生MDA，且過(guò)量的活性氧可以氧化脂質(zhì)、細(xì)胞膜蛋白和DNA，導(dǎo)致一系列細(xì)胞功能障礙或凋亡，進(jìn)一步加劇缺血性睪丸的組織損傷[14-15]。SOD參與細(xì)胞生長(zhǎng)分化，其可通過(guò)催化超氧自由基發(fā)生歧化反應(yīng)來(lái)避免細(xì)胞受損，其抗氧化能力可有效減輕睪丸I/R損傷[16-17]。武志剛等[18]的研究表明他達(dá)拉非可明顯減輕大鼠睪丸扭轉(zhuǎn)復(fù)位的I/R損傷，顯著升高I/R大鼠睪丸組織的SOD水平，而顯著降低MDA水平。ET-1/NO是一對(duì)血管活性物質(zhì)，共同參與調(diào)節(jié)血管張力。ET是一種強(qiáng)效的縮血管物質(zhì)，主要由血管內(nèi)皮細(xì)胞合成分泌，廣泛分布于神經(jīng)系統(tǒng)中，生理狀態(tài)下，低濃度的ET-1可選擇性地激動(dòng)ETB受體，擴(kuò)張睪丸血管，參與調(diào)節(jié)睪丸血流。睪丸缺血再灌注后，局部組織高濃度的ET-1使血管發(fā)生強(qiáng)烈、長(zhǎng)時(shí)間的收縮，從而加重局部缺血反應(yīng)[19]。NO參與調(diào)節(jié)多種生理病理過(guò)程，對(duì)各種生殖活動(dòng)起重要作用，低濃度NO可刺激睪酮分泌，過(guò)量的NO可導(dǎo)致生精功能障礙而引起不育[20]。本研究結(jié)果表明血必凈可升高I/R大鼠睪丸組織中SOD活性，降低MDA、ET-1和NO含量，抑制I/R損傷組織中的氧化應(yīng)激。

細(xì)胞凋亡在維持精子發(fā)生的動(dòng)態(tài)平衡中具有重要作用，睪丸扭轉(zhuǎn)復(fù)位I/R可促進(jìn)同側(cè)睪丸細(xì)胞凋亡的發(fā)生，且凋亡的程度與缺血時(shí)間有關(guān)[21]。促凋亡因子Bax和抗凋亡因子Bcl-2是一對(duì)關(guān)系密切的凋亡相關(guān)基因，caspase-3是介導(dǎo)細(xì)胞凋亡的關(guān)鍵效應(yīng)分子，其對(duì)細(xì)胞凋亡的調(diào)控具有重要作用[22]。PI3K/Akt/mTOR信號(hào)通路參與了細(xì)胞增殖、分化、凋亡等生物學(xué)過(guò)程，并與ROS介導(dǎo)的信號(hào)傳導(dǎo)密切相關(guān)，當(dāng)細(xì)胞出現(xiàn)氧化應(yīng)激損傷時(shí)，可通過(guò)激活PI3K/Akt/mTOR信號(hào)通路保護(hù)細(xì)胞[23-25]。研究發(fā)現(xiàn)，PI3K/Akt/mTOR通路激活后可抑制肝臟氧化應(yīng)激反應(yīng)，從而減緩肝臟IR后的細(xì)胞凋亡[26]。PI3K/Akt/mTOR信號(hào)通路可調(diào)控睪丸組織發(fā)育、精原干細(xì)胞增殖分化以及精子發(fā)生等過(guò)程，通過(guò)抑制mTORC1通路可誘導(dǎo)未分化精原細(xì)胞在生精小管內(nèi)累積并阻斷精原細(xì)胞分化[27]。本研究結(jié)果表明血必凈能夠通過(guò)介導(dǎo)細(xì)胞周期和細(xì)胞凋亡相關(guān)因子的表達(dá)，激活PI3K/Akt/mTOR信號(hào)通路來(lái)明顯減輕睪丸扭轉(zhuǎn)大鼠的I/R損傷睪丸組織的病理?yè)p傷，且其作用效果呈劑量依賴性和時(shí)間依賴性。

綜上所述，本研究表明血必凈可有效減輕大鼠睪丸缺血再灌注后睪丸的病理?yè)p傷，降低大鼠睪丸組織的氧化應(yīng)激反應(yīng)損傷，其作用機(jī)制可能與激活PI3K/Akt/mTOR信號(hào)通路來(lái)實(shí)現(xiàn)的，且血必凈的作用效果呈劑量依賴性和時(shí)間依賴性。本研究結(jié)果將為臨床應(yīng)用血必凈治療睪丸扭轉(zhuǎn)，減輕患者的睪丸損傷提供一定的理論依據(jù)。