IL-1、IL-10及TNF-β單核苷酸多態(tài)性與福建泉州地區(qū)漢族人群類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的相關(guān)性研究*

張淑花， 楊會勇， 鄭晨娜， 蔡志謀， 沈曉麗

(1福建省泉州市鯉城區(qū)江南街道社區(qū)衛(wèi)生服務(wù)中心檢驗(yàn)科, 2華僑大學(xué)生物醫(yī)學(xué)學(xué)院, 3福建醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院神經(jīng)外科，福建 泉州 362000; 4福建醫(yī)科大學(xué)省立臨床醫(yī)學(xué)院,福建省心血管病重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 福建 福州 350001)

風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎(rheumatoid arthritis, RA)是一種自身免疫性疾病，其在我國的發(fā)病率約為0.4%[1]。RA免疫發(fā)病機(jī)制主要涉及多種免疫細(xì)胞及免疫分子之間的相互影響和相互作用[2]，從本質(zhì)上來說，RA的發(fā)生是由于體內(nèi)免疫機(jī)制平衡被打破，從而導(dǎo)致一些炎癥細(xì)胞因子如白細(xì)胞介素1(interlenkin-1, IL-1)、IL-10和腫瘤壞死因子β(tumor necrosis factor β, TNF-β)等的比例失衡。如果能夠從分子生物學(xué)和遺傳學(xué)角度進(jìn)一步了解RA的發(fā)病機(jī)制，那將為RA等非可控炎癥精準(zhǔn)治療方案的制定和特效藥物的研制提供支持。

目前研究認(rèn)為，單核苷酸多態(tài)性(single nudeotide polymorphism,SNP)多與復(fù)雜性疾病發(fā)病有很大相關(guān)性[3-4]，其中遺傳與環(huán)境因素是RA發(fā)生的主要原因，在不同地區(qū)的人群之間具有遺傳差異性[5]。本研究以福建泉州地區(qū)漢族人群為研究對象，探討IL-1β、IL-10及TNF-β等炎癥相關(guān)因子5個(gè)SNP位點(diǎn)的分布特征，研究其與RA易感性的關(guān)系。由于當(dāng)前研究多數(shù)關(guān)注單個(gè)SNP位點(diǎn)對RA發(fā)病的影響及相關(guān)分子機(jī)制[6]，鑒于炎癥相關(guān)因子多SNP位點(diǎn)可能存在著相互影響，本研究對RA炎癥相關(guān)因子的多SNP位點(diǎn)進(jìn)行連鎖不平衡與單倍型聯(lián)合分析，為RA的分子生物學(xué)發(fā)病機(jī)制及福建泉州地區(qū)漢族人群RA的基因遺傳背景提供依據(jù)。

材 料 和 方 法

1 研究對象

RA組：自2014年6月～2016年6月期間，在福建泉州地區(qū)漢族人群中，于泉州正骨醫(yī)院和江南醫(yī)院門診或住院部抽取155 例(女性107例，男性48例)、平均年齡(50.3±10.8)歲的RA患者(籍貫為泉州)，所選樣本個(gè)體均符合美國風(fēng)濕病學(xué)會(ACR)和歐洲抗風(fēng)濕聯(lián)盟(RULAR)2009年最新RA診斷標(biāo)準(zhǔn)[7]。

健康對照(control)組：與RA組同時(shí)段、同地點(diǎn)抽取門診健康體檢者(籍貫為泉州)170 例(女性122例，男性48例)，平均年齡(41.5±20.4)歲，血常規(guī)、血脂及其它生化指標(biāo)均在參考范圍內(nèi)，心電圖檢查正常，排除肝臟、腎臟、內(nèi)分泌和心腦血管疾病，無腫瘤病史和臨床特征，無遺傳疾病，無自身免疫性疾病和傳染性疾病。該研究通過福建省泉州市正骨醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)，且所有參與者均遵循“知情同意”原則。

2 方法

2.1外周血DNA提取 所有采集到的受試者EDTA、肝素或枸櫞酸鈉抗凝外周血5 mL，均預(yù)分裝200 μL于1.5 mL離心管用于全血DNA的提取。利用全血DNA提取試劑盒(北京三博遠(yuǎn)志生物技術(shù)有限責(zé)任公司)，按照產(chǎn)品說明書提取基因組DNA，并調(diào)整最終DNA濃度為50 mg/L，置4 ℃中保存。

2.2SNP位點(diǎn)選取 通過對炎癥信號通路因子基因文獻(xiàn)的查閱[8-9]，選擇了與RA相關(guān)的3個(gè)炎癥細(xì)胞因子(IL-1β、TNF-β和IL-10)的5個(gè)SNP位點(diǎn)(IL-10rs1800893、IL-1β rs16944、IL-1β rs1143623、TNF-β rs2009658和TNF-β rs1041981)，進(jìn)行與RA易感性的相關(guān)性分析。

2.3基因型分析 用軟件Primer 5.0分別設(shè)計(jì)本研究所需要的3條引物(具體序列見表1)，其中特異性引物的3′-末端核苷酸分別與SNP野生型和突變型等位基因特異互補(bǔ)，用來鑒別SNP 2種等位基因；在此基礎(chǔ)上設(shè)計(jì)1條可與此目標(biāo)SNP所有等位基因特異性引物配對的公共引物，進(jìn)行等位基因特異性PCR擴(kuò)增檢測。為提高擴(kuò)增特異性，在引物3’端倒數(shù)第3個(gè)堿基引入1個(gè)錯(cuò)配堿基。以外周血基因組DNA為模板進(jìn)行3引物擴(kuò)增。瓊脂糖凝膠電泳檢測，對條帶位置和數(shù)目進(jìn)行基因型分析。

F: forward; R: reverse.

3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

等位基因及基因型頻率用基因計(jì)數(shù)法統(tǒng)計(jì)。基因型的Hardy-Weinberg平衡符合程度用2檢驗(yàn)。組間基因型和等位基因頻率用2檢驗(yàn)或Fisher精確概率法檢驗(yàn)。符合正態(tài)分布的計(jì)量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示，計(jì)數(shù)資料以例數(shù)及百分?jǐn)?shù)(%)表示。兩組計(jì)量資料比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，計(jì)數(shù)資料的比較采用2檢驗(yàn)。兩個(gè)位點(diǎn)間的連鎖不平衡分析，計(jì)算D′及r2，非條件Logistic回歸模型分析類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎發(fā)病關(guān)聯(lián)強(qiáng)度，計(jì)算比值比(odds ratio，OR)及其95%可信區(qū)間(95%CI)。SHEsis軟件[10]進(jìn)行單體型分析。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；以O(shè)R>1為與RA正相關(guān)。應(yīng)用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析及兩組樣本間年齡、性別的校正。

結(jié) 果

1 三引物等位基因特異性擴(kuò)增(TRIP-ASPCR)基因分型與測序

隨機(jī)選取樣本通過TRIP-ASPCR確定基因分型，同時(shí)利用1對外引物進(jìn)行常規(guī)PCR擴(kuò)增，PCR產(chǎn)物直接進(jìn)行測序。測序結(jié)果與TRIP-ASPCR進(jìn)行比對，結(jié)果顯示TRIP-ASPCR的分型結(jié)果和測序分型結(jié)果完全一致,見圖1。

Figure 1. Genetypes of TNF-β, IL-10 and IL-1β loci. a-1： genotype CC of TNF-β (rs1041981); a-2： genotype AA of TNF-β (rs1041981); a-3： genotype AC of TNF-β (rs1041981); b-1： genotype GG of IL-10 (rs1800893); b-2: genotype CC of IL-10 (rs1800893); b-3: genotype GC of IL-10 (rs1800893); c-1： genotype GG of IL-1β (rs1143623); c-2： genotype AA of IL-1β (rs1143623); c-3： genotype AG of IL-1β (rs1143623).

圖1 TNF-β、IL-10和IL-1β基因位點(diǎn)基因型

2 SNP位點(diǎn)基因型分布的Hardy-weinberg平衡檢驗(yàn)

通過Hardy-Weinberg平衡檢驗(yàn)探討所選樣本基因分型在福建泉州地區(qū)漢族人群的分布特征，本研究對5個(gè)SNPs位點(diǎn)的基因分型結(jié)果進(jìn)行了Hardy-Weinberg平衡檢驗(yàn)。分析結(jié)果顯示，正常對照組TNF-β rs1041981的SNP位點(diǎn)符合Hardy-Weinberg平衡(P>0.05)，RA組IL-10 rs1800893的SNP位點(diǎn)RA組符合Hardy-Weinberg平衡(P>0.05)，抽取人群符合隨機(jī)性原則，可認(rèn)為具有群體代表性。

3 SNP位點(diǎn)基因型和等位基因頻率分布及其發(fā)病關(guān)聯(lián)強(qiáng)度分析

在Hardy-Weinberg平衡檢測的基礎(chǔ)上，開展5個(gè)SNP位點(diǎn)進(jìn)行基因型和等位基因頻率分布及其發(fā)病關(guān)聯(lián)強(qiáng)度分析，計(jì)算其OR，OR>1說明疾病的危險(xiǎn)度因暴露而增加，與疾病之間為“正”關(guān)聯(lián)，OR<1說明疾病的危險(xiǎn)度因暴露而減少，暴露與疾病之間為“負(fù)”關(guān)聯(lián)，OR=1說明疾病與暴露無關(guān)聯(lián)，見表2～3。

正常對照組與RA組rs1800893、rs16944、rs2009658和rs1041981位點(diǎn)的基因型分布頻率和等位基因分布頻率均存在顯著差異(P<0.05)。(1)rs1800893基因位點(diǎn)的 AA、GA和GG 3種基因型在正常對照組的分布頻率與RA組存在顯著差異 (P<0.05)；等位基因A和G在正常對照組的分布頻率與RA組存在顯著差異(P<0.05)，攜帶G等位基因型的個(gè)體發(fā)生RA的相對風(fēng)險(xiǎn)是為攜帶A等位基因型的1.678倍(P=0.005,OR=1.678,95%CI為1.167～2.412)。(2)rs16944基因位點(diǎn)的GG、GT和TT 3種基因型在正常對照組的分布頻率與RA組存在顯著差異 (P<0.05)；等位基因G和T在正常對照組的分布頻率與RA組亦存在顯著差異 (P<0.05)，攜帶G等位基因型的個(gè)體發(fā)生RA的相對風(fēng)險(xiǎn)是為攜帶T等位基因型的1.418倍(P=0.030, OR=1.418, 95%CI為1.030～1.953)。(3)rs2009658基因位點(diǎn)的CC、CG和GG 3種基因型在正常對照組的分布頻率與RA組具有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)；等位基因C和G在正常對照組的分布頻率與RA組亦具有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)，攜帶C等位基因型的個(gè)體發(fā)生RA的相對風(fēng)險(xiǎn)是為攜帶G等位基因型的10.67倍(P=0.000, OR=10.670, 95%CI為4.198～27.164)。(4)rs1041981基因位點(diǎn)的CC、CA和AA 3種基因型在正常對照組的分布頻率與RA組具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)；等位基因C和A在正常對照組的分布頻率分與RA組亦具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)，攜帶C等位基因型的個(gè)體發(fā)生RA的相對風(fēng)險(xiǎn)是為攜帶A等位基因型的1.533倍(P=0.015, OR=1.533, 95%CI為1.084-2.168)。

表2 兩組各SNPs多態(tài)性位點(diǎn)的基因型頻率分布

表3 兩組各SNPs多態(tài)性位點(diǎn)的等位基因頻率分布

4 SNP位點(diǎn)的連鎖不平衡檢驗(yàn)

IL-1β rs16944和IL-1β rs1143623位點(diǎn)間不存在連鎖不平衡(D′=0.121，r2=0.009)；TNF-β rs2009658和TNF-β rs1041981位點(diǎn)間不存在連鎖不平衡(D′=0.465，r2=0.003)。

5 SNP位點(diǎn)的單倍型分析

IL-1β rs16944和IL-1β rs1143623 位點(diǎn)組成的單倍型G-G、G-C、A-G、A-C在對照組和RA組的分布均不存在顯著差異(P>0.05)，見表4。

TNF-β rs2009658和TNF-β rs1041981 2個(gè)SNP位點(diǎn)組成的單倍型為C-C、C-G、A-C、A-G，其中A-C單倍型在對照組和RA組的分布存在差異(P<0.05)，其余單倍型均不存在差異，A-C與RA呈正相關(guān)，且相關(guān)性明顯，攜帶A-C單倍型的個(gè)體罹患RA的風(fēng)險(xiǎn)顯著增加(OR=1.443)，見表4。

表4 多位點(diǎn)單倍型分析

討 論

RA是一種自身免疫性疾病，患者關(guān)節(jié)等部位受到炎癥持續(xù)侵蝕，現(xiàn)有治療手段仍無法徹底治愈。炎癥相關(guān)因子上的單核苷酸多態(tài)性可能與非可控炎癥的發(fā)生、發(fā)展有著密切的關(guān)系。

IL-1是體內(nèi)最主要的炎癥介質(zhì)之一，能夠介導(dǎo)多種炎癥反應(yīng)。越來越多的研究已經(jīng)證實(shí)IL-1在RA發(fā)病的過程中具有非常重要的作用[11-12]。在RA病人的血液和關(guān)節(jié)滑膜液中均可以檢測到IL-1的表達(dá)升高，這就提示了IL-1與RA的關(guān)聯(lián)[13]。近年來研究發(fā)現(xiàn)IL-1存在多態(tài)現(xiàn)象，已有資料顯示IL-1基因多態(tài)性在決定RA的預(yù)后上起重要作用[14]。宋新強(qiáng)等[15]研究發(fā)現(xiàn)IL-1β+3954位點(diǎn)與豫南漢族人群的RA發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)關(guān)系密切，但關(guān)于IL-1β等SNP位點(diǎn)在福建泉州地區(qū)漢族人群與RA的相關(guān)性研究仍未見報(bào)道。而在2012年Lee等[16]進(jìn)行的薈萃分析中表明IL-10-1082G/A，IL-10-892C/T，IL-10-592C/A基因多態(tài)性與RA的易感性存在關(guān)聯(lián)，可見IL-10的SNP多態(tài)性與RA的遺傳易感性有關(guān)聯(lián)。

TNF-β是一種促炎因子，盡管目前對于TNF基因是否和RA易感性相關(guān)聯(lián)仍然存在爭議，但其表型在RA的發(fā)病機(jī)理和預(yù)后中扮演重要角色已得到肯定[17]。RA病人血液和滑膜液中TNF-β水平升高[18]，而關(guān)于TNF促進(jìn)炎癥反應(yīng)進(jìn)程的廣泛研究為TNF阻滯劑治療RA奠定了基礎(chǔ)，然而并不是所有的RA患者均能獲得良好的療效[19-21]。Kang等[22]研究表明，擁有TNF-857C/T SNP位點(diǎn)T基因型等位基因的患者對于依那西普的反應(yīng)要比C基因型等位基因的純合子患者要好，如果這些結(jié)論能夠得到進(jìn)一步證明，TNF-857C/T SNP將成為預(yù)測療效的一個(gè)有效遺傳標(biāo)記。本研究通過探討TNF-β rs2009658和TNF-β rs1041981與福建泉州地區(qū)漢族人群RA的相關(guān)性，以獲得福建泉州地區(qū)漢族人群的遺傳學(xué)數(shù)據(jù)，為研究RA的基因遺傳背景提供理論依據(jù)和分子生物學(xué)基礎(chǔ)資料。

本研究發(fā)現(xiàn)，IL-10 rs1800893、IL-1β rs16944、TNF-β rs2009658和TNF-β rs1041981等4個(gè)SNP位點(diǎn)的等位基因頻率在對照組和RA組間的分布差異存在統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，與RA相關(guān)性明顯，且呈正相關(guān)；其各位點(diǎn)分別對應(yīng)的等位基因G、G、C和C可能作為福建泉州地區(qū)漢族人群RA的一個(gè)潛在遺傳標(biāo)志。