circ_0000231在非小細胞肺癌中的表達及功能研究*

李紀鵬， 王建華

(寧波市鄞州人民醫(yī)院中心實驗室， 浙江 寧波 315040)

非小細胞肺癌(non-small-cell lung cancer, NSCLC)是全球范圍內(nèi)最常見的肺部惡性腫瘤，具有極高的發(fā)病率和死亡率，居所有的惡性腫瘤之首[1]。因此有必要進一步探索研究新基因的功能及其在肺癌惡性進展中的精確機制。環(huán)狀RNAs(circular RNAs，circRNAs)是一類不具有5′-末端帽子和3′-末端poly(A)尾巴，以共價鍵形成環(huán)形結(jié)構(gòu)的非編碼RNA分子[2-3]。最近的研究表明，circRNAs廣泛參與了包括腫瘤在內(nèi)的多種疾病的發(fā)生發(fā)展[4-7]。通過分析GSE104854 RNA-seq數(shù)據(jù)，我們發(fā)現(xiàn)環(huán)狀RNA_0000231 (circ_0000231)在肺腺癌中的表達顯著升高。circ_0000231位于Chr10： 32197099-32199491，全長794 nt，由ARHGAP12基因的第16和17號外顯子環(huán)化而成。通過查閱文獻，我們發(fā)現(xiàn)目前對circ_0000231的研究幾乎是空白的。因此，本研究將探討circ_0000231在NSCLC中的表達及功能。

材 料 和 方 法

1 細胞和主要試劑

人非小細胞肺癌細胞系 SPC-A1、A549、LTEP-A2、H1299 及正常人支氣管上皮細胞 BEAS-2B 均培養(yǎng)于含 10% 胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基中。收集60對在鄞州人民醫(yī)院接受手術(shù)患者的NSCLC組織和鄰近正常組織，所有標本一經(jīng)收集立即保存于-80 ℃條件下，待后續(xù)使用。本研究所有標本采集均經(jīng)過患者家屬簽署知情同意書，并經(jīng)本醫(yī)院倫理委員會審核通過。細胞培養(yǎng)基和胎牛血清購自Gibco；Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染試劑和TRIzol試劑購自Invitrogen；circ_0000231小干擾RNA序列(5′-ACUGAACAGAUAA-GGGUUUAA-3′)和陰性對照siRNA(negative control siRNA, NC)均為上海吉瑪公司產(chǎn)品；RT-qPCR引物由Invitrogen合成；RT-qPCR試劑購自Transgen；抗細胞周期蛋白D1(cyclin D1, CCND1)、Bcl-2和β-actin抗體購自Santa Cruz；CCK-8和Annexin V-FITC細胞凋亡檢測試劑盒購自碧云天生物公司。

2 方法

2.1細胞轉(zhuǎn)染 在轉(zhuǎn)染前 1 d，取生長狀態(tài)良好的細胞，用胰酶消化，細胞計數(shù)后，均勻鋪于細胞板。12～16 h后時進行轉(zhuǎn)染，轉(zhuǎn)染按照Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染試劑說明書進行。

2.2CCK-8法檢測細胞活力 取對數(shù)生長期的SPC-A1和H1299細胞，接種于96孔板，每孔2×103個細胞。分別轉(zhuǎn)染NC和si-circ_0000231，每組設(shè)置5個復(fù)孔。于轉(zhuǎn)染的0、24、48和72 h分別在每個孔中加入10 μL CCK-8溶液，在37 ℃下孵育2 h后，于450 nm處測量吸光度(A)值。

2.3集落形成實驗 各組細胞按照每孔1×103個細胞接種于6孔板，培養(yǎng)約2周后形成肉眼可見的細胞集落。PBS清洗3次，75%的乙醇固定后，用1%的結(jié)晶紫染色10 min，經(jīng)PBS清洗、晾干后拍照，計算集落形成數(shù)，每組設(shè)3個復(fù)孔。

2.4流式細胞術(shù)檢測細胞凋亡 按照凋亡檢測試劑盒說明書進行，轉(zhuǎn)染48 h后使用不含EDTA的胰酶消化SPC-A1和H1299細胞，用培養(yǎng)液終止消化，1 000 r/min 離心5 min，收集細胞，PBS清洗細胞2次，棄上清，加入195 μL Annexin V-FITC結(jié)合液輕輕重懸細胞，再加入5 μL Annexin V-FITC和10 μL PI 室溫避光染色20 min，然后通過流式細胞術(shù)分析凋亡率。

2.5RNA提取和RT-qPCR 轉(zhuǎn)染48 h后，采用TRIzol試劑提取總RNA，取總RNA 1 μg，按照Transgen試劑盒說明書進行cDNA合成，采用SYBR Green I熒光染料法完成qPCR。circ_0000231的正向引物序列為5′-ATTCCGCAGGAGAAGGCTCT-3′，反向引物序列為5′- GCTTAGAACAAGGAGATCTACACCA-3′;Bcl-2的正向引物為5′-ACGGTGGTGGAGGAGC-TCTT-3′，反向引物為5′-CGGTTGACGCTCTCCACAC-3′；CCND1的正向引物為5′-TGAGGGACGCTTTGTCTGTC-3′，反向引物為5′-GCCTTTGGCCTCTCG-ATACA-3′；GAPDH的正向引物為5′-CAATGACCCCTTCATTGACC-3′，反向引物為5′-TTGATTTTGGAGGGATCTCG-3′。采用GAPDH作為內(nèi)參照，通過2-ΔΔCt方法分析RNA的相對表達水平，實驗重復(fù)3次。

2.6Western blot法檢測蛋白的表達水平 轉(zhuǎn)染48 h后，收集細胞，運用總蛋白提取試劑盒提取總蛋白，經(jīng)10%SDS-PAGE分離后轉(zhuǎn)膜，將膜置于含5%脫脂奶粉的TBST緩沖液中，37 ℃封閉2 h。分別加入抗CCND1和Bcl-2單克隆抗體，在4 ℃下孵育過夜。1×TBST緩沖液洗膜，加辣根過氧化物酶標記的Ⅱ抗，于37 ℃下孵育2 h。1×TBST緩沖液洗膜，采用化學(xué)發(fā)光法檢測目的蛋白條帶。以β-actin作為內(nèi)參照。

3 統(tǒng)計學(xué)處理

采用SPSS 17.0統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)分析，數(shù)據(jù)結(jié)果以均數(shù)±標準差(mean±SD)表示，組間比較采用獨立樣本t檢驗，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié) 果

1 circ_0000231在NSCLC中表達上調(diào)

RT-qPCR檢測結(jié)果顯示，與正常肺上皮細胞BEAS-2B相比，circ_0000231在NSCLC細胞系(A549、LTEP-A2、H1299和SPC-A1)中有不同程度的表達上調(diào)(P<0.05),見圖1A。隨后我們評估了circ_0000231在NSCLC組織中的表達,結(jié)果顯示，與癌旁組織相比，circ_0000231的表達在NSCLC組織中顯著上調(diào)(P<0.01),見圖1B。這些結(jié)果表明circ_0000231可能在NSCLC中發(fā)揮癌基因作用。

2 沉默circ_0000231抑制NSCLC細胞的活力

由于circ_0000231在NSCLC中上調(diào)，我們使用小干擾RNA敲減circ_0000231的表達以評估其生物學(xué)功能。 首先，RT-qPCR檢測結(jié)果顯示circ_0000231小干擾RNA抑制效果顯著，見圖2A。 CCK-8實驗結(jié)果顯示轉(zhuǎn)染si-circ_0000231 72 h后SPC-A1細胞和H1299細胞的活力顯著低于對照組(P<0.05),見圖2B。

Figure 1. The circ_0000231 level was up-regulated in the NSCLC cells and tissues. A: circ_0000231 expression was assessed by RT-qPCR in 4 NSCLC cell lines and normal bronchial epithelial BEAS-2B cells; B: circ_0000231 expression was assessed in lung tissues of 60 NSCLC patients. circ_0000231 levels were normalized to GAPDH levels. Mean±SD.n=3.*P<0.05,**P<0.01vsBEAS-2B group;##P<0.01vspara-carcinoma group.

圖1 circ_0000231在NSCLC細胞和組織中的表達

Figure 2. The effect of si-circ_0000231 on NSCLC cell viability. A: specific siRNAs targeting circ_0000231 were transfected into SPC-A1 and H1299 cells; B: CCK-8 assay showed the cell viability in si-circ_0000231 group and NC group. Mean±SD.n=3.*P<0.05,**P<0.01vsNC group.

圖2 沉默circ_0000231對NSCLC細胞活力的影響

3 沉默circ_0000231抑制NSCLC細胞集落的形成

集落形成實驗結(jié)果顯示,與對照組相比，si-circ_0000231轉(zhuǎn)染組的細胞集落形成數(shù)顯著降低(P<0.01),見圖3。

4 沉默circ_0000231促進NSCLC細胞的凋亡

通過流式細胞術(shù)評估circ_0000231對NSCLC細胞凋亡的影響，結(jié)果顯示，在SPC-A1細胞和H1299細胞中si-circ_0000231組的凋亡率顯著高于對照組(P<0.01)，見圖4。

5 沉默circ_0000231影響CCND1和Bcl-2的表達

我們隨后檢測了細胞增殖和凋亡相關(guān)蛋白CCND1和bcl-2的表達，RT-qPCR和Western blot結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染si-circ_0000231后，CCND1和Bcl-2的mRNA和蛋白表達均受到不同程度的抑制(P<0.01),見圖5。

討 論

近年來， circRNAs已成為非編碼RNA(non-co-ding RNA, ncRNA)領(lǐng)域的重要研究對象。circRNAs最重要的2個特性是高度保守和非常穩(wěn)定，半衰期大于48 h[8-9],與其它非編碼RNA (如長鏈非編碼RNA和miRNA)相比，這些優(yōu)點為circRNAs成為理想的疾病診斷標志物提供了可能[10-12]。

目前報道最多的circRNAs功能模式是其作為miRNA海綿調(diào)控基因表達[13-14]，例如，環(huán)狀RNA CDR1as(也稱為ciRS-7)在其序列上有超過60個保守的miR-7結(jié)合位點，能夠影響miR-7靶標基因活性從而促進腫瘤惡性進展[15];Han等[16]報道, circMTO1 能夠吸附抑制miR-9從而抑制肝癌細胞增殖和侵襲;Zhu等[17]發(fā)現(xiàn)circ_0013958能夠促進肺癌細胞的增殖和侵襲，是肺癌早期診斷的標志物[17]。本研究中，我們通過RT-qPCR的檢測發(fā)現(xiàn)circ_0000231在NSCLC組織和細胞系中均有不同程度的表達上調(diào)，提示circ_0000231在NSCLC中可能發(fā)揮癌基因功能，是潛在的腫瘤標志物。隨后我們應(yīng)用小干擾RNA敲減circ_0000231表達后，通過CCK-8法、集落形成實驗和流式細胞術(shù)檢測細胞增殖、凋亡情況，結(jié)果顯示與對照組相比，si-circ_0000231組的細胞活力受到抑制、細胞集落形成數(shù)減少而凋亡增加，這些結(jié)果表明沉默circ_0000231可顯著抑制NSCLC惡性增殖的生物學(xué)表型。

Figure 3. The effect of si-circ_0000231 on the colony formation ability of NSCLC cells. Mean±SD.n=3.**P<0.01vsNC group.

圖3 沉默circ_0000231對NSCLC細胞集落形成能力的影響

Figure 4. The results of flow cytometry analysis showed the apoptosis of the cells transfected with si-circ_0000231. Mean±SD.n=3.**P<0.01vsNC group.

圖4 沉默circ_0000231對NSCLC細胞凋亡的影響

Figure 5. The effect of si-circ_0000231 transfection on the mRNA (A) and protein (B) expression of CCND1 and Bcl-2 in the SPC-A1 cells. Mean±SD.n=3.**P<0.01vsNC group.

圖5 沉默circ_0000231對CCND1和Bcl-2表達的影響

細胞周期蛋白D1和Bcl-2是公認的癌基因，其過度表達可致細胞增殖失控，與患者臨床表現(xiàn)及預(yù)后不良有關(guān)[18-21]。本研究中，我們發(fā)現(xiàn)敲減circ_0000231表達后，CCND1和Bcl-2的mRNA和蛋白表達水平均有不同程度的下調(diào)，提示circ_0000231可能是通過調(diào)控CCND1和Bcl-2參與NSCLC惡性進展的。然而，circ_0000231是直接作用于CCND1和Bcl-2還是通過吸附某些miRNAs間接調(diào)控其表達的還有待進一步研究。

綜上所述，circ_0000231在NSCLC中表達上調(diào)，沉默circ_0000231能夠抑制NSCLC細胞增殖并促進NSCLC細胞凋亡，其作用可能是通過調(diào)控CCND1和bcl-2基因表達實現(xiàn)的。