通用引物雙重PCR在節(jié)肢動(dòng)物物種鑒定中的應(yīng)用

王彥坤, 李天楚, 粘景梓, 陳思聰, 郝志霞, 姜金壯, 黃大衛(wèi),,*

(1. 河北大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院, 河北保定 071002; 2. 南開(kāi)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院, 天津 300071)

多重PCR是指在一次PCR反應(yīng)體系中加入多對(duì)引物，從而同時(shí)產(chǎn)出多條目標(biāo)片段的技術(shù)，由Chamberlain等(1988)首次提出。目前多重PCR主要應(yīng)用于致病微生物的快速檢測(cè)：如針對(duì)靶標(biāo)致病微生物設(shè)計(jì)擴(kuò)增產(chǎn)物大小不同的多對(duì)特異性引物，將這些引物同時(shí)用于對(duì)樣品進(jìn)行一次PCR擴(kuò)增，然后將擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行電泳，即可通過(guò)檢查擴(kuò)增產(chǎn)物條帶的大小快速確定樣品中感染微生物的種類(Potrykusetal., 2014; Kimetal., 2015)。

自Hebert等(2003)引入DNA條形碼的概念以來(lái)，BOLD數(shù)據(jù)庫(kù)中基于線粒體細(xì)胞色素C氧化酶亞基I (mitochondrial cytochromecoxidase subunit I, COI) 基因的條形碼超過(guò)350萬(wàn)條，覆蓋超過(guò)21萬(wàn)個(gè)物種(截至2019年10月) (Ratnasingham and Hebert, 2007)，成為動(dòng)物物種鑒定的標(biāo)準(zhǔn)分子標(biāo)簽。在物種鑒定及進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育研究中，單一的DNA條形碼分析在一定程度上可以滿足實(shí)驗(yàn)分析的需要，但在部分類群中，人們發(fā)現(xiàn)基于COI基因片段的DNA條形碼會(huì)受到線粒體假基因(Songetal., 2008)、線粒體異質(zhì)性(Magnacca and Brown, 2010)或是胞內(nèi)共生菌(Sunetal., 2011; Xiaoetal., 2012)的影響。因此在物種鑒定以及系統(tǒng)發(fā)育研究中，為了獲得更加準(zhǔn)確可靠的結(jié)果，人們通常會(huì)選擇多個(gè)分子標(biāo)記，例如在線粒體COI基因序列的基礎(chǔ)上，加測(cè)其他線粒體基因(沈媛等, 2010; Xiaoetal., 2012; Wangetal., 2017)。在常規(guī)實(shí)驗(yàn)過(guò)程中，如果需要獲取單一樣本的多條標(biāo)記基因，需要對(duì)該樣品使用不同的引物進(jìn)行多次擴(kuò)增。因此，當(dāng)需要快速準(zhǔn)確鑒定物種，或是樣本十分珍貴的情況下，上述實(shí)驗(yàn)過(guò)程由于實(shí)驗(yàn)流程顯著延長(zhǎng)或樣本消耗加倍而存在諸多弊端?；诙嘀豍CR的思路，在本研究中，我們考慮將雙重PCR的方式用于多分子標(biāo)記鑒定動(dòng)物物種過(guò)程中的可能性，以期一次性獲得單一樣品的兩個(gè)標(biāo)記基因的序列，從而簡(jiǎn)化獲取多個(gè)分子標(biāo)記的實(shí)驗(yàn)過(guò)程，并減少樣本消耗。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物樣本采集及基因組DNA提取

為了驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)在不同類群中的實(shí)適用性，我們挑選了分屬于3綱8目14科的14種動(dòng)物 (表1)，其中，家蠅Muscadomestica與大型溞Daphniamagna由河北大學(xué)免疫學(xué)實(shí)驗(yàn)室飼養(yǎng)，黃粉蟲(chóng)Tenebriomolitor于2014年購(gòu)自河北省保定市花鳥(niǎo)魚(yú)蟲(chóng)市場(chǎng)并飼養(yǎng)，甜菜夜蛾Spodopteraexigua于2018年6月購(gòu)自河南濟(jì)源白云實(shí)業(yè)有限公司，小金蝙蝠蛾Hepialusxiaojinensis于2014年5月采自四川省黑水縣；其余標(biāo)本均于2018年6月采自河北省保定市河北大學(xué)校園內(nèi)，并依據(jù)形態(tài)將標(biāo)本初步鑒定至科。所有標(biāo)本采集后，浸泡于100%乙醇中，并在-20℃中保存。

基因組DNA提取時(shí)，首先對(duì)標(biāo)本的體表進(jìn)行清洗，隨后將整頭標(biāo)本(表1中標(biāo)本編號(hào)1， 11和13的3種動(dòng)物)或部分附肢(其余11種動(dòng)物，長(zhǎng)度約5 mm)，按照EasyPureGenomic DNA Kit (北京全式金生物技術(shù)有限公司)說(shuō)明書(shū)，提取基因組DNA，并將其溶解于200 μL Elution Buffer中，隨后將基因組DNA保存于-20℃?；蚪MDNA提取質(zhì)量通過(guò)擴(kuò)增COI基因進(jìn)行檢驗(yàn)。

1.2 雙重PCR及測(cè)序

常用于物種鑒定以及構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育的線粒體基因包括COI基因,Cytb(cytochromeb)和16S rDNA等?；贑OI基因的DNA條形碼有數(shù)量非常龐大的數(shù)據(jù)庫(kù)，因此我們首先選擇LCO1490與HCO2198 (Folmeretal., 1994)為COI基因的引物。在其他線粒體基因中，16S rDNA也具有較廣泛的應(yīng)用(沈媛等, 2010; Wangetal., 2017)，因此我們選擇16S rDNA作為雙重PCR的備選基因?？紤]到基于COI基因的DNA條形碼長(zhǎng)度為650 bp左右，我們挑選了16S rDNA基因中靶標(biāo)片段長(zhǎng)度分別為392 bp和1 049 bp的兩個(gè)片段，并將其分別命名為16S-Small(16S-S)和16S-Large(16S-L)。與之對(duì)應(yīng)，我們?cè)O(shè)計(jì)了兩組雙重PCR體系，分別用于擴(kuò)增COI+16S-S與COI+16S-L。實(shí)驗(yàn)中所使用的引物見(jiàn)表2，由金唯智生物科技有限公司合成。

PCR反應(yīng)體系: 10×TransTaq-T Buffer 5 μL, dNTPs (2.5 mmol/L) 4 μL, 引物 (10 μmol/L) 各1 μL,TransTaq-T Polymerase (5 U/μL) 1 μL, 模板2 μL (陰性對(duì)照為2 μL無(wú)菌水)，最后以ddH2O補(bǔ)充至50 μL。PCR反應(yīng)程序: 94℃預(yù)變性5 min; 94℃變性30 s, 50℃退火30 s, 72℃延伸40 s, 35個(gè)循環(huán); 72℃再延伸7 min。最后將PCR產(chǎn)物在1%瓊脂糖凝膠中電泳，經(jīng)EB染色觀察后，按照EasyPureQuick Gel Extraction Kit (北京全式金生物技術(shù)有限公司)說(shuō)明書(shū)回收對(duì)應(yīng)片段，并送至金唯智生物科技有限公司進(jìn)行測(cè)序。

表2 本研究中使用的引物

16S-S和16S-L分別代表16S rDNA中長(zhǎng)度為392 bp與1 049 bp的靶標(biāo)片段。下同。16S-Sand16S-Lrepresent the 392 and 1 049 bp fragments of 16S rDNA, respectively. The same below.*以黑腹果蠅線粒體基因組(GenBank登錄號(hào): U37541)為參考序列；靶標(biāo)片段長(zhǎng)度包括引物長(zhǎng)度。The mitochondrial genome ofDrosophilamelanogaster(GenBank accession number: U37541) was used as the reference sequence; the target fragment length included the primer length.

1.3 生物信息學(xué)分析

1.2節(jié)PCR產(chǎn)物測(cè)序所得原始序列對(duì)齊后，進(jìn)行人工校對(duì)，并將兩端殘余的引物序列刪除，最后獲得了每個(gè)標(biāo)本的COI,16S-S以及16S-L3條序列，在GenBank中使用在線程序Blastn搜索每個(gè)物種3條序列的相似序列。根據(jù)Blast對(duì)比結(jié)果(identity等)以及初步的形態(tài)鑒定，將每頭標(biāo)本鑒定至種，或?qū)⑵湔J(rèn)定為尚未公布序列的物種。由于16S-S位于16S-L內(nèi)部，因此，我們僅將每個(gè)物種的COI與16S-L上傳至NCBI GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中。COI與16S-L的GenBank檢索號(hào)列于表1。

2 結(jié)果

2.1 通用引物雙重PCR檢測(cè)

在致病微生物快速檢測(cè)中，多重PCR的引物通常為特異性引物，以保證多重PCR擴(kuò)增過(guò)程中沒(méi)有非特異擴(kuò)增條帶的產(chǎn)生。在本研究中，為了檢測(cè)雙重PCR在較廣泛的動(dòng)物類群中的普適性，基于動(dòng)物類群中可通用的線粒體通用引物，我們挑選了兩組引物用于雙重PCR實(shí)驗(yàn)，其中第1組雙重PCR實(shí)驗(yàn)用于擴(kuò)增COI與16S-S兩個(gè)分子標(biāo)記，而第2組雙重PCR實(shí)驗(yàn)用于擴(kuò)增COI與16S-L兩個(gè)分子標(biāo)記(預(yù)期擴(kuò)增獲得的各分子標(biāo)記的靶標(biāo)序列區(qū)域及長(zhǎng)度詳見(jiàn)方法1.2節(jié))。我們首先以果蠅為材料檢測(cè)了這兩組通用引物是否適用于雙重PCR。在以果蠅基因組DNA為模板檢驗(yàn)雙重PCR效果的結(jié)果中，兩組雙重PCR體系均可以成功擴(kuò)增靶標(biāo)片段，并且沒(méi)有非特異性條帶的產(chǎn)生(圖1)。

圖1 雙重PCR應(yīng)用于黑腹果蠅基因組DNA的擴(kuò)增結(jié)果

2.2 多種動(dòng)物類群的雙重PCR鑒定

在分屬于不同動(dòng)物類群的14個(gè)物種的14頭標(biāo)本中，兩組雙重PCR實(shí)驗(yàn)也可以成功地?cái)U(kuò)增靶標(biāo)片段，并沒(méi)有明顯的非特異性條帶的產(chǎn)生(圖2)。接下來(lái)，將14個(gè)物種的COI,16S-L以及16S-S序列預(yù)期長(zhǎng)度對(duì)應(yīng)的電泳條帶分別進(jìn)行切膠回收并測(cè)序，進(jìn)而將測(cè)序結(jié)果在GenBank進(jìn)行在線比對(duì)。COI,16S-L以及16S-S序列的在線比對(duì)和物種鑒定結(jié)果(表1)可以總結(jié)為以下4類：

(1)可通過(guò)線粒體COI基因和16S rDNA分子標(biāo)記有效鑒定至已知物種(序列一致性≥ 98%)。包括其9頭標(biāo)本(標(biāo)本1, 3, 4, 5, 6, 9, 10, 12和13)，其COI,16S-L以及16S-S序列可以分別鑒定至同一物種，并且具有較高的可信度，這些標(biāo)本的鑒定結(jié)果分別為：黑腹果蠅D.melanogaster，黃粉蟲(chóng)T.molitor，光肩星天牛A.glabripennis，西方蜜蜂Apismellifera，日本弓背蟻Camponotusjaponicus，甜菜夜蛾S.exigua，小金蝙蝠蛾H.xiaojinensis，懸鈴木方翅網(wǎng)蝽Corythuchaciliata以及大型溞D.magna。

圖2 14個(gè)節(jié)肢動(dòng)物種的兩組雙重PCR擴(kuò)增結(jié)果

(2)COI和(或)16S-L,16S-S序列與參考序列一致性略低于98%，但仍可鑒定至已知物種。包括2頭標(biāo)本：直翅目標(biāo)本8的COI,16S-L以及16S-S序列均可以比對(duì)至突灶螽的序列，并且與已知序列的一致性分別為96.70%, 99.69%和100%，因此標(biāo)本8的鑒定結(jié)果為突灶螽；半翅目標(biāo)本11的COI,16S-L以及16S-S序列分別比對(duì)至白楊毛蚜Chaitophoruspopuleti,C.populicola和C.saliapterus，序列一致性為分別為100%, 95.48%和96.59%，因此標(biāo)本11的鑒定結(jié)果為白楊毛蚜。

(3)通過(guò)COI和(或)16S rDNA不能有效鑒定至特定已知物種，可能為新種，或該物種的相關(guān)序列尚未公布。僅涉及1頭標(biāo)本，即蚰蜒目標(biāo)本14，其COI,16S-L以及16S-S序列均比對(duì)至Thereuonematurkestana，但與已知序列一致性分別為90.55%, 93.85%和93.81%，因此該標(biāo)本不能成功鑒定至種，在本文中標(biāo)記為Scutigeridae sp.。

(4)COI和(或)16S rDNA序列分別可以比對(duì)至兩個(gè)已知物種。包括另有2頭標(biāo)本：雙翅目標(biāo)本2的COI,16S-L以及16S-S序列均可以比對(duì)至家蠅M.domestica和毛足棒角蝗Dasyhippusbarbipes，并且一致性>98%；直翅目標(biāo)本7的COI序列可以比對(duì)至長(zhǎng)翅素木蝗Shirakiacrisshirakii和中華蘿蘑肖葉甲Chrysochuschinensis，16S-L以及16S-S序列可以比對(duì)至長(zhǎng)翅素木蝗S.shirakii。雖然標(biāo)本2與標(biāo)本7的基因比對(duì)結(jié)果中分別出現(xiàn)了兩個(gè)物種，但在實(shí)驗(yàn)前，我們首先根據(jù)形態(tài)特征，將不同標(biāo)本劃分至科，因此我們確信標(biāo)本2和標(biāo)本7的鑒定結(jié)果分別為家蠅和長(zhǎng)翅素木蝗。

3 討論與結(jié)論

目前多重PCR廣泛應(yīng)用于致病微生物檢測(cè)(郝少東等, 2015; Kimetal., 2015)中；此外也有研究者應(yīng)用多重PCR來(lái)擴(kuò)增基因組(Quicketal., 2017; 孫嘉儀等, 2017)。在這些研究中，多重PCR所需引物均需要根據(jù)已知序列設(shè)計(jì)特異性引物。在本研究中，我們使用線粒體基因通用引物來(lái)檢測(cè)在不同動(dòng)物類群中通過(guò)多重PCR技術(shù)同時(shí)獲取多條靶標(biāo)片段的可行性。我們首先考慮雙重PCR的可行性，通過(guò)雙重PCR產(chǎn)物的電泳圖，我們可以發(fā)現(xiàn)基于通用引物的雙重PCR技術(shù)可以可靠地?cái)U(kuò)增出目的條帶，并沒(méi)有非靶標(biāo)條帶的產(chǎn)生。本研究中，我們選取的靶標(biāo)片段為線粒體COI基因和16S rDNA，并且16S-L和16S-S兩個(gè)片段具有相似的物種鑒別能力。

引物的選擇與優(yōu)化被認(rèn)為是影響多重PCR效果最大的因素(Elnifroetal., 2000)。在本研究中，我們選取了線粒體基因COI與16S rDNA作為靶標(biāo)基因，因此我們不得不考慮本研究中挑選的兩對(duì)引物，在擴(kuò)增過(guò)程中是否存在相互影響。首先，我們考慮了兩個(gè)基因的位置關(guān)系。由于大多數(shù)昆蟲(chóng)線粒體基因組排列與昆蟲(chóng)線粒體基因組原始排列順序一致(陳志騰和杜予州, 2016)，以黑腹果蠅線粒體基因組(U37541)為例，COI與16S-L兩個(gè)標(biāo)記基因片段之間的間距達(dá)到7 120 bp和10 641 bp；而本研究中所使用的DNA聚合酶TransTaq-T Polymerase的擴(kuò)增速度為1～2 kb/min，PCR過(guò)程中延伸時(shí)間為40 s，這就意味著如果實(shí)驗(yàn)物種沒(méi)有發(fā)生線粒體基因重排事件，兩個(gè)片段的引物是不會(huì)發(fā)生相互干擾的。其次，我們對(duì)比了引物之間的互補(bǔ)關(guān)系，并未發(fā)現(xiàn)相互之間有互補(bǔ)結(jié)構(gòu)的出現(xiàn)。本研究中，COI片段在兩組雙重PCR體系的擴(kuò)增中均獲得了較明亮的條帶，而部分16S rDNA片段的條帶較暗，例如日本弓背蟻的16S-L片段，這可能與引物的熔解溫度或擴(kuò)增產(chǎn)物片段大小相關(guān)；但50 μL的雙重PCR體系，使我們可以通過(guò)膠回收獲取足量的16S-L片段，滿足測(cè)序的要求。另外，針對(duì)多重PCR體系中部分產(chǎn)物較弱的問(wèn)題，在多重PCR體系中增加對(duì)應(yīng)引物的量，增加引物與模板匹配的概率，也被認(rèn)為解決問(wèn)題的有效方法(Elnifroetal., 2000; 郝少東等, 2015)。鑒于目前有大量針對(duì)線粒體基因組設(shè)計(jì)的通用引物，其中有的是針對(duì)動(dòng)物界(Simonetal., 1994, 2006)，有的針對(duì)某一類群(張乃心等, 2013)，這些引物完全可以供我們?cè)谘芯坎煌惾簳r(shí)，挑選不同的基因，嘗試不同的組合，開(kāi)展用雙重或多重PCR策略進(jìn)行物種鑒定的工作。

本研究中，我們比較了雙重PCR法與常規(guī)方法在操作流程中的差異，兩種方法的最明顯差異體現(xiàn)在消耗的時(shí)間及樣本量中：采用傳統(tǒng)方法擴(kuò)增兩種標(biāo)記基因所花費(fèi)的時(shí)間以及消耗的DNA樣品，均是雙重PCR方法的兩倍；而如果后期我們可以用通過(guò)引物設(shè)計(jì)、體系優(yōu)化等方法實(shí)現(xiàn)多重PCR，即在一個(gè)反應(yīng)體系內(nèi)同時(shí)擴(kuò)增3個(gè)或3個(gè)以上的標(biāo)記基因，這種差異會(huì)更加明顯。而在需要對(duì)樣品進(jìn)行快速物種鑒定，或是樣本材料十分珍貴的情況下，這兩點(diǎn)無(wú)疑是非常重要的。

準(zhǔn)確而豐富的DNA分子序列庫(kù)對(duì)基于DNA序列差異分析的物種鑒定工作十分重要。在本研究中，我們發(fā)現(xiàn)家蠅與長(zhǎng)翅素木蝗這兩頭標(biāo)本的線粒體DNA分別可以比對(duì)至兩個(gè)物種，甚至部分片段的序列一致性高達(dá)100%。而更令人吃驚的是，GenBank中已公布的唯一的毛足棒角蝗D.barbipes的線粒體基因組(GenBank登錄號(hào): NC_041412)，與家蠅的線粒體基因組序列一致性高達(dá)99.56%～99.91%，而這些家蠅線粒體基因組測(cè)序是由不同作者完成的，因此，我們懷疑毛足棒角蝗D.barbipes已公布的線粒體基因組DNA可能受到了家蠅DNA的污染。另外，我們樣本中來(lái)自多足綱蚰蜒目蚰蜒科的標(biāo)本14，其COI序列和16S rDNA序列均未能以高可信度匹配至GenBank中的確切物種。這些結(jié)果提示我們，在進(jìn)一步完善DNA條形碼及其他標(biāo)記基因數(shù)據(jù)庫(kù)的同時(shí)，我們務(wù)必確保樣本沒(méi)有受到外源污染；此外，在對(duì)物種進(jìn)行分子鑒定之前，我們有必要基于形態(tài)學(xué)對(duì)樣本進(jìn)行初步劃分，以便應(yīng)對(duì)上述出現(xiàn)的問(wèn)題。

基于通用引物的雙重PCR，可以在較廣泛的動(dòng)物類群中，一次性擴(kuò)增出單一樣本的多條標(biāo)記基因，可以節(jié)省大量時(shí)間與材料。對(duì)于需要快速準(zhǔn)確鑒定物種，或材料樣本十分珍貴的情況，雙重PCR是很好的選擇。