亞致死濃度溴蟲腈和毒死蜱對等鉗蠊螨生長繁殖和解毒酶的影響

楊娟生, 叢 林, 王翠倫, 侯棟元, 周浩楠, 于士將, 成祿艷,雷 雙, 傅云梅, 程明明, 冉 春

(西南大學柑桔研究所, 重慶 400712)

等鉗蠊螨Blattisociusdentriticus屬蜱螨亞綱(Acari)囊螨科(Ascidae)，為世界性廣布種，在歐洲、亞洲、美洲等多個地區(qū)均有分布(Hughes, 1976)，在我國上海、浙江、廣東、遼寧、四川等也有發(fā)現(xiàn)(謝少遠等, 2000)。潘紀文(1985)發(fā)現(xiàn)，等鉗蠊螨可在暗處大量捕食腐食酪螨Tyrophagusputrescentiae。Mashaya(2002)則發(fā)現(xiàn)該螨對嗜蟲書虱Liposcelisentomophila有一定的捕食效果。鄭大睿(2011)進一步研究指出，等鉗蠊螨對柑橘全爪螨Panonychuscitri、腐食酪螨T.putrescentiae和茶短須螨Brevipalpusobovatus具有捕食反應(yīng)，可作為3種害螨的捕食性天敵。

由于藥劑的頻繁濫用，導致害螨極易產(chǎn)生抗藥性，僅依賴藥劑防治已不能從根本解決害螨猖獗問題(Khajehalietal., 2011)。1985年，忻介六引進“以螨治螨”的生防手段并運用在果樹上，成功利用捕食螨來防治柑橘害螨(忻介六, 1985)。隨著“雙減”要求的提出和食品安全關(guān)注度的日益提高，捕食螨的大面積推廣應(yīng)用已成為綠色農(nóng)業(yè)發(fā)展的熱點(徐學農(nóng)等, 2013; 汝陽等, 2017)。但由于生物防治見效慢、制約因素多等問題，現(xiàn)階段有害生物綜合治理仍需藥劑防治的輔助。但藥劑的使用，就不可避免地造成捕食螨的死亡。

為緩解化學防治和生物防治之間的矛盾，Huffaker和Kennett(1953)開發(fā)利用了抗藥性捕食螨。關(guān)注抗藥性捕食螨開發(fā)的同時，越來越多的學者致力于殺蟲劑對昆蟲(螨)的亞致死效應(yīng)的研究(Howeetal., 2015; 全林發(fā)等, 2016)。昆蟲(螨)在長期的化學農(nóng)藥亞致死劑量的選擇壓下，可發(fā)展和累積昆蟲(螨)的抗藥性(Young, 2003; 梁煒博等, 2017; Rugnoetal., 2019)。溴蟲腈和毒死蜱目前是柑橘園應(yīng)用較廣、銷量較大的殺蟲(螨)劑(鐘決龍, 2006; 孫國強和陸貽通, 2007)，目前尚未發(fā)現(xiàn)溴蟲腈和毒死蜱對等鉗蠊螨生長繁殖及解毒酶影響的研究。為明確農(nóng)藥亞致死劑量對等鉗蠊螨的影響，本研究選用溴蟲腈和毒死蜱作為供試藥劑，通過生物測定、生物化學和分子生物學等方法，分析比較上述兩種藥劑對等鉗蠊螨的影響，旨在為農(nóng)藥的科學使用及等鉗蠊螨的田間推廣提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供試材料

等鉗蠊螨和橢圓食粉螨Aleuroglyphusovatus均為實驗室飼養(yǎng)種群，且長期不接觸藥劑。

1.2 供試藥劑及主要儀器

10%溴蟲腈(chlorfenapyr)懸浮劑，購自巴斯夫歐洲公司；48%毒死蜱(chlorpyrifos)乳油，購自美國陶氏益農(nóng)公司；體視顯微鏡，購自重慶市奧特光學儀器公司；智能人工氣候箱，購自Percival公司；酶標儀，購自Thermo Scientific公司；定量PCR儀，購自Analytik Jena公司；酶活性檢測試劑盒，購自酶聯(lián)生物公司；RNA通用提取試劑盒，購自O(shè)MEGA公司；反轉(zhuǎn)試劑盒、定量試劑盒，購自Vazyme公司。

1.3 室內(nèi)毒力測定方法

參照Van Leeuwen等(2005)的藥膜法加以改進(下同)：將兩種藥劑分別稀釋為6個濃度梯度(溴蟲腈: 250.00, 125.00, 83.33, 62.50, 55.56和40.00 mg/L；毒死蜱: 150.00, 80.00, 75.00, 68.57, 56.47, 53.33和46.15 mg/L)，用毛筆蘸取藥劑均勻涂抹在六孔凹玻片凹槽內(nèi)壁(凹槽直徑1.5 cm，深2.2 mm)，放入通風櫥自然晾干。每孔放入充足的橢圓食粉螨，轉(zhuǎn)接30頭健康的2-3日齡等鉗蠊螨成螨，蓋上蓋玻片，用毛筆蘸取清水涂在蓋玻片邊緣，防止逃逸。將凹玻片置于智能人工氣候箱內(nèi)(溫度25±1℃，相對濕度75%-85%，光周期14L∶10D)，24 h后，在體視鏡下檢查其死亡率。用毛筆尖輕觸螨體，無任何反應(yīng)者視為死亡。每處理3次重復，以清水處理作對照。

1.4 溴蟲腈和毒死蜱對等鉗蠊螨F0代和F1代的亞致死效應(yīng)

采用藥膜法，選用剛蛻皮6 h以內(nèi)的成螨，用溴蟲腈和毒死蜱LC10和LC30劑量處理24 h后，挑選一對活潑的雌雄成螨(F0)至一潔凈的凹槽中飼養(yǎng)，定期補充足量橢圓食粉螨。每隔12 h觀察雌成螨的產(chǎn)卵量和產(chǎn)卵期至其自然死亡；挑取F0代在同一天所產(chǎn)的卵30粒于另一干凈的凹玻片中，觀察其孵化率。挑取F0代同一天產(chǎn)的卵至潔凈的凹槽中飼養(yǎng)，在其蛻皮至成螨后，選取雌雄成螨(F1)各1頭，進行配對飼養(yǎng)，記錄雌成螨壽命、產(chǎn)卵量、產(chǎn)卵期和孵化率，方法同F(xiàn)0代。每劑量30個重復，以清水處理作對照。

1.5 等鉗蠊螨解毒酶活力測定

方法與螨態(tài)選擇同1.4節(jié)，用溴蟲腈和毒死蜱LC10, LC30和LC50劑量處理盡可能多的成螨24 h后，收集活潑的成螨至新的離心管中，稱重后液氮速凍，置于-80℃超低溫冰箱中保存，用于酶活力的測定和RNA的提取。每處理3個重復，以清水處理作對照。利用酶聯(lián)免疫分析試劑盒提取、酶標儀測定等鉗蠊螨GST, CYP450和CarE活性。

1.6 RT-PCR

從等鉗蠊螨轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫(數(shù)據(jù)待發(fā)表)中篩選出17個解毒酶基因，用DNAMAN 7.0設(shè)計相應(yīng)的上下游引物(表1)，利用RT-PCR方法，評價其在溴蟲腈和毒死蜱亞致死劑量(LC10, LC30和LC50)脅迫24 h后的相對表達量，材料處理方法同1.5節(jié)。以β-actin基因作為內(nèi)參基因(GenBank登錄號: KP310115)(Wangetal., 2018)。PCR反應(yīng)體系: 2×ChamQ Universal SYBR qPCR Master Mix 10 μL,正反向引物(10 μmol/L)各0.4 μL, cDNA 1.0 μL, ddH2O 8.2 μL。PCR反應(yīng)程序: 95℃預變性30 s; 95℃變性5 s, 57℃退火30 s, 循環(huán)40次； 95℃延伸15 s。以清水處理作對照。用7500 Software v2.0.6分析軟件分析和處理數(shù)據(jù)，采用2-△△Ct法計算基因的相對表達量(Pfaffl, 2001)。

1.7 數(shù)據(jù)處理

采用農(nóng)藥室內(nèi)生物測定數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)(武漢市蔬菜科學研究所和農(nóng)業(yè)部農(nóng)藥檢定所， 2006)計算致死中濃度等毒力參數(shù)；利用SPSS 20.0軟件，對各處理組間的數(shù)據(jù)進行方差顯著性分析(ANOVA, Duncan氏多重比較,P<0.05)(Huizingh, 2012)。

2 結(jié)果

2.1 溴蟲腈和毒死蜱對等鉗蠊螨成螨的亞致死劑量

溴蟲腈對等鉗蠊螨成螨的亞致死劑量LC50, LC30, LC20和LC10分別為42.56, 23.11, 15.97和9.57 mg/L，毒死蜱對等鉗蠊螨成螨的亞致死劑量LC50, LC30, LC20和LC10分別為72.42, 49.92, 39.86和29.17 mg/L(表2)。

表1 RT-PCR所用引物

表2 溴蟲腈和毒死蜱對等鉗蠊螨成螨的室內(nèi)毒力測定結(jié)果

C.L.: 置信區(qū)間Confidential limit.

2.2 溴蟲腈和毒死蜱對等鉗蠊螨的亞致死效應(yīng)

由表3和表4可知，溴蟲腈LC10和LC30劑量處理等鉗蠊螨24 h后，F(xiàn)0代雌成螨壽命分別為20.95和21.33 d，較對照(清水處理)明顯縮短；LC30劑量下產(chǎn)卵期僅為5.53 d，明顯短于對照(P<0.05)；在毒死蜱處理后F0代雌成螨壽命和產(chǎn)卵期均明顯縮短，LC30劑量下總產(chǎn)卵量明顯少于對照(P<0.05)；而LC10下則差異不顯著(P>0.05)。 兩種藥劑處理對卵孵化率無明顯影響。兩種藥劑對F1代的總產(chǎn)卵量、產(chǎn)卵期、卵孵化率和壽命均無明顯影響(P>0.05)。

表3 亞致死劑量溴蟲腈和毒死蜱對等鉗蠊螨F0代雌成螨壽命及產(chǎn)卵特性的影響

CK: 清水處理, 作空白對照Treatment with water as the blank control. 表中數(shù)據(jù)為平均值±標準差；同列數(shù)據(jù)后不同的小寫字母代表差異顯著(P<0.05, Duncan氏多重檢驗)。Data in the table are mean±SD, and the lowercase letters following the data in the same column represent significant differences (P<0.05, Duncan’s multiple range test). 表3和4同The same for Tables 3 and 4.

表4 亞致死劑量溴蟲腈和毒死蜱對等鉗蠊螨F1代雌成螨壽命及產(chǎn)卵特性的影響

2.3 亞致死劑量溴蟲腈和毒死蜱對等鉗蠊螨解毒酶活性影響

由表5可知，溴蟲腈和毒死蜱LC10, LC30和LC50劑量處理等鉗蠊螨24 h后，GST, CYP450和CarE 3種酶活力均有不同程度的上升。其中，溴蟲腈LC50劑量下，3種酶活力分別為752.80, 1 375.59和198.70 mIU/L，顯著高于對照(P<0.05)；而其余劑量下則無明顯差異(P>0.05)。同樣，在毒死蜱LC50劑量下，3種酶活力均顯著高于對照(P<0.05)；但LC30劑量下，CYP450酶活力1 291.85 mIU/L，顯著高于對照(P<0.05)；其余處理下3種酶活力差異不明顯(P>0.05)。

表5 亞致死劑量溴蟲腈和毒死蜱對等鉗蠊螨成蟲GST, CYP450和CarE酶活性的影響

2.4 亞致死劑量溴蟲腈和毒死蜱脅迫對等鉗蠊螨體內(nèi)解毒酶基因表達的影響

2.4.1對GST基因表達的影響：由圖1(A)可知，溴蟲腈處理下，隨著劑量增加，等鉗蠊螨BdGST3和BdGST6表達量均顯著高于對照(P<0.05)；在LC10和LC30劑量下其余GST基因表達量差異不明顯(P>0.05)，但LC50劑量下較對照明顯增加(P<0.05)。由圖1(B)可知，在毒死蜱LC10, LC30和LC503個劑量下，等鉗蠊螨BdGST1,BdGST3和BdGST4基因表達量均明顯高于對照(P<0.05)；BdGST2和BdGST6基因在LC10劑量下表達量無明顯變化(P>0.05)，但LC30和LC50劑量下較對照明顯增加(P<0.05)；BdGST5基因在LC10和LC30劑量下表達量變化不明顯(P>0.05)，而LC50劑量下相對表達量高達5.76，明顯高于對照(P<0.05)。

圖1 亞致死劑量溴蟲腈(A)和毒死蜱(B)處理下等鉗蠊螨成蟲GST基因相對表達量

2.4.2對CYP450基因表達的影響：在溴蟲腈和毒死蜱3個劑量脅迫下，等鉗蠊螨CYP450基因表達情況如圖2所示。在溴蟲腈3個劑量脅迫下，BdCYP1基因表達量較對照明顯下調(diào)(P<0.05)；BdCYP2,BdCYP3和BdCYP4基因表達量隨濃度變化均顯著上調(diào)(P<0.05)；在LC10和LC30劑量下BdCYP5和BdCYP6表達量無明顯變化(P>0.05)，但LC50劑量下上調(diào)明顯(P<0.05)(圖2: A)。毒死蜱3個劑量脅迫下，BdCYP2,BdCYP5和BdCYP6基因表達量較對照明顯上調(diào)(P<0.05)；BdCYP4基因無明顯變化(P>0.05)；BdCYP1和BdCYP4基因在LC10劑量下表達量略有下調(diào)，但無明顯差異(P>0.05)；BdCYP4基因表達量在LC30和LC50劑量下無明顯變化(P>0.05)，而BdCYP1基因表達量則在LC50劑量下明顯上調(diào)(P<0.05)(圖2: B)。

圖2 亞致死劑量溴蟲腈(A)和毒死蜱(B)處理下等鉗蠊螨成蟲CYP450基因的相對表達量

圖3 亞致死劑量溴蟲腈(A)和毒死蜱(B)處理下等鉗蠊螨成蟲CarE基因的相對表達量

2.4.3對CarE基因表達的影響：溴蟲腈和毒死蜱LC10, LC30和LC50劑量處理后5個脂酶基因表達情況如圖3所示，溴蟲腈處理下BdCarE1,BdCarE4和BdCarE5基因表達量隨濃度的增加均顯著上調(diào)(P<0.05)；BdCarE2和BdCarE3基因表達量均高于對照，在LC10劑量下分別為對照的6.97和5.62倍，但在LC30劑量開始卻出現(xiàn)下調(diào)現(xiàn)象(P<0.05)(圖3: A)。毒死蜱處理下BdCarE1基因表達量隨濃度增加明顯上調(diào)(P<0.05)；LC10處理下BdCarE4基因表達量與對照相比差異不明顯(P>0.05)，而在LC30和LC50劑量處理下表達均顯著上調(diào)(P<0.05)；BdCarE5基因表達量與對照相比無明顯差異(P>0.05)(圖3: B)。

3 討論

農(nóng)藥亞致死效應(yīng)可導致昆蟲(螨)的生長發(fā)育、繁殖等特性的改變(Delpuechetal., 1998)。例如，在二斑葉螨Tetranychusurticae的研究中發(fā)現(xiàn)，溴蟲腈亞致死劑量處理后，其F0代的壽命和產(chǎn)卵期出現(xiàn)縮短的現(xiàn)象(Sani Bozhganietal., 2018)。家蠶幼蟲經(jīng)溴蟲腈處理后，其F0代生長發(fā)育未受影響，但其繭層量卻顯著升高(羅雁婕等, 2011)。而利用毒死蜱LC10和LC25處理褐飛虱3齡若蟲后，其F0代和F1代卵孵化率顯著降低。在對柑橘全爪螨的研究中也發(fā)現(xiàn)，利用甲氰菊酯亞致死劑量處理其若螨后，當代雌成螨(F0代)產(chǎn)卵量增加，其后代F1代和F2代產(chǎn)卵前期縮短，后代雌雄性比增大；而阿維菌素處理卻導致F0-F2代產(chǎn)卵量顯著降低(何恒果等, 2016)。本研究也證實，溴蟲腈和毒死蜱亞致死劑量處理后會導致等鉗蠊螨F0代雌成螨壽命和產(chǎn)卵期縮短，對F1代的壽命及產(chǎn)卵等生物學特性無明顯影響。由此可見，溴蟲腈和毒死蜱亞致死劑量短期會降低該螨的繁殖速度和防治效果，但對下一代生長繁殖無影響，不會大幅影響其種群數(shù)量變化。文中溴蟲腈的亞致死劑量值由于試驗濃度設(shè)置偏高可能有偏差，但對后續(xù)評價無明顯影響，可為等鉗蠊螨抗性篩選及科學應(yīng)用提供理論依據(jù)。

亞致死效應(yīng)不僅對昆蟲(螨)的生物學特性會有影響，也會對其體內(nèi)多種解毒代謝酶產(chǎn)生誘導或抑制作用(尹顯慧等, 2008; 張文成等, 2009)。在韭菜遲眼蕈蚊Bradshawodoriphaga4齡幼蟲研究中發(fā)現(xiàn)，經(jīng)溴蟲腈LC10, LC20和LC50處理后，其GST, CarE和O-demethylation活性顯著上升(Zhaoetal., 2018)，說明溴蟲腈亞致死劑量可誘導這3種酶的活性。在二斑葉螨經(jīng)阿維菌素LC10和LC20處理24 h后，其GST, MFO和CarE活力均顯著高于對照(汝陽等, 2017)。認為這3種酶在巴氏新小綏螨體內(nèi)均被誘導。不同藥劑脅迫對昆蟲體內(nèi)相關(guān)代謝酶影響不盡相同。用噻蟲胺LC15和LC30處理桃蚜Myzuspersicae24 h后，CarE活力較對照分別上升1.29和1.36倍，而GST的活力則被抑制(抑制率分別為11.9%和22.7%)(任學祥等, 2017)。在本研究中，溴蟲腈和毒死蜱LC50劑量處理24 h后等鉗蠊螨GST, P450和CarE活性均高于對照，在LC30劑量下P450酶活力分別為1 246.53和1 291.85 mIU/L，較對照明顯上升(P<0.05)(表5)。表明3種酶活力在受到藥劑脅迫時明顯被誘導，GST, P450和CarE可能是等鉗蠊螨體內(nèi)代謝或水解溴蟲腈和毒死蜱的重要酶系。

在基因表達量的研究中也證實，藥劑亞致死劑量還會影響昆蟲(螨)體內(nèi)基因表達。在二化螟Chilosuppressalis的研究中發(fā)現(xiàn)，經(jīng)氯蟲苯甲酰胺亞致死劑量處理其5齡幼蟲后，CsGSTd1,CsGSTd2和CsGSTt1等10個GST基因表達明顯上調(diào)，表明這些基因可能參與了其對氯蟲苯甲酰胺的解毒代謝(金燕璐等, 2018)。在巴氏新小綏螨的研究中也有發(fā)現(xiàn)，經(jīng)阿維菌素LC10和LC30處理常溫品系后，發(fā)現(xiàn)其GST3,GST4,CYP1,CYP2,CarE1和CarE2基因可能參與了其對阿維菌素的解毒代謝(胡琴, 2017)。而CYP4G62,CYP6EL1和CYP9AQ1則可能在飛蝗對馬拉硫磷的解毒代謝過程中發(fā)揮重要作用(于榮榮等, 2012)。本實驗對17個等鉗蠊螨基因在溴蟲腈和毒死蜱脅迫24 h后的mRNA表達水平進行了相對定量分析，發(fā)現(xiàn)溴蟲腈處理后BdGST3,BdGST6,BdCYP3和BdCYP4以及5個CarE基因(BdCarE1-5)表達量均顯著上調(diào)(P<0.05)，毒死蜱處理后BdGST1,BdGST3,BdGST4,BdCYP2,BdCYP3,BdCYP4,BdCarE1和BdCarE3基因表達明顯上調(diào)(P<0.05)(圖1-3)。研究結(jié)果表明，溴蟲腈和毒死蜱亞致死劑量同時誘導了等鉗蠊螨多個解毒或代謝抗性基因表達上調(diào)，由此推斷，等鉗蠊螨對溴蟲腈和毒死蜱的抗性可能是一個復雜的過程，可能與多種基因表達上調(diào)有關(guān)。研究結(jié)果為進一步研究等鉗蠊螨對溴蟲腈和毒死蜱的抗性機制提供了思路。