基于mtDNA COI基因序列的中國柑橘果實(shí)蠅的分子鑒定及柑橘大實(shí)蠅種群的遺傳多樣性分析

崔中翌, 周 瓊, 劉一鵬, 司品法, 汪 洋

(湖南師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院, 長沙 410081)

果實(shí)蠅是雙翅目(Diptera)實(shí)蠅科(Tephritidae)昆蟲的統(tǒng)稱，是雙翅目最大的類群(Aluja, 1999)，主要危害水果和蔬菜，對我國的果蔬生產(chǎn)及其出口貿(mào)易產(chǎn)生嚴(yán)重影響。世界已知實(shí)蠅大約有500個屬4 500多種(吳佳教等, 2009)，主要分布在亞洲的熱帶、亞熱帶和暖溫帶地區(qū)(梁亮等, 2011)。目前已報(bào)道的危害我國柑橘的實(shí)蠅種類主要包括柑橘大實(shí)蠅Bactrocera(Tetradacus)minax、桔小實(shí)蠅B.dorsalis和蜜柑大實(shí)蠅B.tsuneonis(張宏宇等, 2009; 王俊偉等, 2009; 尤克西等, 2012; Zhangetal., 2018)，均隸屬于離腹寡毛實(shí)蠅屬Bactrocera。柑橘大實(shí)蠅的寄主僅限于柑橘類果實(shí)，對我國柑橘產(chǎn)業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失，該蟲在中國的分布包括四川、貴州、湖南、湖北、云南、重慶等省市(Zhang, 1989; Liangetal., 1993; 汪興鑒和羅祿怡, 1995)，在國外分布于印度、尼泊爾、不丹等國家(Vergheseetal., 2004; Dorjietal., 2006)。柑橘大實(shí)蠅首次在1940年由Chen(1940)在四川記錄到，之后1957年擴(kuò)增到了中國5個省份，1966年擴(kuò)增到6個省份，1995年繼續(xù)擴(kuò)增到8個省，柑橘大實(shí)蠅隨柑橘的危害擴(kuò)散迅速，至今其起源中心與路徑還未知(Hongetal., 2019)。

線粒體DNA(mtDNA)是一種在物種進(jìn)化中相對保守的DNA，一般為母系遺傳，無內(nèi)含子和重復(fù)序列且進(jìn)化速率相對較快；同時(shí)，插入和缺失等現(xiàn)象也很少發(fā)生(Lin and Danforth, 2004)。朱詩禹等(2017)利用MEGA和DnaSP軟件對大豆食心蟲Leguminivoraglycinivorella線粒體COⅡ基因片段進(jìn)行了不同地理種群的遺傳分化分析。劉慎思等(2014)利用線粒體COI基因上一段648 bp的序列片段對離腹寡毛實(shí)蠅屬Bactrocera的21種常見實(shí)蠅種類進(jìn)行了識別與鑒定，結(jié)果表明實(shí)蠅種內(nèi)的遺傳距離平均0.0043，種間遺傳距離平均0.1540，種內(nèi)、種間遺傳距離沒有重合區(qū)域。Ball等(2005)將mtDNA COI上一段630 bp的片段作為靶標(biāo)對蜉蝣目(Ephemeroptera)的昆蟲進(jìn)行研究，得出種內(nèi)和種間序列的平均差異分別為1%和18%的結(jié)論，證明了基于COI基因的DNA條形碼能有效地區(qū)分蜉蝣目昆蟲。COI基因除了用于鑒定物種和研究系統(tǒng)發(fā)育之外，還可以進(jìn)行遺傳多樣性分析。施偉和葉輝(2004)利用線粒體COI基因的601 bp片段研究了云南5個地區(qū)桔小實(shí)蠅種群的遺傳學(xué)關(guān)系，發(fā)現(xiàn)這5個地理種群間遺傳分化程度比較低，沒有顯示出明顯的地理分布族群。馬英等(2018)利用約600 bp的COI基因片段對青海省的44種蚤類進(jìn)行了鑒定分析，得出蚤種內(nèi)遺傳距離在0.01%～2.90%之間，種間遺傳距離在4%～12%之間。王蒙等(2014)利用線粒體COI基因561 bp的片段對31個種群的桔小實(shí)蠅進(jìn)行了種群遺傳分化的研究，推測出了新發(fā)生地區(qū)桔小實(shí)蠅的來源。Leblanc等(2015)研究21個Bactrocerakohkongiae(桔小實(shí)蠅復(fù)合種)的樣本， COI基因(1 464 bp)單倍型網(wǎng)絡(luò)圖顯示出了高遺傳多樣性。

本研究采用DNA條形碼技術(shù)，對采自我國不同省份和地區(qū)的柑橘果實(shí)蠅種群進(jìn)行鑒定，并對為害柑橘的實(shí)蠅各類群的親緣關(guān)系和系統(tǒng)發(fā)育、以及種內(nèi)和種間競爭關(guān)系進(jìn)行了分析，為監(jiān)測危害我國柑橘的實(shí)蠅種類(以柑橘大實(shí)蠅為主)和分布，研究柑橘大實(shí)蠅種群的擴(kuò)散機(jī)理及其防控提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供試蟲源

本研究的實(shí)蠅樣本分別采自根據(jù)文獻(xiàn)記載的我國有柑橘大實(shí)蠅分布的8個省市16個地區(qū)的柑橘園(地理種群)，共28個種群(表1)，寄主植物包括蜜桔Citrusreticulate, 溫州蜜柑Citrusunshiucv. Miyagawa, 蜜柚Citrusmaxima, 臍橙Citrussinensiscv. Navel, 紐荷爾臍橙Citrussinensiscv. Newhall， 椪柑Citrusreticulatacv. Ponkan, 酸橙Citrusaurantium, 甜橙Citrussinensis, 大紅甜橙Citrussineniscv. Dahong, 天草Amakusa (橘類與橙類多親本的復(fù)合雜交品種citrus hybrid), 冰糖橙Citrussinensiscv. Bingtang, 獅頭柑Citrusspeciosacv. Shitougan和丑橘(不知火)Shiranuhi [Citrusreticulata×(C.reticulata×C.sinenesis)]共13種(或品種)。測試樣本共535頭，采集方法主要為摘取柑橘樹上蟲果并解剖獲取幼蟲和卵，部分樣本為柑橘園網(wǎng)捕、黃板或引誘劑誘捕的成蟲，以及柑橘園土壤中挖取的蛹，具體采樣信息如表1所示。 所采集供測試的果實(shí)蠅樣本置于75%乙醇中，常溫保存?zhèn)溆谩?所有標(biāo)本均存放于湖南師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院。

表1 供試柑橘果實(shí)蠅樣本信息

續(xù)表1 Table 1 continued

種群代碼Populationcode采集地點(diǎn)Locality 經(jīng)緯度Longitude andlatitude寄主植物Host plants樣本數(shù)Samplesize蟲態(tài)Developmental stage采集時(shí)間(年.月)Collecting time(year. month)GenBank登錄號GenBankaccession no.HNHJ-DHTC湖南洪江Hongjiang, Hunan27°2'N,109°82'E大紅甜橙C. sinensis cv. Dahong 6幼蟲Larva2017. 11MN868491MN868492MN868493HNXT-QC湖南湘潭Xiangtan, Hunan27°78'N,112°95'E臍橙C. sinensis cv. Navel45卵/幼蟲Egg/Larva2016.10/2018. 10MN868525MN868526HNXT-T湖南湘潭Xiangtan, Hunan27°78'N,112°95'E未知(捕獲)Unknown (Trapped)3成蟲Adult2017. 7MN868527MN868528HNCS-MJ湖南長沙Changsha, Hunan28°23'N,112°93'E蜜桔C. reticulata14蛹/成蟲Pupa/Adult2017. 10MN868532MN868533MN868534MN868535MN868536HNXY-MJ湖南湘陰Xiangyin, Hunan28°68'N,112°88'E蜜桔C. reticulata4蛹/成蟲Pupa/Adult2017. 10MN868529MN868530MN868531HNCB-WZMJ湖南城步Chengbu, Hunan26°37'N,110°03'E溫州蜜柑C. unshiu cv. Miyagawa2成蟲Adult2019. 8MN868482JXXS-SC江西修水Xiushui, Jiangxi29°03'N,114°57'E酸橙C. aurantium31幼蟲Larva2018. 11MN868537MN868538JXXS-TC江西修水Xiushui, Jiangxi29°03'N,114°57'E甜橙C. sinensis12幼蟲Larva2018. 11MN868539MN868540HBDJK-WZMJ湖北丹江口Danjiangkou, Hubei32°55'N,111°52'E溫州蜜柑C. unshiu cv. Miyagawa6成蟲Adult2017. 7MN868487CQ-T重慶涪陵Fuling, Chongqing29°57'N,106°55'E未知(捕獲)Unknown (Trapped)4成蟲Adult2017. 7MN868483GZZY-TC貴州遵義Zunyi, Guizhou27°73'N,106°92'E甜橙C. sinensis2卵Egg2017. 7MN868486GZZY-T貴州遵義Zunyi, Guizhou27°73'N,106°92'E未知(捕獲)Unknown (Trapped)5成蟲Adult2017. 7MN868484MN868485YNYS-QC云南永善Yongshan, Yunnan28°23'N,103°63'E臍橙C. sinensis cv. Navel66幼蟲Larva2017/2018. 10MN868545MN868546MN868547MN868548YNYS-NHE云南永善Yongshan, Yunnan28°23'N,103°63'E紐荷爾臍橙C. sinensis cv. Nellhall12幼蟲Larva2018. 10MN868543MN868544MN868549SXXY-STG陜西旬陽Xunyang, Shaanxi32°83'N,109°38'E獅頭柑C. speciosasengcv. Shitougan6成蟲Adult2017. 7MN868541MN868542SCPJ-CJ四川蒲江縣Pujiang,Sichuan30°20'N,103°50'E丑橘Shiranuhi [Citrusreticulata×(C. reticulata×C. sinenesis)]20成蟲Adult2019. 6MN868550MN868551MN868552MN868553MN868554MN868555MN868556

1.2 mtDNA COI基因信息來源

所使用的COI基因信息來自NCBI數(shù)據(jù)庫以及本研究中分析獲得的果實(shí)蠅序列(登錄號見表1)，包括柑橘大實(shí)蠅B.minax(GenBank登錄號: HM776033.1)(Zhangetal., 2014)、桔小實(shí)蠅B.dorsalis(GenBank登錄號: DQ845759.1)(徐浪等, 2007)、蜜柑大實(shí)蠅B.tsuneonis(GenBank登錄號: KM024421.1)(尤歡等, 2014)和瑞麗果實(shí)蠅B.ruiliensis(GenBank登錄號: KJ753925.1)(尤歡等, 2014)。

1.3 DNA提取

取1.1節(jié)所采集的樣本于1.5 mL離心管中，其中，1齡幼蟲取整蟲，2齡幼蟲取體前1/2長，3齡幼蟲取體前1/3長，蛹取整體，卵取整粒，成蟲取一足。分別用直徑4.5 mm小鋼珠在混合冷凍混合球磨儀(RETSCH MM400)中震碎后，采用天根血液/細(xì)胞/組織基因組DNA提取試劑盒(TIANamp Genomic DNA Kit)提取。

1.4 PCR擴(kuò)增

將1.3節(jié)中提取的DNA作為模板，以DNA條形碼COI基因的通用型引物(Armstrong and Ball, 2005)進(jìn)行PCR擴(kuò)增，LCO1490(5′-GGTCAACAAA TCATAAAGATATTGG-3′)作為上游引物，HCO2198(5′-TAAACTTCAGGGTGACCAAAAAATCA-3′)作為下游引物。反應(yīng)體系(25 μL)：水7.5 μL, 2×Es Taq MasterMix (Dye) 12.5 μL, 上下游引物(10 μmol/L)各1 μL, DNA模板3 μL。擴(kuò)增程序： 94℃預(yù)變性10 min; 94℃ 30 s, 55℃ 30 s, 72℃ 40 s, 32個循環(huán)；最后72℃ 10 min。PCR擴(kuò)增反應(yīng)在PCR擴(kuò)增儀(Eppendorf AG 22331 Hamburg)上進(jìn)行。取3 μL PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測，最后在Gel-Doc Universal Hood II型凝膠成像系統(tǒng)(Bio-Rad Laboratories)下分析電泳結(jié)果。

1.5 PCR產(chǎn)物純化、測序及序列分析

對1.4節(jié)中的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行純化，送深圳華大基因科技有限公司(北京)和鉑尚生物技術(shù)有限公司(上海)測序。序列采用MEGA 7.0軟件進(jìn)行整合對齊，并利用NCBI數(shù)據(jù)庫對所獲得的高質(zhì)量COI基因序列與已登錄的實(shí)驗(yàn)昆蟲堿基序列(見1.2節(jié))進(jìn)行同源性對比，DNAstar8.1軟件進(jìn)行序列堿基含量分析。對分別采自云南永善，江西修水以及湖南會同、澧縣、寧鄉(xiāng)、湘潭和洪江7個地區(qū)的43個柑橘蟲果內(nèi)的所有實(shí)蠅樣本(共343頭幼蟲或卵)的COI序列，利用MEGA 7.0軟件中 Kimura 2-parameter model(Kimura 雙參數(shù)模型計(jì)算)進(jìn)行種內(nèi)及種間遺傳距離分析。利用DnaSP6.11.01軟件分析計(jì)算28個種群的果實(shí)蠅COI基因單倍型分布、單倍型多樣性和核苷酸多樣性，并進(jìn)行Tajima’sD中性檢驗(yàn)。使用MEGA 7.0軟件中的最大似然(maximum likelihood, ML)法和鄰接(neighbor-joining, NJ)法與數(shù)據(jù)庫中現(xiàn)有實(shí)蠅種類的COI基因序列一同構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹，使用Kimura 2-parameter模型建樹，Bootstrap方法檢驗(yàn)置信度，重復(fù)1 000次。使用GraphPad Prism 5.0 軟件分析單個柑橘蟲果內(nèi)實(shí)蠅數(shù)量并作圖。用TCS 1.21軟件建立單倍型網(wǎng)絡(luò)樹并用PowerPoint 15.37 美化單倍型網(wǎng)絡(luò)樹(圖3)。

2 結(jié)果

2.1 柑橘果實(shí)蠅mtDNA COI的序列特征分析

本研究中獲得的所有實(shí)蠅的COI基因堿基序列(GenBank登錄號見表1)與NCBI數(shù)據(jù)庫中已知的相對應(yīng)實(shí)蠅COI基因片段序列的一致性為99%～100%，且沒有堿基插入或缺失現(xiàn)象。使用MEGA7.0軟件將所有實(shí)蠅COI基因序列進(jìn)行整合比對，修剪成長度505 bp的片段。使用DNAstar8.1軟件對序列進(jìn)行堿基含量分析，結(jié)果表明，所測全部COI基因序列中堿基A, G, T和C的平均含量分別為27.82%, 16.53%, 29.69%和25.95%，A+T的含量為57.51%，C+G含量為42.49%。保守位點(diǎn)C(conserved sites)378個，變異位點(diǎn)V(variable sites)127個，簡約信息位點(diǎn)Pi(parsimony information sites)101個，單核苷酸多態(tài)性(single nucleotide polymorphisms, SNPs)位點(diǎn)26個。

2.2 柑橘果實(shí)蠅種類鑒定

所采集的535頭柑橘實(shí)蠅中，經(jīng)COI基因的鑒定，發(fā)現(xiàn)其中有520頭柑橘大實(shí)蠅(占97.20%)，10頭桔小實(shí)蠅(占1.87%)，4頭蜜柑大實(shí)蠅(占0.75%)和1頭瑞麗果實(shí)蠅(占0.18%)。

柑橘大實(shí)蠅的種內(nèi)遺傳距離為0.0000～0.0140，平均為0.0033；桔小實(shí)蠅種內(nèi)遺傳距離為0.0000～0.0120，平均為0.0056；蜜柑大實(shí)蠅種內(nèi)遺傳距離為0。

4種柑橘果實(shí)蠅的種間遺傳距離為0.0264～0.2410，平均為0.2094。其中，柑橘大實(shí)蠅與蜜柑大實(shí)蠅的種間遺傳距離較近，為0.0985～0.1127，而與桔小實(shí)蠅和瑞麗果實(shí)蠅的種間遺傳距離分別為0.2212～0.2410和0.2180～0.2290；同時(shí)，桔小實(shí)蠅與瑞麗果實(shí)蠅的遺傳距離最近，為0.0264～0.0306，而與蜜柑大實(shí)蠅種間遺傳距離較遠(yuǎn)，為0.2093～0.2180。

2.3 柑橘果實(shí)蠅的系統(tǒng)發(fā)育分析

用最大似然法構(gòu)建基于COI基因序列的柑橘果實(shí)蠅的系統(tǒng)發(fā)育樹(圖1)?？梢钥闯?， 4種柑橘果實(shí)蠅分屬于兩大支，其中柑橘大實(shí)蠅與蜜柑大實(shí)蠅聚為一大支，桔小實(shí)蠅與瑞麗果實(shí)蠅聚為另一大支。

圖1 最大似然法構(gòu)建基于COI序列的柑橘果實(shí)蠅的系統(tǒng)發(fā)育樹

2.4 同一柑橘蟲果內(nèi)的實(shí)蠅種類及其遺傳距離

對采自云南永善、江西修水、以及湖南會同、澧縣、寧鄉(xiāng)、湘潭和洪江7個地區(qū)的43個柑橘蟲果內(nèi)的343頭幼蟲或卵進(jìn)行分析鑒定。發(fā)現(xiàn)43個蟲果內(nèi)都有柑橘大實(shí)蠅，其中，有39個蟲果內(nèi)的幼蟲或卵均為柑橘大實(shí)蠅，占所調(diào)查蟲果的90.7%，其余4個蟲果內(nèi)既有柑橘大實(shí)蠅也有其他實(shí)蠅(圖2)，僅占所調(diào)查蟲果的9.3%(4/43)。單個柑橘蟲果內(nèi)的實(shí)蠅數(shù)量在4～22頭之間。

在39個僅有柑橘大實(shí)蠅為害的蟲果中，有26個蟲果內(nèi)柑橘大實(shí)蠅的個體間遺傳距離均為0.0000，占大多數(shù)(66.67%)；有13個蟲果(占比33.33%)的柑橘大實(shí)蠅個體間遺傳距離范圍在0.0000～0.0080。其中遺傳距離為0.0020, 0.0040和0.0080的柑橘大實(shí)蠅COI基因序列之間分別有1, 2和4個堿基的差異。

其余4個有不同種類的實(shí)蠅為害的蟲果，均來自湖南會同，蟲果內(nèi)除柑橘大實(shí)蠅外，還有桔小實(shí)蠅、蜜柑大實(shí)蠅或瑞麗果實(shí)蠅。這些蟲果內(nèi)的柑橘大實(shí)蠅個體間遺傳距離為0.0000的有3個(圖2: 蟲果編號21, 22和23)，僅1個蟲果(圖2: 蟲果編號18)的柑橘大實(shí)蠅個體間有不同的遺傳距離(遺傳距離分別為0.0020, 0.0080和0.0100)。

2.5 柑橘大實(shí)蠅不同地理種群的遺傳多樣性

將經(jīng)過分子鑒定，已明確為柑橘大實(shí)蠅的505 bp的COI基因序列，用DnaSP分析各種群的單倍型個數(shù)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，16個地區(qū)28個種群的520頭柑橘大實(shí)蠅，可以分成17個單倍型(表2)。

COI基因序列的單倍型多樣性和核苷酸多樣性分析顯示，17個單倍型中，有8個共享單倍型(H1, H2, H3, H4, H5, H6, H7, H8)，9個單倍型為各種群獨(dú)有(H9, H10, H11, H12, H13, H14, H15, H16, H17)，其中四川蒲江寄主為丑橘的柑橘大實(shí)蠅種群中單倍型數(shù)量最多(7個)，其次是湖南會同寄主為蜜桔的種群，單倍型有5個，湖南澧縣(寄主為椪柑、臍橙、甜橙)、云南永善臍橙、湖南洪江(寄主為冰糖橙、大紅甜橙)、湖南長沙蜜桔、湖南湘陰蜜桔種群中的單倍型種類數(shù)量都在3種及以上。柑橘大實(shí)蠅28個種群間的單倍型多樣性、核苷酸多樣性以及核苷酸平均差異數(shù)等遺傳多樣性評價(jià)參數(shù)的變動范圍較大：單倍型多樣性范圍為0.237～0.833，其中湖南湘陰寄主為蜜桔的柑橘大實(shí)蠅單倍型多樣性最高；核苷酸多樣性范圍為0.00049～0.00543，其中湖南會同寄主為蜜桔的柑橘大實(shí)蠅核苷酸多樣性最高；核苷酸平均差異數(shù)變動范圍為-1.28172～2.74006，其中湖南會同蜜桔種群核苷酸多樣性以及核苷酸平均差異最高。Tajima’sD中性檢驗(yàn)結(jié)果顯示，大部分為正值，湖南會同蜜桔種群的Tajima’sD為2.74006，達(dá)到極顯著性檢驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)(P<0.01)，其他種群的Tajima’sD均無顯著性，表明柑橘大實(shí)蠅種群總體上達(dá)到一個動態(tài)平衡，未經(jīng)歷明顯的種群擴(kuò)張。

圖2 單個柑橘蟲果內(nèi)的實(shí)蠅種類、數(shù)量及遺傳距離

表2 柑橘大實(shí)蠅不同地理種群COI基因單倍型多樣性、核苷酸多樣性分析及中性檢驗(yàn)

續(xù)表2 Table 2 continued

種群代碼Population code寄主植物/來源Host plant/sourceHHdPiKTajima’s D單倍型分布Haplotype distributionGZZY-TC甜橙C. sinensis1000-H3GZZY-T未知(捕獲)Unknown (Trapped)20.2370.000790.400-0.81650H1, H3YNYS-QC臍橙C. sinensis cv. Navel40.5770.001280.6460.04876H1, H2, H3, H13YNYS-NHE紐荷爾臍橙C. sinensis cv. Newhall20.5090.001010.5091.18560H1, H3SXXY-STG獅頭柑C. speciosa cv. Shitougan20.3330.001320.667-1.13197H2, H3SCPJ-CJ丑橘Shiranuhi70.8000.002681.374-1.04268H1, H3, H7, H14,H15, H16, H17

種群代碼見表1。For population codes, see Table 1.H: 單倍型數(shù)量Number of haplotypes;Hd: 單倍型多樣性Haplotype diversity;Pi: 核苷酸多樣性Nucleotide diversity;K: 核苷酸平均差異數(shù)Average number of nucleotide difference; N/A: 單一樣本，不適宜計(jì)算遺傳多樣性O(shè)ne sample only, the genetic diversity is not applicable.**P<0.01.

2.6 柑橘大實(shí)蠅不同地理種群單倍型網(wǎng)絡(luò)

對獲得的COI基因序列采用TCS軟件進(jìn)行分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，所采獲的柑橘大實(shí)蠅共有17個單倍型，網(wǎng)絡(luò)圖呈單一散射分布(圖3)。其中，單倍型H1位于網(wǎng)絡(luò)圖中心，其他單倍型圍繞分布，大部分低頻單倍型僅由一到兩步突變而成。17個單倍型中，單倍型H1出現(xiàn)頻率最高(229/520)，占所有檢測個體的44.04%，其次是單倍型H3(94/520)，占所有檢測個體的18.08%， H1和H2均出現(xiàn)在所檢測的15個地區(qū)中的11個地區(qū)種群中。單倍型H11和H12與其他單倍型相對遺傳距離較遠(yuǎn)，具有明顯的分支。各單倍型散亂分布，缺乏明顯地理分布格局，且有很多共享單倍型。

圖3 基于COI基因序列的不同地區(qū)柑橘大實(shí)蠅單倍型網(wǎng)絡(luò)

2.7 柑橘大實(shí)蠅不同地理種群聚類分析

鄰接法(NJ)建立的柑橘大實(shí)蠅地理種群系統(tǒng)發(fā)育樹拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)(圖4)與最大似然法(ML)的(圖1)基本一致，表明擁有同種共享單倍型柑橘大實(shí)蠅的地理種群基本匯在一起。不同種群單倍型在系統(tǒng)發(fā)育樹上有一定的地理分布格局，但并非所有地理種群都聚在一起。

分析還發(fā)現(xiàn)，不同地區(qū)相同寄主的柑橘大實(shí)蠅種群在聚類分析中沒有明顯關(guān)聯(lián)，而且，同一地區(qū)的不同寄主之間以及與相同寄主之間在聚類分析中也未呈現(xiàn)明顯規(guī)律。說明柑橘大實(shí)蠅COI基因的遺傳多樣性與其對寄主植物的選擇沒有明顯相關(guān)。

圖4 鄰接法構(gòu)建基于mtDNA COI基因序列的28個柑橘大實(shí)蠅地理種群單倍型系統(tǒng)進(jìn)化樹

3 結(jié)論與討論

本研究以柑橘實(shí)蠅的卵、幼蟲(1-3齡)、蛹以及成蟲的足為模板，對我國8省份16個地區(qū)危害柑橘的實(shí)蠅種類進(jìn)行了COI基因的分子鑒定分析，發(fā)現(xiàn)所調(diào)查地區(qū)危害柑橘的實(shí)蠅主要為柑橘大實(shí)蠅，另外還有桔小實(shí)蠅、蜜柑大實(shí)蠅和瑞麗果實(shí)蠅。4種實(shí)蠅COI基因所測片段堿基組成與Muraji和Nakahara(2001)研究的實(shí)蠅mtDNA堿基組成具有(A+T)偏好性一致。本研究結(jié)果符合Hebert等(2003)提出的DNA條形碼種間遺傳距離在0.02之內(nèi)，種間差異是種內(nèi)差異10倍的有效性檢測標(biāo)準(zhǔn)；遺傳距離分析結(jié)果也符合Meier等(2008)提出的雙翅目種內(nèi)遺傳距離平均1.3%，種間遺傳距離平均10.1%。

瑞麗果實(shí)蠅為國內(nèi)首次在柑橘中發(fā)現(xiàn)。在調(diào)查解剖統(tǒng)計(jì)蜜桔內(nèi)的柑橘大實(shí)蠅時(shí)，我們發(fā)現(xiàn)1頭較小的善彈跳的實(shí)蠅幼蟲(柑橘大實(shí)蠅幼蟲沒有彈跳習(xí)性)，通過COI基因片段與NCBI數(shù)據(jù)庫中的序列對比(BLAST)，與瑞麗果實(shí)蠅(GenBank登錄號: KJ753925.1)有很高的核苷酸序列一致性(99%)，遺傳距離為0.0040，而與Bactrocerathailandica(GenBank登錄號: KF659779.1)的遺傳距離為0.0100，以遺傳距離最近的作為鑒定物種，故確定為瑞麗果實(shí)蠅。該種為肖樞等(2008)報(bào)道在中緬邊界發(fā)現(xiàn)，原分布于印度、泰國、老撾、斯里蘭卡和美國加州等地；Wang等(2008)在云南瑞麗采集并鑒定了種類。瑞麗果實(shí)蠅寄主不詳(Wangetal., 2008; 肖樞等, 2008; 梁亮等, 2011; 許桓瑜等, 2015)，其與泰國的B.thailandica具有很高的相似性，兩者在形態(tài)上的主要區(qū)別是縫后黃側(cè)條的長度和脛節(jié)顏色稍有不同(Wangetal., 2008; 梁亮等, 2011)。由于DNA條形碼目前對區(qū)分實(shí)蠅復(fù)合種并不理想(劉慎思等, 2012)，而且本研究該種僅采到1頭幼蟲，故尚不能對其是同種異名還是復(fù)合種下結(jié)論。

從理論上來說，高水平的遺傳多樣性有助于外來物種定殖與擴(kuò)散(施雯等, 2010)。高立志等(2016)利用微衛(wèi)星引物對采自7省市的18個柑橘大實(shí)蠅種群進(jìn)行了標(biāo)記、遺傳地理距離分析和Mantal檢測，發(fā)現(xiàn)18個地理種群間的遺傳距離較大(0.004～0.264)，存在著較大的遺傳分化。Hong等(2019)利用線粒體基因nad4片段同樣也研究了柑橘大實(shí)蠅的遺傳多樣性以及種群結(jié)構(gòu)，揭示出柑橘大實(shí)蠅具有較高的遺傳多樣性。本研究結(jié)果支持以上結(jié)論，發(fā)現(xiàn)8個省市的28個柑橘大實(shí)蠅地理種群具有17個單倍型，在系統(tǒng)聚類樹中的分布具一定的地區(qū)聚集的分布格局，表明各地理種群間的遺傳分化程度較高，但也有少量種群并未與同一地理種群聚類，追究其原因，可能與未經(jīng)檢疫的帶蟲柑橘在不同地區(qū)間的運(yùn)輸和銷售引起的被動擴(kuò)散有關(guān)。同時(shí)，不同地理種群的相同寄主柑橘品種內(nèi)的柑橘大實(shí)蠅在系統(tǒng)聚類樹中并沒有聚在一起，同一地理種群的相同寄主和不同寄主的柑橘大實(shí)蠅也未顯示明顯聚類的規(guī)律，提示柑橘大實(shí)蠅的種內(nèi)遺傳分化與地理分布有關(guān)，而與對寄主的選擇沒有明顯的關(guān)聯(lián)。柑橘大實(shí)蠅地理種群的高水平的遺傳多樣性，提示其有較強(qiáng)的擴(kuò)大危害范圍的風(fēng)險(xiǎn)。

競爭是指多個個體為了同一資源而產(chǎn)生的爭奪(李國清和慕莉莉, 2006)。引起種間競爭的主要因素是生態(tài)位的重疊(馬駿等, 2009)。廣食性的桔小實(shí)蠅與番石榴實(shí)蠅(劉曉飛等, 2014)、瓜實(shí)蠅與南亞果實(shí)蠅(張金龍等, 2017)之間存在種間競爭關(guān)系。柑橘大實(shí)蠅為寡食性，僅危害蕓香科柑橘屬植物果實(shí)，其一年發(fā)生1代(汪興鑒和羅祿怡, 1995)；桔小實(shí)蠅是廣食性，寄主多樣包括芒果、柑橘、楊桃等，其一年3～5個世代，在不同地區(qū)完成世代有所不同(王小蕾和張潤杰, 2009)；蜜柑大實(shí)蠅與柑橘大實(shí)蠅有著相近的外型、生活史、行為與寄主(Zhangetal., 2018)，其二者外型區(qū)別主要在于有無前翅上鬃，有無肩板鬃中對(汪興鑒和羅祿怡, 1995)；瑞麗果實(shí)蠅的生活史周期不詳，Wang等(2008)在2003-2006年的5-10月期間誘捕得到其標(biāo)本并鑒定。這4種實(shí)蠅均為害柑橘果實(shí)并具有明顯的生態(tài)位重疊，但僅柑橘大實(shí)蠅在我們所調(diào)查地區(qū)是危害柑橘的絕對優(yōu)勢實(shí)蠅種類，表明這4種實(shí)蠅的生存競爭中，柑橘大實(shí)蠅在我們所調(diào)查地區(qū)具有強(qiáng)大的競爭優(yōu)勢，其機(jī)制尚待研究。

一些實(shí)蠅在產(chǎn)卵的同時(shí)，雌成蟲會留下寄主標(biāo)記信息素，寄主標(biāo)記信息素主要作用通常就是防止其他雌性在此處再次產(chǎn)卵，阻止過度寄生(李國清和慕莉莉, 2006; Chesetoetal., 2017)。H?gvar(1988)對寄生于桃蚜上的兩種蚜繭蜂進(jìn)行了研究，認(rèn)為寄主標(biāo)記信息素對昆蟲種間競爭的影響常見于近緣種不同個體之間。實(shí)蠅科的多種昆蟲具有寄主標(biāo)記行為，如桔小實(shí)蠅(趙靜等, 2014)、地中海實(shí)蠅Ceratitiscapitata(Arredondo and Díazfleischer, 2006)和墨西哥實(shí)蠅Anastrephaludens(Alujaetal., 2009)等。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，采自不同地區(qū)的43個蟲果中，有66.67%(26/43)的同一蟲果內(nèi)柑橘大實(shí)蠅遺傳距離均為0.0000；有30.23%(13/43)蟲果內(nèi)有大小差異的不同齡期的柑橘大實(shí)蠅幼蟲且遺傳距離大于0.0000，說明可能存在部分多頭柑橘大實(shí)蠅雌蟲先后在同一果實(shí)中產(chǎn)卵的情況；同時(shí)，僅有9.3%(4/43)的蟲果內(nèi)同時(shí)有不同種類實(shí)蠅(柑橘大實(shí)蠅、蜜柑大實(shí)蠅、桔小實(shí)蠅或瑞麗果實(shí)蠅)寄生。上述結(jié)果提示，柑橘大實(shí)蠅可能也存在寄主標(biāo)記行為，但其產(chǎn)卵標(biāo)記信息物的作用效果有一定限度。

我們在調(diào)查中還發(fā)現(xiàn)，在柑橘果園中利用食誘劑、誘球和黃板還可以誘捕到少量的南瓜實(shí)蠅Bactroceratau和具條實(shí)蠅B.scutellata成蟲，但目前尚未在柑橘蟲果內(nèi)獲得該兩種實(shí)蠅幼蟲的分子證據(jù)，因此，本研究尚不能明確這兩種實(shí)蠅是否危害健康柑橘果實(shí)，推測誘捕到的南瓜實(shí)蠅和具條實(shí)蠅成蟲可能源自橘園周邊的瓜果地或落果。

致謝承蒙西南大學(xué)王進(jìn)軍教授、華中農(nóng)業(yè)大學(xué)張宏宇教授和牛長纓教授、云南農(nóng)業(yè)大學(xué)肖春教授和董文霞教授、長江大學(xué)桂連友教授、江西修水余春華高級農(nóng)藝師、云南永善縣柯賢江農(nóng)藝師以及四川成都浦江縣周倫高級農(nóng)藝師提供柑橘大實(shí)蠅標(biāo)本或蟲果，貴州遵義市殷元進(jìn)高級農(nóng)藝師和湖南省植保站張佳峰農(nóng)藝師協(xié)助采集標(biāo)本，在此一并表示衷心的感謝！