一株侵染豌豆蚜的昆蟲(chóng)病原真菌的分離及鑒定

張挺峰, 王 睿, 劉長(zhǎng)仲,*

(1. 甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院, 甘肅省農(nóng)作物病蟲(chóng)害生物防治工程實(shí)驗(yàn)室, 蘭州 730070;2. 河西學(xué)院農(nóng)業(yè)與生物技術(shù)學(xué)院, 甘肅張掖 734000)

豌豆蚜Acyrthosiphonpisum隸屬于半翅目(Hemiptera)蚜總科蚜科(Aphididae)，在世界各地廣泛分布，是許多豆科作物及牧草的主要害蟲(chóng)之一(賀春貴, 2004)。在美國(guó)，豌豆蚜的危害可導(dǎo)致苜蓿生產(chǎn)者每年損失大約6 000萬(wàn)美元(Harmonetal., 2009)。在我國(guó)西北苜蓿種植區(qū)，豌豆蚜每年可造成苜蓿生產(chǎn)10%～30%的經(jīng)濟(jì)損失(特木爾布和等, 2005)。除直接取食為害外，豌豆蚜還能傳播苜?；ㄈ~病毒、豌豆耳突花葉病毒等30余種病毒，從而造成嚴(yán)重的間接危害(He and Zhang, 2006)。長(zhǎng)期以來(lái)，蚜蟲(chóng)防治主要依靠大面積使用化學(xué)農(nóng)藥，然而，單一使用化學(xué)農(nóng)藥，致使大量天敵被殺傷，破壞了天敵和蚜蟲(chóng)的消長(zhǎng)關(guān)系；蚜蟲(chóng)抗藥性產(chǎn)生，且隨著用藥次數(shù)和用藥量的增加而交替上升；隨之而來(lái)的大量化學(xué)農(nóng)藥使用所造成的環(huán)境污染和農(nóng)藥殘留等問(wèn)題也日益突出(Scottetal., 1998; Bielza, 2008; Gaoetal., 2012)。

昆蟲(chóng)病原真菌以其廣泛的存在和豐富的多樣性為病蟲(chóng)害綜合防治提供了一種可持續(xù)的解決方案。利用病原微生物制成的生物農(nóng)藥由于其生態(tài)友好性和持久性，無(wú)殘留、無(wú)公害、無(wú)毒或低毒、不易產(chǎn)生抗性等優(yōu)點(diǎn)，在昆蟲(chóng)生命周期的各個(gè)階段都是首選的殺蟲(chóng)劑。用昆蟲(chóng)病原真菌防治害蟲(chóng)，不同的菌種和菌株對(duì)同一寄主昆蟲(chóng)的感染毒力常常不同，一般來(lái)說(shuō)，來(lái)自原寄主的病原真菌比來(lái)自其他寄主的病原真菌對(duì)防治對(duì)象有更高的毒力或?qū)Ｒ坏淖饔糜诎袠?biāo)有害生物。因此，收集田間自然感染的蟲(chóng)尸，分離和篩選高致病性的昆蟲(chóng)病原真菌是豌豆蚜生物防治的基礎(chǔ)。本研究于2016年6月在甘肅省蘭州市甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)苜蓿實(shí)驗(yàn)基地，采集獲得自然染病的豌豆蚜蟲(chóng)尸，分離和純化出一株具有高致病力的病原真菌，自命名TF-2。通過(guò)對(duì)TF-2菌株形態(tài)觀察和分子鑒定以及毒力測(cè)定的研究，旨在為利用昆蟲(chóng)病原真菌進(jìn)行豌豆蚜的生物防治提供菌種資源和應(yīng)用依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 菌株分離

2016年6月，將采自甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)苜蓿試驗(yàn)基地(蘭州安寧區(qū))的豌豆蚜蟲(chóng)尸先用75%酒精消毒3 s，再用滅菌蒸餾水洗滌3次，放入1.5 mL離心管中，加入0.5 mL滅菌蒸餾水，用組織勻漿器將蟲(chóng)體勻漿并稀釋10倍，取20 μL用涂布棒均勻涂布在PDA固體培養(yǎng)基上，置于恒溫培養(yǎng)箱中(SPX-250-GB，上海躍進(jìn)醫(yī)療器械有限公司)，在25±1℃、75%±5% RH、光周期16L∶8D條件下培養(yǎng)5 d，將培養(yǎng)后的菌株進(jìn)行2次劃線分離，自命名TF-2，保存于4℃冰箱備用。

1.2 供試蚜蟲(chóng)

試驗(yàn)所用紅色型豌豆蚜采自甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)苜蓿試驗(yàn)基地，挑選無(wú)翅胎生雌蚜，單頭飼養(yǎng)在盆栽蠶豆Viciafabae‘Lincan 2’ (臨蠶2號(hào)，購(gòu)于甘肅省農(nóng)業(yè)科學(xué)院)植株上進(jìn)行單克隆系培養(yǎng)，作為供試蟲(chóng)源。飼養(yǎng)條件：溫度25±1℃、50%±10% RH的條件下飼養(yǎng)備用。

1.3 回接試驗(yàn)和生物學(xué)測(cè)定

采用浸漬法(Yu, 2016)和改進(jìn)的離體葉片培養(yǎng)法(Feng and Johnson, 1991)進(jìn)行回接試驗(yàn)和生物學(xué)測(cè)定。將分離菌株TF-2培養(yǎng)10 d后，用2 mL 0.01% Tween-80無(wú)菌水沖洗菌落獲得分生孢子，在顯微鏡下配制成不同濃度(1×103, 1×104, 1×105, 1×106和1×107孢子/mL)孢子懸浮液。用毛筆挑選個(gè)體大小基本一致的紅色型無(wú)翅成蚜，浸入孢子懸浮液(1×107孢子/mL)中3～5 s后挑出，自然晾干，選擇活動(dòng)自如、無(wú)殘缺個(gè)體，接入新鮮潔凈蠶豆葉片上，用浸濕的棉團(tuán)包裹葉柄，置于底鋪濾紙的培養(yǎng)皿(直徑為9 cm)內(nèi)，在濾紙上滴無(wú)菌水保濕，每葉接蟲(chóng)5頭，每一濃度處理30頭，重復(fù)3次，對(duì)照組(CK)用0.01% Tween-80無(wú)菌水處理。接種蚜蟲(chóng)放入恒溫培養(yǎng)箱中(25±1℃, 75%±5% RH, 光周期16L∶8D)飼養(yǎng)，每隔12 h觀察1次，觀察蚜蟲(chóng)體染菌情況，記錄處理成蟲(chóng)死亡數(shù)量，及時(shí)清除若蚜。葉柄棉花團(tuán)適時(shí)補(bǔ)充水分，每隔3 d更換1次葉片。

1.4 病原真菌形態(tài)學(xué)觀察及鑒定

將保存于4℃冰箱中的菌株TF-2接種于PDA培養(yǎng)基上，25℃活化5 d，再用挑菌針在菌落邊緣挑取菌絲，轉(zhuǎn)接到新的PDA培養(yǎng)基上，并在接種中心外傾斜45°角插入3個(gè)無(wú)菌蓋玻片(18 mm×18 mm)，在恒溫培養(yǎng)箱中(25±1℃, 75%±5%RH, 光周期16L∶8D)培養(yǎng)。利用光學(xué)顯微鏡自第2天開(kāi)始觀察記錄菌落形態(tài)、顏色和菌落生長(zhǎng)情況，分生孢子、分生孢子梗、晶體等的形成情況，測(cè)量并拍照。根據(jù)菌株形態(tài)特征，參考《昆蟲(chóng)真菌學(xué)》(李增智和蒲蟄龍， 1996)檢索表進(jìn)行初步鑒定。

1.5 病原真菌的分子生物學(xué)鑒定

1.5.1菌株DNA的提取：將活化的菌株接種于PDA培養(yǎng)基上，恒溫培養(yǎng)箱(25±1℃, 75%±5% RH, 光周期16L∶8D)培養(yǎng)20 d，用滅菌的刀片將菌絲從培養(yǎng)基上刮下，收集在滅菌濾紙上，待菌絲干燥2 h后，稱(chēng)取100 mg，置于滅菌研缽中，加入液氮，研磨成粉末，-20℃保存?zhèn)溆?。采用CTAB法(Guoetal., 2000)提取菌株總DNA(提取試劑盒購(gòu)自美國(guó)Omega Bio-Tek公司)。

1.5.2rDNA-ITS序列的擴(kuò)增和測(cè)定：選擇使用真菌rDNA-ITS通用引物(Whiteetal., 1990)：ITS1-F(5′-CTTGGTCATTTAGAGGAAGT-3′)和ITS4-R(5′-CCTCCGCTTATTGATATGC-3′)，對(duì)ITS序列進(jìn)行PCR擴(kuò)增和測(cè)序。PCR反應(yīng)體系(50 μL): 5 μL 10×Dream Taq Green Buffer (Thermo Fisher Scientific), DNA模板2 μL, dNTPs (2.5 mmol/L each) 4 μL, ITS1-F (10 μmol/L) 2 μL, ITS4-R (10 μmol/L) 2 μL, 0.5 μL Taq酶，補(bǔ)充去離子水至50 μL。反應(yīng)條件: 94℃預(yù)變性4 min; 94℃變性1 min, 55℃退火30 s, 72℃延伸90 s, 35個(gè)循環(huán); 72℃延伸10 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)1%凝膠電泳檢測(cè)后，送交南京金瑞斯生物科技有限公司測(cè)序。

1.5.3分子系統(tǒng)發(fā)育分析：將測(cè)得的rDNA-ITS序列在NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行BLAST比對(duì)并申請(qǐng)GenBank登錄號(hào)。下載相關(guān)菌株的ITS序列，使用MEGA6.0軟件運(yùn)用Clustal X方法進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育分析，以鄰接法(neighbor-joining method)構(gòu)建分子系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)，用Bootstrap對(duì)系統(tǒng)樹(shù)進(jìn)行檢驗(yàn)，1 000次重復(fù)(Cabbone and Kohn, 1993; Moralesetal., 1995; Eapenetal., 2005)。

1.6 數(shù)據(jù)處理

2 結(jié)果

2.1 TF-2菌株回接后豌豆蚜成蟲(chóng)的罹病癥狀及其毒力

將分離菌株孢子懸浮液(1×107孢子/mL)，對(duì)紅色型豌豆蚜成蟲(chóng)進(jìn)行回接殺蟲(chóng)試驗(yàn)。接菌培養(yǎng)2 d 后，浸染蚜蟲(chóng)行動(dòng)遲緩，體色發(fā)暗，在蟲(chóng)體的足關(guān)節(jié)處及腹管等處生出白色菌絲(圖1: C)，4 d后蟲(chóng)體僵硬且全身布滿(mǎn)菌絲(圖1: E, F)，其癥狀與自然染病僵蚜(圖1: A)一致?；亟釉囼?yàn)證明分離菌株是一株寄生于豌豆蚜的病原真菌。不同濃度TF-2分生孢子浸染豌豆蚜成蟲(chóng)毒力測(cè)定結(jié)果表明：隨分生孢子濃度增大，致死率升高，最高濃度處理(1×107孢子/mL) 6 d 后校正死亡率達(dá)到100%(表1)，可見(jiàn)分離得到的TF-2菌株對(duì)豌豆蚜成蟲(chóng)具有較強(qiáng)的致病力。

2.2 菌株鑒定

2.2.1菌株的培養(yǎng)性狀及形態(tài)特征：將菌株TF-2在 PDA 培養(yǎng)基上25℃恒溫培養(yǎng)10 d后，菌落直徑24～30 mm。菌落正面白色絨氈狀(圖2: A)，菌落背面奶油色泛黃(圖2: B)。分生孢子梗較長(zhǎng)呈瓶狀，常見(jiàn)從平臥菌絲上單生或側(cè)輪生2～3個(gè)，大小為(19～42) μm×(1.1～2.5) μm，基部較粗至尖端逐漸變細(xì)(圖2: C, D)。分生孢子長(zhǎng)橢圓形(圖2: E)，大小為(4.2～11.8)μm×(1.6～2.6) μm，還能產(chǎn)生卵圓形或橢圓形小分生孢子。菌絲體可產(chǎn)生大量呈八面體晶體(圖2: F)。最適生長(zhǎng)溫度為25±1℃，當(dāng)溫度超過(guò)34℃菌株停止生長(zhǎng)。根據(jù)以上形態(tài)觀察結(jié)果，參考李增智和蒲蟄龍(1996)以及Zare和Games(2003)的研究，初步判斷該菌株為蠟蚧菌屬真菌。

圖1 菌株TF-2侵染豌豆蚜癥狀

表1 處理后不同時(shí)間TF-2菌株對(duì)豌豆蚜成蟲(chóng)的致病力

校正死亡率(%)=(處理組死亡率-對(duì)照組死亡率)/(1-對(duì)照組死亡率)。Corrected mortality (%)=(Mortality in the treatment group-Mortality in the control group)/(1-Mortality in the control group).

圖2 菌株TF-2形態(tài)特征及培養(yǎng)性狀

2.2.2分子鑒定：為進(jìn)一步確定該真菌類(lèi)型，以ITS1-F和ITS4-R為引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到菌株TF-2的ITS序列送南京金瑞斯生物科技有限公司測(cè)序，得到630 bp DNA序列(GenBank登錄號(hào): MG834532)。通過(guò)Blast與GenBank中已有的核苷酸序列進(jìn)行比對(duì)，結(jié)果表明，菌株TF-2的rDNA-ITS序列與長(zhǎng)孢蠟蚧菌Lecanicilliumlongisporum(GenBank登錄號(hào): KX426564)相應(yīng)序列一致性高達(dá)99%。選擇GenBank中蠟蚧菌屬Lecanicilliun已公布的具代表性的9個(gè)菌株的DNA序列，采用Clustal X將已知序列和測(cè)得的序列進(jìn)行多重序列比對(duì)，比對(duì)完成后用MEGA6.0軟件中的鄰接法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)，以確定該菌株TF-2與同屬其他種的親緣關(guān)系(圖3)。Bootstrap值大于70%相當(dāng)于統(tǒng)計(jì)學(xué)概率的95%，一般75%以上認(rèn)為是可信的(葉麗芹等, 2011)。結(jié)合形態(tài)特征與rDNA-ITS同源性比對(duì)結(jié)果，確定分離得到的菌株TF-2為長(zhǎng)孢蠟蚧菌L.longisporum。

圖3 基于rDNA-ITS序列的菌株TF-2和蠟蚧菌屬菌種系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)

3 討論

昆蟲(chóng)病原真菌是自然界中昆蟲(chóng)種群數(shù)量得以控制的主要因素之一，是園藝、林業(yè)和農(nóng)業(yè)中真菌殺蟲(chóng)劑的重要組成部分(Inglisetal., 2000)。本研究從自然染菌的豌豆蚜蟲(chóng)尸上分離得到一株病原真菌，經(jīng)毒力測(cè)定、形態(tài)學(xué)和分子鑒定，確定該真菌為長(zhǎng)孢蠟蚧菌L.longisporum。室內(nèi)毒力測(cè)定顯示長(zhǎng)孢蠟蚧菌TF-2對(duì)豌豆蚜成蟲(chóng)具有很強(qiáng)的致病力，是一種具有開(kāi)發(fā)潛力的病原真菌。ITS序列由于其易擴(kuò)增、信息量豐富、研究廣泛等諸多優(yōu)勢(shì)，已經(jīng)成為真菌鑒定的通用核心條形碼(Schochetal., 2012)。利用ITS序列對(duì)長(zhǎng)孢蠟蚧菌以及蠟蚧菌屬的研究已有報(bào)道(張召榮等, 2015; Berlanga-Padillaetal., 2016; Wangetal., 2017)。

長(zhǎng)孢蠟蚧菌L.longisporum是一種重要的蟲(chóng)生真菌，以前被廣泛地稱(chēng)為蠟蚧輪枝菌Verticilliumlecanii。蠟蚧輪枝菌是一個(gè)復(fù)合種，其寄主廣泛，可寄生蚜蟲(chóng)、介殼蟲(chóng)、螨蟲(chóng)、真菌等不同類(lèi)型。國(guó)內(nèi)外在蠟蚧輪枝菌菌株篩選、發(fā)酵生產(chǎn)和制劑加工上均取得顯著進(jìn)展，已登記的生物農(nóng)藥Vealrtec?，對(duì)溫室蚜蟲(chóng)和粉虱防治具有很好的效果(Goetteletal., 2008)。Gams和Zare于2001年通過(guò)ITS序列分析將蠟蚧菌從輪枝菌屬中分出，建立蠟蚧菌屬Lecanillium(Gams and Zare, 2001)，隨后，又逐漸將蠟蚧菌中的部分株系歸為蠟蚧菌屬的其他種。蠟蚧菌屬現(xiàn)有21個(gè)種，其中與昆蟲(chóng)有關(guān)的主要有蠟蚧菌L.lecanii， 漸狹蠟蚧菌L.attenuatum， 長(zhǎng)孢蠟蚧菌L.longisporum，L.muscarium和L.nodulosum5個(gè)種(Goetteletal., 2008)。

微生物農(nóng)藥可以大幅降低化學(xué)殺蟲(chóng)劑用量及其在農(nóng)產(chǎn)品中的殘留，是無(wú)公害農(nóng)產(chǎn)品首選藥劑。但微生物農(nóng)藥發(fā)展速度緩慢，目前用于蚜蟲(chóng)防治的不多，主要原因在于真菌孢子萌發(fā)需要特定的條件，如溫度和濕度。有研究表明蠟蚧輪枝菌V.lecanii在100%RH條件下至少需要36 h才能侵染蚜蟲(chóng)(Alavoetal., 2002)。利用長(zhǎng)孢蠟蚧菌防治桔粉蚧殼蟲(chóng)Planococcuscitri， 棉蚜Aphisgossypii， 甘藍(lán)蚜Brevicorynebrassicae， 麥無(wú)網(wǎng)長(zhǎng)管蚜Metopolophiumdirhodum和根結(jié)線蟲(chóng)Meloidogyneincognita等已有相關(guān)報(bào)道(Kimetal., 2010; 蘭木佐, 2010; Safooraetal., 2014; Baiswaretal., 2016; Sepidehetal., 2017)。以上研究結(jié)果均為在室內(nèi)可控條件下取得的，但在實(shí)際生產(chǎn)環(huán)境中殺蟲(chóng)效果仍不確定。因此，應(yīng)深入研究了解寄主與病原菌之間的關(guān)系、病原菌的侵染機(jī)制及其田間的流行學(xué)等特點(diǎn)，才能使微生物農(nóng)藥得到更大的發(fā)展。我國(guó)北方地區(qū)蔬菜溫室具有真菌發(fā)生的適宜溫度和濕度，為昆蟲(chóng)病原真菌的發(fā)生創(chuàng)造了良好的環(huán)境條件，微生物農(nóng)藥的應(yīng)用前景值得關(guān)注。

雖然長(zhǎng)孢蠟蚧菌TF-2對(duì)豌豆蚜具有較好侵染效果。但由于病原真菌受到溫度、濕度、光照、生物等外界環(huán)境因素的影響，其在溫室和田間應(yīng)用效果還有待于進(jìn)一步研究明確，后續(xù)我們將針對(duì)長(zhǎng)孢蠟蚧菌防治豌豆蚜的應(yīng)用策略與劑型等開(kāi)展相關(guān)研究。本研究得到的長(zhǎng)孢蠟蚧菌TF-2分離自甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)苜蓿實(shí)驗(yàn)基地自然染病的豌豆蚜蟲(chóng)尸，屬首次在甘肅發(fā)現(xiàn)，為今后在蔬菜溫室或大田作物中害蟲(chóng)生物防治提供了菌種資源。