少見諾卡菌的鑒定及其藥物敏感性分析

馮 雪，魏 華，馬依努爾·阿布都熱合曼，徐菲莉

(新疆醫(yī)科大學附屬中醫(yī)醫(yī)院檢驗科，新疆烏魯木齊 830000)

諾卡菌屬為革蘭陽性需氧放線菌，感染通常由創(chuàng)傷相關細菌侵入或通過吸入方式導致[1]。利用表型和分子生物學方法，諾卡菌屬已被鑒定出89個種[2]。臨床感染患者標本中分離到的諾卡菌以星形諾卡菌和巴西諾卡菌最常見，而皮疽諾卡菌、喬治教堂諾卡菌和豚鼠耳炎諾卡菌報道中較少見。本文對本院近2年收治患者中3例少見諾卡菌的臨床鑒定和藥物敏感性試驗進行分析，以提高對諾卡菌感染的認識，現(xiàn)報道如下。

1 資料與方法

1.1一般資料 選取本院于2017年3月至2019年3月確診諾卡菌病的3例患者，具體資料如下。

病例1，男性，59歲，以“腦膿腫術后”于2017年12月29日收住本院。入院診斷：小腦膿腫術后；肺部感染；類風濕性關節(jié)炎；2型糖尿病；營養(yǎng)不良。腦CT提示右側(cè)小腦半球多發(fā)感染灶；肺CT提示雙肺多發(fā)感染并胸腔少量積液，雙側(cè)后壁胸膜增厚。臨床給予伏立康唑片，頭孢哌酮鈉/他唑巴坦抗感染治療，治療效果不佳，1月14日送腦部感染灶膿液細菌培養(yǎng)。

病例2，男性，52歲，以“咳嗽、咳痰反復半年余，加重伴咯血3 d”于2019年1月7日收住本院。入院診斷：咯血原因待查。肺部CT提示雙肺多發(fā)支擴并感染。臨床給予哌拉西林/他唑巴坦鈉聯(lián)合乳酸環(huán)丙沙星氯化鈉抗感染治療。1月9日行支氣管鏡檢查送肺泡灌洗液細菌培養(yǎng)。

病例3，男性，77歲，以“反復嗆咳伴進行性吞咽困難、食欲下降2月余”于2019年2月7日收住本院。入院診斷為“肺惡性腫瘤、鱗狀細胞癌、聲門下惡性腫瘤、肺栓塞(L7、R4、L8、L9)、支氣管擴張伴感染、雙側(cè)胸腔積液、聲門下喉惡性腫瘤、2型糖尿病、低鉀血癥、支氣管哮喘(非危重)”?；颊?0余年前患有“肺結核”。胸片提示兩肺多發(fā)感染?；颊呷朐寒斖沓霈F(xiàn)昏迷轉(zhuǎn)入重癥監(jiān)護室，使用美羅培南針抗感染治療。2月8日行纖維支氣管鏡取痰送痰細菌培養(yǎng)。

1.2儀器與試劑 VITEK MS微生物鑒定儀購自法國梅里埃公司；試驗所用哥倫比亞血平板、中國藍平板、巧克力平板均購自中國廣州迪景公司；試劑購自中國溫州康泰生物科技有限公司，均在有效期內(nèi)。質(zhì)控菌株包括大腸埃希菌ATCC 8739、金黃色葡萄球菌ATCC 29213、大腸埃希菌ATCC 35218。

1.3方法

1.3.1細菌鑒定 參照《臨床檢驗操作規(guī)程》第4版中的細菌鑒定方法[2]，取呼吸道標本接種哥倫比亞血平板、中國藍平板和巧克力平板，且肺泡灌洗液采用定量接種；膿液標本接種哥倫比亞血平板和中國藍平板，置5%CO2、35 ℃培養(yǎng)24 h后觀察菌落。通過菌落形態(tài)、革蘭染色和改良抗酸染色初步鑒定到諾卡菌屬，后采用VITEK MS微生物鑒定儀鑒定(可信度60.0%～99.9%)菌種。

1.3.2藥物敏感性試驗 根據(jù)美國臨床實驗室標準化協(xié)會(CLSI)標準，諾卡菌應采用微量肉湯稀釋法檢測藥物敏感性，并選用CLSI推薦用于諾卡菌的藥物，試驗藥物包括：亞胺培南、莫西沙星、復方磺胺甲基異噁唑、環(huán)丙沙星、頭孢曲松、阿莫西林/克拉維酸、米諾環(huán)素、利奈唑胺、阿米卡星9種抗菌藥物。藥物敏感性試驗接種物的制備參照CLSI M24的推薦方法：將培養(yǎng)5 d的菌落用無菌棉簽刮取至裝有玻璃珠的培養(yǎng)管中，震蕩培養(yǎng)管將菌塊打碎，取上清菌懸液配制成0.5麥氏水平，調(diào)節(jié)菌液水平為5×105cfu/mL。將配制好的菌懸液加入試驗藥物，放置35 ℃孵育3 d，每日觀察結果直至第5日，判讀最低抑菌濃度(MIC)值。

2 結 果

2.1細菌鑒定結果 病例1：膿液培養(yǎng)24 h血平板上長出白色、細小、干燥菌落，48 h變成顆粒狀，延長培養(yǎng)時間，白色干燥菌落變得濕潤，5～7 d后變成橙黃色。革蘭染色菌落易乳化，鏡下可見革蘭陽性細菌呈球狀、短桿狀，長桿狀細菌少見，大小不一、有分支、著色不均勻。改良抗酸染色弱陽性，初步鑒定為諾卡菌屬，用VITEK MS鑒定為皮疽諾卡菌，儀器鑒定率為99.9%。2018年1月18日向臨床回報鑒定結果。病例2：肺泡灌洗液培養(yǎng)24 h血平板上未見明顯生長，48 h可見白色、干燥、顆粒狀菌落，部分菌落表面有皺褶，3～7日后干燥、皺褶菌落堆疊，呈黃色。革蘭染色菌落不易乳化，鏡下可見革蘭陽性細菌呈細長絲狀、大小不一，有分支，著色不均勻。改良抗酸染色弱陽性，初步鑒定為諾卡菌屬，用VITEK MS鑒定為喬治教堂諾卡菌，儀器鑒定率為99.9%。2019年1月14日，2份肺泡灌洗液培養(yǎng)結果一致，且菌量大于105cfu/mL。臨床補充診斷：諾卡氏菌肺炎。病例3：2019年2月9日痰涂片回報，查見革蘭陽性桿菌形似諾卡菌。痰細菌培養(yǎng)24 h血平板上未見明顯生長，48 h可見白色、干燥、粗顆粒狀菌落，3～7 d后菌落變大、干燥、皺褶卷曲、由白色變?yōu)辄S色。革蘭染色菌落較難乳化(可用壓片的方式)，鏡下可見革蘭陽性細菌呈細長、分支狀菌落、大小不一、形態(tài)不規(guī)則。改良抗酸染色弱陽性，初步鑒定為諾卡菌屬，用VITEK MS鑒定為豚鼠耳炎諾卡菌，儀器鑒定率為99.9%。2月12日痰培養(yǎng)結果回報，由于患者病情較重家屬放棄治療，于2019年2月14日宣布死亡。

表1 3種諾卡菌對9種抗菌藥物的MIC值(μg/mL)

2.2藥物敏感性試驗結果 判斷標準參照CLSI諾卡菌微量肉湯稀釋法藥物敏感性試驗解釋標準，見表1。

2.3臨床治療效果 病例1：皮疽諾卡菌對檢測的9種藥物均敏感。臨床根據(jù)藥物敏感性結果改用復方磺胺甲噁唑片和亞胺培南西司他丁鈉抗感染治療，經(jīng)過治療患者病情好轉(zhuǎn)出院。病例2：喬治教堂諾卡菌對環(huán)丙沙星和阿莫西林/克拉維酸耐藥，其余7種藥物敏感。臨床改用復方磺胺甲噁唑片抗感染治療，患者經(jīng)治療明顯好轉(zhuǎn)出院。病例3：豚鼠耳炎諾卡菌對亞胺培南、頭孢曲松和阿莫西林/克拉維酸耐藥，其余6種藥物均敏感。由于患者病情較重，未得到有效治療。

3 討 論

諾卡菌隸屬于放線菌綱、放線菌目、諾卡菌科，廣泛分布于自然界中。臨床上多由外傷進入皮膚或經(jīng)呼吸道吸入引起局部皮膚或肺部感染[3]，主要發(fā)生于伴有基礎疾病以及免疫功能低下者、免疫功能正常者也可患病[4]。諾卡菌屬為臨床不常見病原菌，感染癥狀缺乏特異性，實驗室的檢測技術能力有限，且該菌生長緩慢，培養(yǎng)陽性率低，極易造成漏診、誤診[5]。在中國，最常見的諾卡菌是星形諾卡菌和巴西諾卡菌[6-7]。本報道中發(fā)現(xiàn)的這3株諾卡菌為臨床少見的諾卡菌。

皮疽諾卡菌多引起亞急性或慢性化膿性炎癥，尤其是細胞免疫低下患者，是諾卡菌中較為少見但最容易引起播散性感染的亞種[8]。據(jù)MOYLETT等[9]報道，其隨訪的30多例患者中有1/3涉及中樞神經(jīng)系統(tǒng)，病例1中的患者與其報道相似。該患者類風濕性關節(jié)炎多年，長期服用糖皮質(zhì)激素，合并糖尿病、營養(yǎng)不良，屬于免疫低下人群，此次腦部多發(fā)膿腫，肺部感染雖未明確致病菌，但在腦部膿液中培養(yǎng)出了皮疽諾卡菌，為臨床診斷提供了明確的病原菌。該菌的藥物敏感性試驗對亞胺培南、莫西沙星、復方磺胺甲基異噁唑、環(huán)丙沙星、頭孢曲松、阿莫西林/克拉維酸、米諾環(huán)素、利奈唑胺、阿米卡星9種抗菌藥物均敏感，與CLSI M24[10]中報告的基本一致。臨床采用手術治療，配合復方磺胺甲噁唑和亞胺培南西司他丁鈉聯(lián)合治療，患者病情好轉(zhuǎn)出院。

喬治教堂諾卡菌廣泛分布于土壤中，臨床報道較少，該菌引起的肺諾卡菌病臨床表現(xiàn)多樣，缺乏特異性[11]。病例2中的患者咳嗽、咳痰半年余，肺CT示肺部多發(fā)感染灶。臨床醫(yī)生根據(jù)患者的病情，通過纖維支氣管鏡檢查，送支氣管肺泡灌洗液細菌培養(yǎng)，結果兩份支氣管肺泡灌洗液均培養(yǎng)出大于105cfu/mL的喬治教堂諾卡菌。該菌的藥物敏感性試驗對環(huán)丙沙星和阿莫西林/克拉維酸耐藥，其余7種藥物敏感。臨床根據(jù)微生物報告調(diào)整用藥，患者病情明顯好轉(zhuǎn)，整個診斷過程為7 d。對于肺諾卡菌病而言，細菌培養(yǎng)和鑒定是診斷肺諾卡菌病的金標準[11]。

豚鼠耳炎諾卡菌引起人類感染的報道相對較少，可能與其致病力低、土壤中分布不廣泛或病例漏報有關[12]。該菌引起的諾卡菌病的發(fā)生和傳播途徑與機體的抵抗力有密切關系[13]。病例3中的患者患有腫瘤，且合并多種基礎疾病，屬于機體免疫嚴重低下患者，肺部感染較重。本實驗室在痰涂片中發(fā)現(xiàn)疑似諾卡菌并電話回報，由于患者病情較重，家屬放棄治療，最終未得到有效治療。諾卡菌生長緩慢，呼吸道標本中易受到正常菌群的干擾，極易造成漏檢。因此，實驗室對于臨床疑似諾卡菌的標本，應重視標本的直接涂片，及時發(fā)現(xiàn)可能存在的不易生長的細菌，延長培養(yǎng)時間。該菌對亞胺培南、頭孢曲松和阿莫西林/克拉維酸耐藥，其余6種藥物敏感，與CLSI M24[10]中報告的一致。

諾卡菌感染目前缺乏特異的診斷指標，對臨床可疑諾卡菌病的患者應多次、多部位采集標本進行病原學檢查，必要時進行有創(chuàng)檢查采集標本。臨床醫(yī)生或檢驗科人員懷疑諾卡菌感染時，應互相溝通，互相協(xié)助。諾卡菌的菌落形態(tài)和革蘭染色沒有明顯的差異，僅憑細菌培養(yǎng)及生化鑒定很難鑒定到種，質(zhì)譜分析儀有助于提高諾卡菌的鑒定，但目前16S rRNA測序仍是鑒定諾卡菌最可靠的方法[14]。諾卡菌屬的抗菌藥物敏感性因種類不同而異[15]，本報道中除1例患者家屬放棄治療外，其余2例醫(yī)生根據(jù)藥物敏感性試驗結果，臨床治療有效。臨床醫(yī)生應根據(jù)患者的臨床癥狀體征、實驗室檢查、影像學檢查、結合有創(chuàng)檢查，如纖維支氣管鏡等，早期做出診斷并治療，對患者的療程和預后至關重要。

4 結 論

質(zhì)譜儀有助于提高諾卡菌菌種的鑒定水平。諾卡菌屬的抗菌藥物敏感性因菌種不同而異，臨床醫(yī)生應結合藥物敏感性試驗結果指導臨床治療。