耐碳青霉烯類肺炎克雷伯菌耐藥機(jī)制研究進(jìn)展

趙潤芝 劉佳欣 葉寰

首都醫(yī)科大學(xué)附屬復(fù)興醫(yī)院感染科,北京100038

肺炎克雷伯菌 (Klebsiella pneumoniae,Kpn)是一種革蘭染色陰性的機(jī)會性致病菌,屬于腸桿菌科肺炎克雷伯菌屬,Kpn有莢膜包覆,不運(yùn)動,對外界抵抗力強(qiáng),易對多數(shù)抗生素產(chǎn)生耐藥性,主要存在于人體呼吸道和消化道。近年來,由于抗生素在臨床上的廣泛應(yīng)用,越來越多的耐藥菌被檢出[1]。以亞胺培南、美羅培南為代表的碳青霉烯類藥物是β-內(nèi)酰胺類藥物的一種,其具有的廣譜抗菌活性、持續(xù)的抗菌后效應(yīng)以及較低毒性使其在臨床上通常用作感染治療的最后防線。而近年出現(xiàn)的耐碳青霉烯類肺炎克雷伯菌 (carbapenem-resistant Klebsiella pneumoniae,CRKP)除對于碳青霉烯類抗生素存在耐藥性以外,還對青霉素類、頭孢類、氨基糖苷類和喹諾酮類藥物存在耐藥性,呈現(xiàn)出多重耐藥的現(xiàn)況[1],形勢十分嚴(yán)峻。

1 流行病學(xué)

自1997年Mac Kenzie等首次報道了CRKP后[2],加拿大、巴西、英國、法國、中國等很多國家陸續(xù)報道CRKP感染病例。2014-2015年間國內(nèi)Kpn中CRKP的總體檢出率為8%,在大城市如北京和上海的檢出率高達(dá)19%和20%[3]。高檢出率同時伴隨著高死亡率,國外的一項meta分析顯示接受抗生素治療后CRKP 的總體死亡率達(dá)到了37.2%[4];同時CRKP 感染帶來的醫(yī)療花費(fèi)也是巨大的,每例感染平均花費(fèi)達(dá)到22 962美元,最高達(dá)42 972美元[5]。調(diào)查表明,院內(nèi)呼吸機(jī)、尿管的使用等會增加CRKP 導(dǎo)致的重癥肺炎、尿路感染和敗血癥等嚴(yán)重疾病風(fēng)險,對患者的生命安全造成了極大的威脅[6]。除此之外,目前已有高毒性Kpn多重耐藥的相關(guān)報道[7],臨床上更需警惕其感染的發(fā)生。

2 耐藥原因

研究表明污水處理廠向接收河流排放污水是耐藥基因以及耐藥菌釋放入環(huán)境的重要途徑[8],而食物中有時也可存在產(chǎn)耐 藥 的 超 廣 譜β-內(nèi) 酰 胺 酶 (extended-spectrum βlactamase,ESBL)或Amp C 酶的細(xì)菌[9]。這些耐藥基因通過質(zhì)粒和轉(zhuǎn)座子的水平傳播造成了CRKP 的蔓延。Navon-Venezia等[10]統(tǒng)計的Kpn的質(zhì)粒上耐藥基因的數(shù)據(jù)顯示,大部分β-內(nèi)酰胺類和氨基糖苷類抗生素的耐藥基因都可以在質(zhì)粒中找到,表明質(zhì)?？梢猿蔀槟退幓騻鞑サ挠行浇?同時也有部分通過突變產(chǎn)生的耐藥基因,如編碼NDM-1型碳青霉烯酶的基因blaNDM-1等。

抗生素的耐藥基因起初是在土壤的細(xì)菌中發(fā)現(xiàn)的,是細(xì)菌為了防止其產(chǎn)生的抗生素對自身造成影響進(jìn)化而來的,而當(dāng)前的耐藥現(xiàn)狀是微生物在人類活動的影響下產(chǎn)生的,具體方式如下。

2.1 “自然”選擇 當(dāng)環(huán)境中存在抗生素時,抗生素會誘發(fā)細(xì)菌產(chǎn)生氧化應(yīng)激,過程中產(chǎn)生的活性氧會誘導(dǎo)SOS應(yīng)答 (DNA 損傷修復(fù)的重要途徑),一旦觸發(fā)SOS應(yīng)答,基因突變的基礎(chǔ)概率、基因重組的概率以及水平基因傳播的潛力等都會提高,導(dǎo)致耐藥基因的產(chǎn)生及傳播概率提高[11]。一項在美國的研究表明,不科學(xué)的經(jīng)驗(yàn)性用藥會使得耐碳青霉烯類腸桿菌導(dǎo)致的尿路感染、肺炎或休克的發(fā)生率增加4倍[12]。除此之外,一項隊列分析顯示美羅培南和頭孢吡肟的長時間應(yīng)用會增加CRKP 感染的發(fā)生率,每多一天的應(yīng)用會使耐藥發(fā)生率提高19% (美羅培南)和22% (頭孢吡肟)[13],其他碳青霉烯類、環(huán)丙沙星、廣譜頭孢菌素的應(yīng)用都是Kpn產(chǎn)生耐藥的危險因素。這是由于這些藥物為細(xì)菌提供了一個相對強(qiáng)大的環(huán)境進(jìn)行進(jìn)化選擇,使得耐藥的細(xì)菌成為優(yōu)勢菌落,進(jìn)行繁殖和傳播。

2.2 共同選擇 含有抗性基因的質(zhì)粒通常會收集不同的抗性基因,環(huán)境對其中一種抗性基因的選擇可以同時選擇在同一質(zhì)粒上的其他基因。比如當(dāng)blaCTX-M(介導(dǎo)產(chǎn)生ESBL的基因)與blaKPC(介導(dǎo)產(chǎn)生KPC 類碳青霉烯酶的基因)存在于同一菌株同一個移動基因元件上時,廣譜頭孢菌素類抗生素的暴露就能夠共同選擇blaCTX-M和blaKPC2個基因[14]。

2.3 交叉耐藥 Wand 等[15]的研究表明Kpn 在洗必泰(醫(yī)用消毒液)的暴露下會使PhoPQ 基因突變,從而上調(diào)一些基因的表達(dá) (如pmr D、pmr K),使其對多黏菌素產(chǎn)生耐藥,這種交叉耐藥的產(chǎn)生為院內(nèi)的感染防控提出了更高的要求。

3 耐藥機(jī)制

3.1 外膜孔道蛋白的缺失 眾所周知,抗生素必須通過細(xì)菌外膜才能進(jìn)入細(xì)菌內(nèi)與其作用位點(diǎn)結(jié)合,如青霉素結(jié)合蛋白 (penicilin binding protein,PBP),而對于β-內(nèi)酰胺類藥物來說,其疏水和帶電的性質(zhì)使其只能通過外膜上的孔道蛋白入菌。Kpn外膜上存在有功能的孔道蛋白Omp K35、Omp K36和沉默的孔道蛋白Omp K37。一家巴西醫(yī)院的統(tǒng)計研究中,幾乎90%以上的CRKP有孔道蛋白的缺失并且大部分伴隨碳青霉烯酶的產(chǎn)生[16]。Wong等[17]研究發(fā)現(xiàn),ST258株CRKP的Omp K36蛋白變異導(dǎo)致其孔道蛋白的胞外域L3中谷氨酸和天冬氨酸的插入,造成了孔徑的縮小,使得美羅培南等碳青霉烯類抗生素進(jìn)入細(xì)菌內(nèi)的量減少,導(dǎo)致了耐藥的產(chǎn)生。如果孔道蛋白持續(xù)介導(dǎo)抗生素入胞,β-內(nèi)酰胺酶的作用效果會大大減弱,正如研究表明的已產(chǎn)碳青霉烯酶的Kpn若伴孔道蛋白的缺失會使其對于碳青霉烯類抗生素的最小抑菌濃度值成倍增加[18]。除此之外,Brunson等[18]的結(jié)果表明孔道蛋白的缺失可能與各種毒力因子的生成變化有關(guān),并且可以提高細(xì)菌在宿主內(nèi)的生存率,使細(xì)菌在吞噬細(xì)胞的免疫攻擊下存活。

3.2 外排泵的過度表達(dá) 細(xì)菌表面的外排泵是將進(jìn)入細(xì)菌內(nèi)的有害物質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)出細(xì)菌的轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白,其過量表達(dá)會導(dǎo)致細(xì)菌內(nèi)的抗生素濃度降低,導(dǎo)致細(xì)菌耐藥的產(chǎn)生。對于CRKP來說,主要是Acr AB-TolC系統(tǒng)和Oqx AB系統(tǒng)起著重要的作用。

Acr AB-TolC是由外膜通道蛋白Tol-C (三聚體)、分布在內(nèi)膜的次級轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白AcrB (三聚體)以及位于周質(zhì)的將2個膜蛋白連接起來的Acr A (六聚體)組成的三聯(lián)體[19],是一種RND 型的外排泵,能夠捕捉細(xì)胞質(zhì)內(nèi)的底物并直接將其排至細(xì)胞外的溶液內(nèi),使得底物需要重新入胞跨過低通透性的外膜來介導(dǎo)耐藥。AcrB的底物涵蓋非常廣泛,包括除氨基糖苷類之外所有的抗生素、染料、游離脂肪酸等。

Oqx AB外排泵的基因可以存在于染色體上或者移動基因元件上,能夠介導(dǎo)高水平的氟喹諾酮類的耐藥[20]。在臨床中分離出的KPBj1E+株Kpn經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)是Oqx AB 的過度表達(dá)導(dǎo)致的,是由于Oqx AB外排泵的抑制基因Oqx R 的點(diǎn)突變,導(dǎo)致其抑制作用消失,使得外排增加[21]。

3.3 產(chǎn)碳青霉烯酶 碳青霉烯酶是一種可以水解青霉素、頭孢菌素、碳青霉烯類等多種抗生素的一種β-內(nèi)酰胺酶。如果細(xì)菌產(chǎn)生此類酶,那么將通過該酶水解抗生素的方式達(dá)到耐藥的目的,是CRKP產(chǎn)生碳青霉烯類抗生素耐藥性的主要機(jī)制。Ambler分類法將β-內(nèi)酰胺酶分為A、B、C、D 四類,A、C、D 類為絲氨酸活性位點(diǎn)類,B 類為金屬酶活性位點(diǎn)類[22],或者可以根據(jù)其本身的活化是否需要二價陽離子分為金屬碳青霉烯酶 (Zn2+依賴B 型),以及非金屬碳青霉烯酶 (非Zn2+依賴A、C、D 型)。在CRKP中常見的碳青霉烯酶的類型為A、B、D 類,C 類少見,所以本文主要探討常見的A、B、D 類碳青霉烯酶。

3.3.1 非金屬碳青霉烯酶 以絲氨酸為活性位點(diǎn)的A、D碳青霉烯酶利用其特有的親核作用攻擊β-內(nèi)酰胺環(huán)的C-N鍵,以達(dá)到水解作用,可以被克拉維酸 (β-內(nèi)酰胺酶抑制劑)抑制[23]。

A 類碳青霉烯酶分為6小類,其中肺炎克雷伯菌碳青霉烯酶 (Klebsiella pneumoniae carbapenemase,KPC)是最多見的一類。目前已知至少有18種KPC 的變異體,其中KPC-2和KPC-3是最常見也是研究最清楚的2種。自從2001年在美國東部發(fā)現(xiàn)并詳細(xì)介紹的第1 例產(chǎn)KPC-1 的Kpn后,世界各地相繼報道發(fā)現(xiàn)[24]。其中在我國流行的是ST11株[25],全球范圍內(nèi)流行的是ST258株。耐藥性的獲得主要是通過質(zhì)粒IncFⅡ攜帶編碼KPC 的基因blaKPC進(jìn)行水平傳播的,其中較為多見的是攜帶有轉(zhuǎn)座子Tn4401 的IncFⅡ質(zhì)?！猵 Kp QIL質(zhì)粒,同時也有極少量blaKPC存在于未攜帶Tn4401轉(zhuǎn)座子的質(zhì)粒上[26]。除了質(zhì)粒和轉(zhuǎn)座子進(jìn)行水平傳播外,整合性接合元件 (integrative and conjugative element,ICE)也可以進(jìn)行傳播。除了在化膿性肝膿腫患者中分離出的Kpn中發(fā)現(xiàn)的ICE1之外[27],研究發(fā)現(xiàn)在ST11 株以及ST258 株中均有ICE2 的存在,與ICE1同時存在時加強(qiáng)ICE1質(zhì)粒移動的作用[28],這為耐藥基因水平傳播提供了更進(jìn)一步理解。ST258株全球流行的原因可能與其表面存在的多糖屏障有關(guān)。Castillo等[29]研究表明ST258株表面脂多糖的多糖部分可以在不激活活性氧以及中性粒細(xì)胞外誘捕網(wǎng)的情況下,即不激活殺菌反應(yīng)的前提下侵入人體而致病。許多臨床研究中發(fā)現(xiàn)ST11 株合并高毒力的基因,產(chǎn)生了高毒力的CRKP[7],這對臨床的治療帶來了巨大的困難。

D 類碳青霉烯酶為苯唑西林酶 (oxaclillinase,OXA),根據(jù)其氨基酸的序列可分為12小類,其中OXA-48是水解亞胺培南最有效的同時也是最常見的OXA 之一。自2003年于土耳其在Kpn 中發(fā)現(xiàn)了OXA-48 之后[30],10 種OXA-48的變異體相繼被發(fā)現(xiàn),并且曾流行于土耳其、摩洛哥、利比亞、埃及、印度等地,目前我國只有臺灣曾報道過[31],OXA-48不只在醫(yī)院被發(fā)現(xiàn),在社區(qū)、環(huán)境、食物鏈、動物中均有蹤跡[32]。OXA-48 基因blaOXA-48大多存在于質(zhì)粒上,如質(zhì)粒p OXA-48a在Kpn中的傳播起到了重要作用,其強(qiáng)大的轉(zhuǎn)移能力是由于轉(zhuǎn)座子Tn1999的插入使其對轉(zhuǎn)移抑制基因的去激活產(chǎn)生的[33],而存在于染色體上的blaOXA-48的ST11株在中國臺灣也發(fā)現(xiàn)過[34]。臨床中頭孢他啶/阿維巴坦的聯(lián)合治療對于產(chǎn)OXA-48的腸桿菌屬引起的感染效果較好[35],但是研究發(fā)現(xiàn)blaOXA-48在頭孢菌素的暴露或者頭孢菌素聯(lián)合阿維巴坦的暴露下,會造成OXA-48蛋白的單個堿基或2個堿基的替換,從而促進(jìn)其水解頭孢菌素的能力,以及降低阿維巴坦對細(xì)菌的抑制能力[36],這使得其治療有一些棘手。

3.3.2 金屬碳青霉烯酶 B類碳青霉烯酶屬于金屬碳青霉烯酶類,即需要Zn2+或其他的重金屬離子進(jìn)行催化來發(fā)揮作用,此類酶的底物幾乎包括所有碳青霉烯類,以及除單環(huán)β-內(nèi)酰胺類之外的所有β-內(nèi)酰胺類抗生素,可以被乙二胺四乙酸抑制但不能被克拉維酸抑制。該酶結(jié)構(gòu)中的氫氧根離子對β-內(nèi)酰胺環(huán)羧基的碳進(jìn)行親核攻擊,接著鋅使得裂開的β-內(nèi)酰胺環(huán)中氮質(zhì)子化,造成了酶的失活[23]。

B類碳青霉烯酶包括VIM、IMP 以及NDM 組,其中NDM 的臨床意義最大,尤其是NDM-1。NDM 首次是在2009年從印度回瑞典的患者身上的Kpn和大腸桿菌中檢測到的,命名為NDM-1[37]。自那以后,全球開始廣泛流行。目前共發(fā)現(xiàn)21 種NDM 的變異體,并且大部分分布在亞洲,尤其是我國和印度[38],而且多見于兒童和青少年患者[39]。NDM-1絕大部分通過水平傳播,很多如IncF、Inc A/C、Inc HI3、Inc X 等質(zhì)粒均可以攜帶blaNDM-1[40];在鮑曼不動桿菌中發(fā)現(xiàn)的blaNDM-1存在于一個兩端為ISAba125的復(fù)合轉(zhuǎn)座子之間[41],同樣在CRKP 中也有各種截短的ISAba125之間存在blaNDM-1,這與其傳播可能也有一定關(guān)系[42]。除了進(jìn)行水平傳播之外,一株發(fā)現(xiàn)于泰國的Kpn的全基因組測序中發(fā)現(xiàn)其blaNDM-1也可以存在于染色體上[43],這對了解NDM-1 的傳播方式有重要的意義。由于NDM 不是β-內(nèi)酰胺酶抑制劑的靶標(biāo),因此其在臨床上的治療非常棘手。最近的一項研究表明非β-內(nèi)酰胺類的β-內(nèi)酰胺酶抑制劑阿維巴坦對于產(chǎn)NDM 的Kpn是有效的,雖然阿維巴坦并沒有直接的殺菌作用,但是它可以特異地與PBP2結(jié)合,從而將細(xì)菌的形態(tài)從棒狀改變?yōu)榍蛐?使其對LL-37抗菌肽的敏感性增加,提高了其滅菌能力,此外,阿維巴坦還可以增強(qiáng)補(bǔ)體介導(dǎo)的殺菌作用以及增加細(xì)菌對中性粒細(xì)胞和血小板殺傷的敏感性[44]。

3.4 產(chǎn)ESBL和AmpC酶 ESBL可以水解三代和四代的頭孢菌素以及單環(huán)β-內(nèi)酰胺類,但是不能水解如頭孢西丁的頭霉素以及碳青霉烯類抗生素,它們通常對β-內(nèi)酰胺酶抑制劑比較敏感。CTX-M、TEM、SHV 等為常檢出的ESBL的種類,其中CTX-M-14 和CTX-M-15 在亞洲比較常見[45]。ESBL的傳播與各種移動基因元件密切相關(guān),如可接合的質(zhì)粒、轉(zhuǎn)座子、整合子等。國內(nèi)產(chǎn)ESBL 腸桿菌的檢出率為46.92%[46],大大高于歐洲國家與日本,形式嚴(yán)峻,不容忽視。

AmpC酶是由染色體編碼的一種C 類β-內(nèi)酰胺酶,也有在質(zhì)粒上的AmpC 酶,屬于ESBL 類的水解酶。AmpC酶可以水解的底物包括青霉素、窄譜的頭孢菌素、氨曲南等,但其特征性地被視為是一種水解頭孢菌素比水解青霉素更強(qiáng)大的酶,對四代頭孢菌素和碳青霉烯敏感,能被β-內(nèi)酰胺類藥物誘導(dǎo)產(chǎn)生,但不能被β-內(nèi)酰胺類的β-內(nèi)酰胺酶所抑制[47]。目前有超過20多種質(zhì)粒Amp C 酶已經(jīng)被發(fā)現(xiàn),全球流行最廣泛的為類CMT-2酶,我國流行最廣泛的為DHA-1型[48]。

在介導(dǎo)Kpn的耐藥時,ESBL 以及AmpC 酶的產(chǎn)生常常伴有外膜孔道蛋白的缺失[49]。不光如此,由于質(zhì)粒對于各種耐藥基因都具有收集能力,因此不同的耐藥機(jī)制可能同時存在于同一耐藥菌株中。

3.5 其他

3.5.1 PBP的改變 PBP最初在流感嗜血桿菌基因組的研究中將其按照相對分子質(zhì)量的大小分為PBP1-8[50]。后來根據(jù)與大腸桿菌同源物結(jié)合的親和力的比較將其重新命名為PBP1A、1B、2、3A、3B、4、5、6。PBP 是細(xì)菌內(nèi)部與β-內(nèi)酰胺酶類抗生素結(jié)合的靶位,細(xì)菌針對PBP的耐藥機(jī)制主要為由于突變導(dǎo)致PBP結(jié)構(gòu)的改變,或者是PBP豐度的改變,使得藥物的結(jié)合力發(fā)生改變。

一項對于臨床中13種化學(xué)結(jié)構(gòu)不同的β-內(nèi)酰胺類抗生素和β-內(nèi)酰胺水解酶抑制劑與Kpn中的PBP結(jié)合的研究中發(fā)現(xiàn),藥物與PBP各靶點(diǎn)結(jié)合的親和力不同,并將其按靶點(diǎn)親和力大小分為PBP3和PBP2或PBP2/4 2組,該發(fā)現(xiàn)為今后合理的藥物聯(lián)用提供了理論基礎(chǔ),即通過針對不同靶點(diǎn)的藥物的聯(lián)用,可以保證抗菌藥物在細(xì)菌中發(fā)揮最大的抑菌效果[51]。

3.5.2 生物膜的形成 細(xì)菌形成生物膜可以幫助它們在宿主體內(nèi)存活下來,同時也是造成慢性和持續(xù)性感染的原因。Vuotto等[52]研究發(fā)現(xiàn)尿路中存在廣泛耐藥的Kpn,該菌株具有著強(qiáng)大生物膜形成的能力,其質(zhì)粒攜帶的基因可能可以直接改變與生物膜形成有關(guān)的基因的表達(dá)。但最近的一項研究表明,91%的CRKP只有較小的可能產(chǎn)生強(qiáng)大的生物膜[53],因此細(xì)菌生物膜的形成與其耐藥性之間的關(guān)系需要更進(jìn)一步的研究。

4 總結(jié)與展望

近年來,CRKP的檢出率不斷提高,感染后所造成的高死亡率以及治療的高費(fèi)用為公共衛(wèi)生安全帶來了極大的挑戰(zhàn)。目前導(dǎo)致CRKP 耐藥的機(jī)制多種多樣,其中以產(chǎn)KPC和NDM 為主的碳青霉烯酶介導(dǎo)的耐藥是最主要的原因,移動基因元件的存在更進(jìn)一步促進(jìn)了耐藥基因的廣泛傳播;另外,孔道蛋白的缺失和外排泵作用的加強(qiáng)在介導(dǎo)耐藥中也起著重要的作用;除此之外,ESBL 以及AmpC酶的產(chǎn)生、PBP 和生物膜的改變等都參與了耐藥的形成。耐藥機(jī)制的研究對今后CRKP 的管控和治療有重要的作用。因此,需要深入耐藥機(jī)制的研究,針對機(jī)制研發(fā)新的藥物,指導(dǎo)臨床的治療,降低死亡率。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突