宮頸腺癌中抑癌基因甲基化的研究進(jìn)展

李銘，王玲，王一男，段雪峰，周順卿，韓麗英

在女性腫瘤中，宮頸癌位居第四位，在發(fā)展中國(guó)家更為多見，嚴(yán)重威脅女性健康。2018年，全球死于宮頸癌的女性約有31.1萬例，其中85%以上來自發(fā)展中國(guó)家[1]。隨著宮頸癌前篩查和宮頸癌疫苗的普及，近年來宮頸癌特別是宮頸鱗癌的發(fā)病率顯著下降，但宮頸腺癌所占比例逐年上升，20世紀(jì)50年代美國(guó)宮頸腺癌占宮頸癌的比例約為5%，現(xiàn)在已達(dá)20%～30%[2]。因有約10%的宮頸腺癌未伴隨人乳頭瘤病毒（human papilloma virus，HPV）感染，且宮頸原位腺癌及宮頸腺癌病變多發(fā)生在宮頸管內(nèi)，具有節(jié)段性和局灶性，細(xì)胞學(xué)標(biāo)本不易采集，相較于鱗狀細(xì)胞，腺細(xì)胞的病理診斷難度較大，故應(yīng)用現(xiàn)有的HPV檢測(cè)和細(xì)胞學(xué)檢查對(duì)宮頸腺癌進(jìn)行早期診斷效果欠佳[2-3]。目前臨床中宮頸腺癌的治療方案與鱗癌大致相同，但研究表明相較于宮頸鱗癌，宮頸腺癌的預(yù)后不佳[4]。

表觀遺傳學(xué)是一種可遺傳性基因調(diào)控模式，可在不改變DNA序列的前提下改變基因結(jié)構(gòu)，主要有DNA甲基化、微小RNA（microRNA）調(diào)控、組蛋白修飾等。其中DNA甲基化研究最為深入。S-腺苷甲硫氨酸的甲基在DNA甲基轉(zhuǎn)移酶（DNA-methyltransferase，DNMT）的作用下共價(jià)結(jié)合到胞嘧啶磷酸鳥嘌呤二核苷酸（CpG）的5′-末端，生成5-甲基胞嘧啶，這一過程稱為DNA甲基化。CpG島是5′-端轉(zhuǎn)錄調(diào)控區(qū)中CpG高度集中的區(qū)域，CpG占比達(dá)60%～70%，多位于啟動(dòng)子區(qū)，有些延長(zhǎng)到編碼區(qū)，其甲基化影響基因的轉(zhuǎn)錄。雖然表觀遺傳機(jī)制是正常生理發(fā)育和基因表達(dá)所必需的，但異常的改變與疾病的發(fā)生有關(guān)，研究發(fā)現(xiàn)抑癌基因的甲基化與腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)[5]。

1 抑癌基因甲基化與宮頸腺癌

1.1 Wnt/β-catenin通路相關(guān)基因 Wnt通路是重要的細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，主要途徑有三條，其中Wnt/β-catenin通路為經(jīng)典通路，參與多種生物學(xué)活動(dòng)，包括調(diào)控基因轉(zhuǎn)錄、細(xì)胞周期、細(xì)胞增殖等。在許多腫瘤中Wnt/β-catenin通路過度激活，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的增殖和轉(zhuǎn)移。一些基因作用于該通路的某些環(huán)節(jié)，抑制其過度激活，從而抑制腫瘤的發(fā)生發(fā)展[6]。DNA甲基化是這些基因失活的重要機(jī)制。

1.1.1 性別決定區(qū)Y框蛋白基因（sex determining region Y-box，SOX） SOX基因家族共有20余個(gè)成員，編碼一系列轉(zhuǎn)錄因子，利用高遷移率族蛋白（HMG）結(jié)構(gòu)域與DNA結(jié)合，在胚胎發(fā)育、細(xì)胞調(diào)控方面發(fā)揮重要作用。SOX家族成員眾多，對(duì)腫瘤的影響各有不同。甲基化是其失活的重要因素[7]。SOX1、SOX17可作用于Wnt/β連環(huán)蛋白（β-catenin）通路中的βcatenin或T細(xì)胞因子/淋巴增強(qiáng)因子（TCF/LEF），使Wnt信號(hào)不能下傳，從而抑制細(xì)胞的過度增殖。Chang等[8]在40例宮頸腺癌手術(shù)切除組織標(biāo)本和45例正常宮頸細(xì)胞學(xué)標(biāo)本中檢測(cè)SOX1甲基化水平，OR=32.0（95%CI：12.2～124.4），23 例宮頸腺癌細(xì)胞學(xué)標(biāo)本和22例正常宮頸細(xì)胞學(xué)標(biāo)本檢測(cè)SOX1甲基化水平，OR=6.23（95%CI：2.63～15.79），提示 SOX1在宮頸腺癌中甲基化水平較高。Hopman等[9]發(fā)現(xiàn)SOX17在宮頸原位腺癌和腺癌中均發(fā)生甲基化，并通過免疫組織化學(xué)染色證實(shí)甲基化導(dǎo)致基因表達(dá)沉默；SOX17甲基化似乎與HPV病毒感染類型和病毒整合無關(guān)。除Wnt/β-catenin通路外，SOX14還可作用于P53通路，Stanisavljevic等[10]通過體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，SOX14在宮頸腺癌細(xì)胞系HeLa細(xì)胞中因甲基化而失活，將SOX14轉(zhuǎn)染入細(xì)胞重新表達(dá)，增強(qiáng)了P53蛋白的穩(wěn)定性，P53通路激活，誘導(dǎo)HeLa細(xì)胞凋亡。

1.1.2 分泌型卷曲相關(guān)蛋白基因（secreted frizzled related proteins，SFRPs） SFRPs基因家族轉(zhuǎn)錄表達(dá)一組分泌型糖蛋白，其與Wnt通路的受體細(xì)胞表面特異性受體卷曲蛋白（frizzled，F(xiàn)z）具有同源性，通過阻礙Fz蛋白與通路中的蛋白質(zhì)結(jié)合，抑制Wnt信號(hào)傳導(dǎo)，促使β-catenin分解，以調(diào)控下游Wnt靶基因的表達(dá)。當(dāng)SFRPs基因甲基化致使基因表達(dá)缺失時(shí)，下游的β-catenin在細(xì)胞內(nèi)累積，Wnt通路異?；罨?，導(dǎo)致細(xì)胞過度增殖[11]。van der Meide等[12]的研究中SFRP2的甲基化率在原位腺癌中為45%（5/11），在腺癌中為84%（38/45），在宮頸上皮內(nèi)瘤變Ⅲ級(jí)（CINⅢ）中為 4%（1/27），在鱗癌中為 39%（11/28），SFRP2基因甲基化在宮頸腺癌中更為普遍，隨腫瘤進(jìn)展甲基化程度逐漸增高；該研究者還對(duì)45例高危型HPV（hrHPV）陽性而細(xì)胞學(xué)檢查正常的宮頸細(xì)胞學(xué)標(biāo)本進(jìn)行SFRP2甲基化檢測(cè)并隨訪5年，其中8例在隨訪18個(gè)月內(nèi)發(fā)生原位腺癌或腺癌，10例在隨訪5年內(nèi)發(fā)生CIN或鱗癌，這些病例的宮頸細(xì)胞學(xué)標(biāo)本中SFRP2均發(fā)生了甲基化，而未發(fā)病者中只有1例發(fā)生甲基化，SFRP2甲基化檢測(cè)可作為HPV陽性分流的方法。Lin等[13]發(fā)現(xiàn)SFRP5在HeLa3rd細(xì)胞和CaSki細(xì)胞中發(fā)生甲基化而表達(dá)缺失，將SFRP5轉(zhuǎn)染入細(xì)胞，細(xì)胞的增殖速度明顯下降，侵襲能力也顯著降低，說明SFRP5可抑制腫瘤細(xì)胞發(fā)生發(fā)展，DNA甲基化是其失活的主要機(jī)制。

1.1.3 DKK3基因 DKK3基因?qū)儆贒ikkopf家族，位于人染色體11p15.3，其表達(dá)的分泌性糖蛋白是Wnt/β-catenin通路的抑制因子，可抑制Wnt信號(hào)傳導(dǎo)，從而調(diào)控細(xì)胞的增殖和凋亡。多種腫瘤中發(fā)現(xiàn)DKK3表達(dá)缺失，大多由其甲基化導(dǎo)致[14]。Zhang等[15]對(duì)100例宮頸腺癌進(jìn)行檢測(cè)發(fā)現(xiàn)有38%發(fā)生DKK3甲基化；隨著腫瘤的浸潤(rùn)和轉(zhuǎn)移，其甲基化水平逐漸增高；相比于不伴DKK3甲基化的患者，伴DKK3甲基化的患者的總生存期較短。DKK3有希望成為宮頸腺癌診斷和預(yù)后的標(biāo)志物。

1.1.4 結(jié)腸腺瘤樣息肉病基因（adenomatous polyposis coli，APC） APC是一種廣泛表達(dá)的多功能蛋白，基因位于人染色體5q22.2，與各種細(xì)胞蛋白相互作用，其中研究最為深入的是其誘導(dǎo)β-catenin分解的能力。APC與β-catenin結(jié)合使其磷酸化并最終降解，抑制Wnt信號(hào)傳導(dǎo)，調(diào)控細(xì)胞的增殖和凋亡[16]。APC的失活有多種機(jī)制，包括等位基因丟失、基因突變和啟動(dòng)子甲基化。APC基因甲基化發(fā)生在乳腺癌、結(jié)直腸癌、肺癌、子宮內(nèi)膜癌等多種腫瘤中。Song等[17]在宮頸腺癌細(xì)胞系HeLa細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)APC基因甲基化，在宮頸鱗癌細(xì)胞系SiHa中未發(fā)現(xiàn)，提示APC基因甲基化可能對(duì)宮頸腺癌影響更大。

1.2 基因表達(dá)調(diào)控相關(guān)基因

1.2.1 鋅指蛋白582基因（zinc finger protein 582，ZNF582） 鋅指蛋白家族是一組常見的轉(zhuǎn)錄因子，其特征是均包含鋅指結(jié)構(gòu)，通過與DNA結(jié)合以調(diào)控靶基因的轉(zhuǎn)錄[18]。ZNF582基因在人染色體19q13.43，其生物學(xué)功能尚未完全明確，可能參與了DNA損傷修復(fù)、細(xì)胞周期調(diào)控以及和腫瘤相關(guān)的各種生物學(xué)活動(dòng)。ZNF582基因在口腔癌、食管鱗癌、結(jié)直腸癌和白血病等惡性腫瘤中常發(fā)生失活，多由DNA甲基化引起[19]。Wu等[20]在167例宮頸腺癌中發(fā)現(xiàn)60%存在ZNF582基因甲基化；ZNF582甲基化陽性者比陰性者的5年無病生存率高；接受了新輔助放化療的患者，ZNF582甲基化程度逐漸降低；體外實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，ZNF582過表達(dá)使HeLa細(xì)胞對(duì)放化療的耐藥性增加，這可能是ZNF582甲基化陽性者預(yù)后較好的原因。ZNF582甲基化水平可作為診斷宮頸腺癌的生物標(biāo)記以及監(jiān)測(cè)放療和化療敏感性的工具。

1.2.2 含MYND結(jié)構(gòu)域的鋅指蛋白10基因（zinc finger MYND domain-containing protein 10，ZMYND10） ZMYND10又名BLU，位于人染色體3p21.3，研究證實(shí)3p21區(qū)域包含多個(gè)腫瘤抑制基因，如 Ras相關(guān)因子（Ras-associated factor 1，RASSF1）和p16等，在腫瘤中常發(fā)生基因表達(dá)缺失；MYND結(jié)構(gòu)域中包含鋅結(jié)合基序，這個(gè)鋅結(jié)合基序包括一個(gè)蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用的位點(diǎn)，使這些含有MYND結(jié)構(gòu)域的蛋白質(zhì)具有抑制轉(zhuǎn)錄的作用；DNA甲基化導(dǎo)致ZMYND10在多種腫瘤中失活，如鼻咽癌、胃癌等[21]。Lai等[22]在研究中發(fā)現(xiàn)ZMYND10在宮頸鱗癌中甲基化率為76%（80/104），在腺癌中甲基化率為 43.5%（10/23）。

1.3 細(xì)胞凋亡相關(guān)基因

1.3.1 Ras相關(guān)區(qū)域家族1A基因（Ras-association domain family 1A gene，RASSF1A） 該基因位于人染色體3p21.3，是一種重要的抑癌基因，參與多種途徑維持基因穩(wěn)定、調(diào)節(jié)細(xì)胞周期、抑制腫瘤細(xì)胞增殖和遷移。已發(fā)現(xiàn)RASSF1A基因甲基化導(dǎo)致其在胃癌、乳腺癌等多種腫瘤中表達(dá)下調(diào)[23]。研究發(fā)現(xiàn)在宮頸癌中RASSF1A普遍發(fā)生甲基化，相比于宮頸鱗癌，腺癌中RASSF1A的甲基化率更高，提示其可能與宮頸腺癌關(guān)系更為密切；RASSF1A在高級(jí)別的宮頸癌或伴隨淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者甲基化率較高，說明RASSF1A甲基化可能與宮頸癌的進(jìn)展有關(guān)；RASSF1A基因發(fā)生甲基化而失活多存在于HPV陰性的宮頸癌中，HPV陽性的宮頸癌中RASSF1A基因則多能正常表達(dá)，表明HPV感染與RASSF1A甲基化存在負(fù)相關(guān)關(guān)系，且這兩個(gè)相互作用的因素可能潛在地決定子宮頸癌亞型的發(fā)展，但具體機(jī)制還需進(jìn)一步研究[24]。

1.3.2 死亡相關(guān)蛋白激酶1基因（death associated protein kinase 1，DAPK1） 基因位于人染色體9p34.1，屬于DAPK家族。DAPK1可參與γ干擾素（IFN-γ）、腫瘤壞死因子 α（TNF-α）、p53 等多種細(xì)胞因子介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡過程，正向調(diào)控細(xì)胞凋亡。甲基化是DAPK1表達(dá)下調(diào)的一項(xiàng)重要因素，被認(rèn)為與宮頸癌密切相關(guān)[25]。Banzai等[26]研究宮頸病變發(fā)現(xiàn)，宮頸腺癌的DAPK1甲基化發(fā)生率為63.4%（7/11），CIN3為 31.8%（7/22），原位癌為 28.6%（4/14），Ⅰ期鱗癌為75.9%（22/29），Ⅱ～Ⅳ期鱗癌為84.6%（11/13）。在宮頸鱗癌和宮頸腺癌中DAPK1均發(fā)生甲基化，且隨著腫瘤的進(jìn)展水平逐漸增高。

1.4 腫瘤細(xì)胞侵襲相關(guān)基因 基質(zhì)金屬蛋白酶組織抑制劑 3基因 （tissue inhibitor of matrix metalloproteinases 3，TIMP3）位于人染色體 22q12.3。基質(zhì)金屬蛋白酶（matrix metalloproteinases，MMPs）可分解基底膜和細(xì)胞外基質(zhì)，促進(jìn)腫瘤新生血管形成，與腫瘤的局部浸潤(rùn)和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。TIMPs可抑制MMPs活性，維持細(xì)胞正常結(jié)構(gòu)和抑制腫瘤細(xì)胞增殖和轉(zhuǎn)移。TIMP3是全功能的MMPs抑制劑，它只存在于細(xì)胞外基質(zhì)中，因此對(duì)MMPs的作用比其他TIMPs更強(qiáng)。乳腺癌、胃癌中均發(fā)現(xiàn)其因甲基化而失活。Kang等[27]發(fā)現(xiàn)TIMP3在宮頸鱗癌中甲基化率為 8.1%（5/62），腺癌為 53%（16/30），TIMP3甲基化似乎與腺癌關(guān)系更加密切。

1.5 其他基因

1.5.1 TAFA趨化因子家族成員4基因（TAFA chemokine like family member 4，TAFA4）又名FAM19A4，位于人染色體3p14.1。TAFA4編碼一種分泌蛋白，為巨噬細(xì)胞中甲?；氖荏w1（formyl peptide receptor 1，F(xiàn)PR1）的配體，可促進(jìn)巨噬細(xì)胞和單核細(xì)胞的遷移和吞噬，增加活性氧的釋放，在免疫中發(fā)揮作用[28]。TAFA4的甲基化抑制其轉(zhuǎn)錄。Vink等[29]在一項(xiàng)橫斷面研究中，在全球范圍內(nèi)共收集了519例宮頸癌患者的宮頸細(xì)胞標(biāo)本，包括宮頸鱗癌318例、腺癌123例、腺鱗癌42例及特殊類型癌36例，聯(lián)合檢測(cè)TAFA4/miR124-2甲基化率為98.3%，單獨(dú)檢測(cè)TAFA4和miR124-2甲基化率分別為94.6%和86.1%，且TAFA4/miR124-2甲基化水平在不同的組織學(xué)類型、分期和HPV感染狀態(tài)均無差異，可作為宮頸癌診斷的標(biāo)志物。

1.5.2 T淋巴細(xì)胞相關(guān)蛋白基因（the myelin and lymphocyte-associated protein gene，MAL） 定位于人染色體2q13，MAL基因編碼一種高度疏水蛋白，是脂質(zhì)筏的重要組成部分，參與上皮細(xì)胞頂端膜蛋白的極化，在T細(xì)胞信號(hào)傳遞、頂端運(yùn)輸、維持細(xì)胞膜流動(dòng)性、構(gòu)成細(xì)胞骨架等多種生物活動(dòng)中發(fā)揮作用。MAL基因啟動(dòng)子甲基化發(fā)生于結(jié)直腸癌、乳腺癌、頭頸鱗癌等多種腫瘤中。Overmeer等[30]檢測(cè)MAL在宮頸病變中的甲基化率，CIN1中為53%（35/66），CIN3中 81%（52/64），宮頸鱗癌中為 96%（90/94），宮頸腺癌中為96%（27/28）。MAL在宮頸鱗癌和宮頸腺癌中均高度甲基化，且隨著病變進(jìn)展甲基化率逐漸增高，MAL可能是宮頸癌潛在的生物學(xué)標(biāo)記。

2 抑癌基因甲基化在宮頸腺癌中的應(yīng)用

DNA甲基化是抑癌基因失活的重要機(jī)制，是當(dāng)前宮頸癌早期篩查和診斷的研究熱點(diǎn)?，F(xiàn)在臨床常用的篩查手段對(duì)宮頸腺癌的作用有限，主要體現(xiàn)在：①HPV篩查敏感度高，但多數(shù)HPV感染可自行消退，且部分腺癌與HPV感染無關(guān)；②就病變部位而言，宮頸腺癌發(fā)生部位多深入宮頸管內(nèi)，細(xì)胞學(xué)檢查難采集到標(biāo)本；③腺細(xì)胞的病理診斷難度較大；④部分患者難以接受經(jīng)陰道采集標(biāo)本的不適感，依從性較差。目前已發(fā)現(xiàn)多種基因DNA甲基化與宮頸腺癌的發(fā)生有直接關(guān)聯(lián)?，F(xiàn)有的甲基化檢測(cè)方法，如重亞硫酸氫鈉修飾后測(cè)序法、實(shí)時(shí)熒光PCR法等敏感度和特異度均較高[31]。通過對(duì)大樣本人群的研究，患者的自采樣本與醫(yī)師采集樣本的結(jié)果無明顯差異，患者自采樣本可大大提高患者的依從性[32]。腫瘤細(xì)胞可向血液內(nèi)釋放DNA，研究發(fā)現(xiàn)，宮頸腺癌患者的血液標(biāo)本和細(xì)胞學(xué)標(biāo)本中RASSF1A甲基化水平無明顯差異，由此可見，相較于現(xiàn)行的宮頸癌篩查方法，DNA甲基化檢測(cè)有希望采用抽血等更為方便的手段[24]。DNA甲基化檢查有可能成為宮頸癌早期篩查和診斷的重要手段。

DNA甲基化是一個(gè)可逆的過程，失活的抑癌基因通過去甲基化可以重新表達(dá)，發(fā)揮抑癌作用。研究已發(fā)現(xiàn)一些物質(zhì)具有去甲基化的功能。地西他濱可強(qiáng)效地抑制DNMT的活性，不僅可逆轉(zhuǎn)宿主細(xì)胞基因的甲基化，還可使HPVE6E7蛋白基因去甲基化[33]。在一項(xiàng)Ⅲ期臨床研究中，接受同步放化療的晚期宮頸癌患者同時(shí)應(yīng)用DNMT抑制劑氫丙嗪和組蛋白去乙?；福╤istone deacetylase，HDAC）抑制劑丙戊酸鈉，與單純接受同步放化療的患者相比，其無病生存期有所延長(zhǎng)[34]。從植物中提取的天然物質(zhì)染料木黃酮可有效地抑制HeLa細(xì)胞中MGMT和HDAC的活性，使多種抑癌基因恢復(fù)表達(dá)[35]。姜黃素可抑制HeLa細(xì)胞和SiHa細(xì)胞中MGMT的活性，逆轉(zhuǎn)維甲酸受體β2（RARβ2）基因甲基化[36]。中藥提取的天花粉蛋白可逆轉(zhuǎn)Cascki細(xì)胞中半胱天冬酶第二線粒體激活因子（Smac）基因的甲基化，使其恢復(fù)對(duì)細(xì)胞凋亡的調(diào)控，并可使腫瘤細(xì)胞對(duì)化療藥更加敏感[37]。去甲基化可作為宮頸癌治療的一個(gè)新方向，研究者們正在尋找更有針對(duì)性、效果更好的藥物。多種抑癌基因的甲基化程度隨腫瘤分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移而提高，與腫瘤的發(fā)展存在密切關(guān)系，如RASSF1A、ZNF582、DKK3等。DNA甲基化也可作為腫瘤治療預(yù)后的標(biāo)記物。

3 結(jié)語與展望

目前，已發(fā)現(xiàn)多種抑癌基因在宮頸腺癌中發(fā)生甲基化，SFRPs、RASSF1A等基因在宮頸腺癌中的甲基化程度較鱗癌中高，SFRPs、DAPK1等基因在原位腺癌中即發(fā)生甲基化，這些基因可作為早期特異性診斷宮頸腺癌的標(biāo)志物。RASSF1A、DKK3等基因的甲基化水平隨宮頸腺癌的進(jìn)展而升高，DKK3、ZNF582等基因的甲基化與宮頸腺癌的預(yù)后密切相關(guān)，這些基因可用于宮頸腺癌預(yù)后和治療效果的評(píng)估。基因甲基化是一個(gè)可逆的過程，通過去甲基化使抑癌基因恢復(fù)表達(dá)，可有效抑制腫瘤細(xì)胞的增殖。但是目前對(duì)宮頸腺癌的抑癌基因甲基化研究尚不充分，多為小樣本研究或細(xì)胞層面研究，且尚未找到特異度和敏感度均較高的基因以供臨床應(yīng)用。針對(duì)宮頸腺癌相關(guān)抑癌基因及其甲基化的研究，將會(huì)為宮頸腺癌的早期診斷和治療提供新的方向。