高效液相色譜法測(cè)定蛹蟲草中噴司他丁的含量

張春楊，楊思廣，張?jiān)?，錢琨，周影，李冰

1. 吉林省蠶業(yè)科學(xué)研究院，吉林 吉林 132000；2. 吉林市食品藥品檢驗(yàn)所，吉林 吉林 132011；3. 德惠市園藝特產(chǎn)工作室，吉林 長(zhǎng)春 130300

噴司他丁是一種抗腫瘤藥物，多由目前已有文獻(xiàn)從基因角度證實(shí)蛹蟲草可以合成噴司他丁，其濃度水平與蛹蟲草的品質(zhì)和毒性有關(guān)。本研究對(duì)蛹蟲草中噴司他丁含量檢測(cè)的提取溶劑、提取時(shí)間、提取方法等參數(shù)進(jìn)行單因素考察，并通過(guò)雙因素完全試驗(yàn)確定了蛹蟲草中噴司他丁含量測(cè)定的提取條件并將提取物經(jīng)質(zhì)譜鑒定確認(rèn)。參照噴司他丁的高效液相色譜條件，檢測(cè)了7種不同來(lái)源的鮮蛹蟲草經(jīng)烘干和凍干不同加工工藝后，噴司他丁的含量差異。發(fā)現(xiàn)凍干組處理后的蛹蟲草中噴司他丁為烘干組的3-5倍。在檢測(cè)中發(fā)現(xiàn)蛹蟲草中的噴司他丁會(huì)隨時(shí)間而分解，這也解釋了前期預(yù)研實(shí)驗(yàn)中購(gòu)買的干蛹蟲草中很難檢測(cè)到噴司他丁的原因。

蛹蟲草Cordyceps militaris又名北冬蟲夏草，由于其功效成分與冬蟲夏草類似，與冬蟲夏草相比又有較大的價(jià)格優(yōu)勢(shì)，目前在市場(chǎng)中的銷售份額逐年攀升。中科院上海植物生理生態(tài)研究所王成樹(shù)研究發(fā)現(xiàn)[1,2]，研究了蛹蟲草中噴司他丁的含量檢測(cè)方法。并比較了我單位生產(chǎn)的7種不同來(lái)源的鮮蛹蟲草經(jīng)烘干和凍干不同加工工藝后，噴司他丁的含量差異。

1 儀器與試藥

1.1 儀器 HERMLE Z36HK高速冷凍離心機(jī)；Thermo Fisher Scientific U-3000高效液相色譜儀（配DAD檢測(cè)器）；Waters e2695-2998高效液相色譜儀（配DAD檢測(cè)器）；HSC-24B水浴氮吹儀；JCX-600Z超聲波清洗機(jī)；Waters H-CLASS/XEVO TQD液相色譜/三重四級(jí)桿串聯(lián)質(zhì)譜儀；Sartorius BSA224S-CW電子天平；IKA VORTEX3漩渦混合器。

1.2 試藥 噴司他丁對(duì)照品（美國(guó)TargetMol）；乙酸銨：分析純（國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）；無(wú)水乙醇：分析純（國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）；甲醇：質(zhì)譜級(jí)（德國(guó)默克）；乙腈：質(zhì)譜級(jí)（德國(guó)默克）。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件 色譜柱：CHROM水相C18色譜柱（250 mm×4.6 mm, 5 μm）；流動(dòng)相：2.5 g/L乙酸銨溶液-甲醇-乙腈（96:2:2）；流速：1.0 mL/min；柱溫：25 ℃；檢測(cè)波長(zhǎng)：282 nm；進(jìn)樣量10 μL。在此條件下，噴司他丁與其他色譜峰分離良好。

2.2 試驗(yàn)溶液的制備

2.2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備 精密稱取噴司他丁對(duì)照品10 mg于50 mL容量瓶中，用水溶解并定容至刻度，搖勻，制成濃度為200 μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)貯備液。再用水稀釋標(biāo)準(zhǔn)貯備液，得到濃度分別為5.0、10.0、25.0、50.0、100.0 μg/mL的噴司他丁系列標(biāo)準(zhǔn)工作溶液。

2.2.2 試樣溶液的制備 稱取樣品0.5 g，加水25 mL，超聲處理10 min，加水補(bǔ)足減失的重量，取上清液，過(guò)0.45 μm濾膜，待測(cè)。

2.3 測(cè)定條件的選擇 取適量的噴司他丁標(biāo)準(zhǔn)品溶液，在200-400 nm范圍內(nèi)進(jìn)行紫外全波長(zhǎng)掃描。噴司他丁在213 nm和282 nm處有最大吸收?？紤]到在低波長(zhǎng)下通常會(huì)有較多的雜質(zhì)信號(hào)干擾，故最終選擇282 nm作為檢測(cè)波長(zhǎng)。

3 討論

3.1 柱溫的選擇 分別在柱溫30 ℃和35 ℃條件下進(jìn)行測(cè)定，因考慮實(shí)驗(yàn)效率問(wèn)題，未建立凈化方法，樣品溶液中存在部分水溶性雜質(zhì)，升高柱溫使得各組分保留時(shí)間提前，導(dǎo)致噴司他丁分離度降低，故而確定柱溫為25 ℃。

3.2 蛹蟲草炮制工藝的改進(jìn)方向 本次試驗(yàn)樣品由吉林省蠶業(yè)研究院提供，院內(nèi)采用高溫烘干的方式對(duì)蛹蟲草進(jìn)行干燥處理。因噴司他丁熱穩(wěn)定性差，受熱極易分解，在試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)新制成品中噴司他丁含量低，且分解后雜質(zhì)較多，真空包裝放置3個(gè)月后，噴司他丁含量基本降為0。蛹蟲草有抗癌功效，其相關(guān)功效成分即為噴司他丁，由此可見(jiàn)，干燥工藝對(duì)蛹蟲草功效起著至關(guān)重要的作用。本實(shí)驗(yàn)室后期采用凍干工藝，對(duì)小批量蛹蟲草進(jìn)行干燥處理，成品中噴司他丁含量與原工藝相比提高了3-5倍，極大改善了因噴司他丁受熱分解而導(dǎo)致蛹蟲草功效下降的情況。后續(xù)將從成本與經(jīng)濟(jì)效益方面，對(duì)蛹蟲草的干燥工藝進(jìn)行更深入的研究。