羧基酯脂肪酶在胰腺疾病發(fā)病中的作用機制研究進展

鄧順江 鄒文斌 廖專

海軍軍醫(yī)大學(xué)長海醫(yī)院消化內(nèi)科，上海市胰腺疾病研究所，上海 200433

【提要】 羧基酯脂肪酶(CEL)通常由胰腺分泌并轉(zhuǎn)移到十二指腸參與水解消化脂肪、膽固醇酯和脂溶性維生素，是人體內(nèi)重要的消化酶。近年來，研究發(fā)現(xiàn)該基因在胰腺疾病的發(fā)病中起重要作用，尤其是慢性胰腺炎和青少年發(fā)病的成人型糖尿病。該基因致病的相關(guān)變異主要包括兩類：可變數(shù)量串聯(lián)重復(fù)區(qū)(VNTR)數(shù)量的改變及內(nèi)部突變；與CEL高度同源的假基因(CELP)發(fā)生重組形成CEL-HYB雜合變異。CEL相關(guān)變異通過胞內(nèi)自噬和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激等機制參與胰腺疾病的發(fā)生。

羧基酯脂肪酶(carboxyl ester lipase，CEL)通常由胰腺分泌并轉(zhuǎn)移到十二指腸參與水解消化脂肪、膽固醇酯和脂溶性維生素，是人體內(nèi)重要的消化酶。人CEL主要在胰腺腺泡細胞和乳房泌乳腺體表達，其中胰腺腺泡細胞是CEL表達的主要部位，CEL在胰液中大約占總蛋白的4%[1]。近年來研究發(fā)現(xiàn)該基因在胰腺疾病的發(fā)病中起重要作用，尤其是慢性胰腺炎和青少年發(fā)病的成人型糖尿病。本文就CEL在胰腺疾病中的作用及其機制研究進展進行綜述。

一、CEL的結(jié)構(gòu)與功能

人CEL長9 850 bp，定位于染色體9q34.3[2]，并靠近ABO基因座，由11個外顯子和10個內(nèi)含子組成[3](圖1)。外顯子1最不保守，編碼CEL mRNA 5′非翻譯結(jié)構(gòu)域，外顯子2編碼部分肝素結(jié)合位點[4]，外顯子3和7編碼CEL蛋白上的2個二硫鍵[5]，其有助于穩(wěn)定酶的結(jié)構(gòu)。外顯子5、8、10分別編碼Ser194、Asp320和His435殘基[6]，它們構(gòu)成CEL催化位點，并參與底物催化[7]。CEL最后一個外顯子包含一個GC含量豐富的可變數(shù)量串聯(lián)重復(fù)區(qū)(variable number of tandem repeats，VNTR)。目前發(fā)現(xiàn)的重復(fù)區(qū)數(shù)量有3～23個不等[8]，13～17個出現(xiàn)頻率最高，16個重復(fù)區(qū)是所有類型中最主要的類型[9-11]，有研究將16個重復(fù)定義為N型，<16個重復(fù)區(qū)為S，>16個重復(fù)區(qū)為L[12]。每一個重復(fù)區(qū)由33個堿基的重復(fù)序列組成，可在CEL尾部編碼11個氨基酸序列。VNTR使得CEL呈現(xiàn)高度的多態(tài)性。

一個類似CEL的假基因(CEL-like pseudogene, CELP)位于CEL的下游約11 kb的位置，CELP在人體多個組織中均有轉(zhuǎn)錄，與CEL相比，其缺少第2～7個外顯子，且在第2個外顯子中包含一個終止密碼子，不能翻譯出有功能的蛋白質(zhì)[13](圖1)。學(xué)者提出CELP實際上是原始基因，因為小鼠CEL的啟動子區(qū)域與人類CELP基因的啟動子區(qū)域高度吻合[14]。

圖1CEL-CELP基因座的結(jié)構(gòu)圖。紅色和藍色分別表示CEL和CELP的外顯子區(qū)域

CEL包括球狀N-末端和C-末端兩個主要的結(jié)構(gòu)域，前者包括535個氨基酸殘基(不含信號肽)，后者本質(zhì)上是無序的11個重復(fù)氨基酸序列的延伸臂[15-16]。N-末端區(qū)域的氨基酸序列(包括催化三聯(lián)體Ser194-His435-Asp320)在迄今為止檢測到的所有脊椎動物物種中均高度保守[17]，該區(qū)域也與其他脂肪酶和酯酶具有相似性[6,18]。

CEL在十二指腸中被膽鹽激活后可水解食用脂肪、膽固醇酯和脂溶性維生素[19]。CEL還可催化脂肪酸和乙醇合成，后者的非氧化代謝物可能導(dǎo)致胰腺損傷和酒精性胰腺炎。有研究表明，脂肪酸乙酯通過對線粒體的直接毒性作用而引起胰腺腺泡細胞的病理改變[20]。此外有學(xué)者提出，CEL可以降解支鏈脂肪酸酯，該類分子具有增強胰島素敏感性和抗炎作用[21]。

二、 CEL與胰腺炎

1．CEL在急性胰腺炎(AP)中的作用：CEL和淀粉酶一樣，是由胰腺外分泌部分泌的消化酶，參與食物的消化，反映胰腺的功能，與胰腺的損傷密切相關(guān)。有研究證實在急性間質(zhì)性胰腺炎或壞死性胰腺炎患者血清中CEL水平明顯上升[22]。 因此，即使在血清淀粉酶水平正常的情況下，CEL的血清水平如果異常升高，也可提示AP[23]。然而CEL在AP發(fā)病機制中的研究較少。

2．CEL在慢性胰腺炎(CP)中的作用：CP的特征是長期的胰腺炎癥-纖維化改變，缺乏理想的治療方法。有研究顯示，胰腺炎的發(fā)生機制與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激(endoplasmic reticulum stress，ERS)相關(guān)，而吸煙和乙醇都會增加ERS[24]。實際上，在吸煙和乙醇的作用下內(nèi)質(zhì)網(wǎng)內(nèi)含有的CEL發(fā)生結(jié)構(gòu)功能的改變并形成二聚體，進而使更多的蛋白質(zhì)聚集成核，這已經(jīng)被證明是CEL的結(jié)構(gòu)改變而參與CP的致病機制[25-26]。

歐洲報道了一種缺失型雜合基因(CEL-HYB)[27]。它由CEL與CELP發(fā)生非等位基因同源重組而成，CEL-HYB近端部分(由外顯子1～10構(gòu)成)來源于CEL，而包含VNTR的遠端部分來源于CELP，命名為CEL-HYB1。CEL-HYB1在歐洲CP患者中的攜帶率顯著高于正常對照組，通過體外細胞模型發(fā)現(xiàn)CEL-HYB1脂肪酶的活性只有野生型CEL活性的40%，且在腺泡細胞內(nèi)聚集誘發(fā)自噬，從而損害胰腺細胞。中國牽頭的一項國際多中心研究發(fā)現(xiàn)[28]，在亞洲人群中很少存在CEL-HYB1，而是出現(xiàn)融合部位更靠前的CEL-HYB2，該變異目前認為與CP的發(fā)生無直接關(guān)聯(lián)，功能實驗發(fā)現(xiàn)其轉(zhuǎn)錄水平下調(diào)。

日本一項研究報道酒精性CP(alcoholic chronic pancreatitis, ACP)與VNTR的長度的相關(guān)性[11]，共納入100例ACP、52例酗酒者(經(jīng)ERCP檢查未發(fā)現(xiàn)胰腺炎)、50例非酒精性CP、96例高脂血癥以及435例健康者。結(jié)果顯示，相比于其他組，ACP中NN型顯著減少，L等位基因頻率增加，提示攜帶L等位基因可能是ACP的易感因素；另外，與非酒精性CP和高脂血癥者相比，ACP中S等位基因頻率也顯著增加，但與酗酒和正常對照組的差異無統(tǒng)計學(xué)意義，因此，S等位基因的存在不會增加酗酒者患胰腺炎的風(fēng)險。由于該研究中高脂血癥組的平均年齡偏大，而且非酒精性CP病因復(fù)雜，所以S等位基因的意義還有待進一步研究。

另一項德國的研究發(fā)現(xiàn)，相比于健康者，ACP和特發(fā)性CP個體中L和S等位基因的頻率有所升高，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.4)[29]。人種和試驗分組的差異或可解釋歐洲和日本研究結(jié)果的不同。為了闡明VNTR與CP的關(guān)系，尚需大樣本量進行確證。

三、CEL與胰腺癌

與其他腺泡細胞標記類似，當(dāng)胰腺腫瘤細胞出現(xiàn)導(dǎo)管表型時CEL的表達喪失[30]。有研究發(fā)現(xiàn)德國和挪威人群患者的CEL VNTR與胰腺癌無相關(guān)性[31]，而存在于CEL VNTR的第2重復(fù)區(qū)中的常見單核苷酸多態(tài)性(single nucleotide polymorphism, SNP, rs488087)被認為是增加發(fā)生胰腺癌風(fēng)險的標志[32]。需要注意的是，該研究僅包括30例確診為胰腺導(dǎo)管腺癌的患者，提示上述SNP有待在大樣本患者隊列中進一步研究。

2017年Martinez等[33]在胰腺SOJ-6細胞中檢測到CEL VNTR區(qū)域發(fā)生的C堿基插入突變，該突變使得終止密碼子提前出現(xiàn)，從而導(dǎo)致翻譯的蛋白質(zhì)序列變短；在胰液或胰腺組織中，可通過特異性抗體檢測突變后CEL的C-末端特有氨基酸序列，該突變序列或許可作為胰腺癌的診斷標志物。

四、CEL與胰腺內(nèi)外分泌功能不全

胰腺的主要功能包括內(nèi)分泌和外分泌功能，胰腺內(nèi)分泌細胞主要存在于胰島，可以合成胰島素、胰高血糖素、生長抑素和胰多肽，內(nèi)分泌功能障礙與糖尿病相關(guān)；胰腺外分泌細胞主要分泌消化酶和碳酸氫鹽，其功能障礙可引起消化吸收障礙。胰島和胰腺外分泌組織共同構(gòu)成胰腺實質(zhì)，結(jié)構(gòu)上彼此相鄰，功能上也存在相互依賴的關(guān)系。有研究發(fā)現(xiàn)，在1型糖尿病和2型糖尿病中15%～30%的個體會出現(xiàn)嚴重的胰腺外分泌功能不全[34]。

青少年發(fā)病的成人型糖尿病( maturity-onset diabetes of the young，MODY)是一種常染色體顯性遺傳性糖尿病，通常在25歲以前出現(xiàn)。MODY8患者除了糖尿病的表現(xiàn)，還具有緩慢進展的胰腺外分泌功能損害。Raeder等[11]在羅威家系中發(fā)現(xiàn)在CEL VNTR區(qū)發(fā)生的單堿基缺失突變可以導(dǎo)致MODY8和胰腺外分泌功能不全。在第1個家系中發(fā)現(xiàn)的突變發(fā)生在VNTR中的第1個重復(fù)區(qū)(c.1686delT，p.C563fsX673，命名為 DEL1)，該突變引起移碼改變，導(dǎo)致第672個氨基酸殘基后提前出現(xiàn)終止密碼子，且與該家系糖尿病和糞彈力蛋白酶不足(<200 mg/g)共分離(lod值分別為4.47和11.6)，攜帶這個突變的家庭成員基本都會發(fā)展為糖尿病，早期需要檢測糞彈力蛋白以明確其胰腺外分泌功能的狀態(tài)，因為這種類型的突變攜帶者最先出現(xiàn)的是胰腺外分泌功能受損。第2個家系突變發(fā)生在VNTR的第4個重復(fù)區(qū)(c.1785delC, p.C596fsX695)，改變了自第596個氨基酸殘基起始的閱讀框，導(dǎo)致第694位氨基酸殘基后提前出現(xiàn)終止密碼子，該突變存在于該家庭有糖尿病或糞彈力蛋白酶不足的個體中。在以上2個家系中，攜帶上述兩個突變的個體胰腺內(nèi)分泌和外分泌功能表現(xiàn)類似，所有突變攜帶者都出現(xiàn)了糞彈力蛋白酶不足， 在未患病的家族成員及無血緣關(guān)系的糖尿病志愿者中不存在這兩種突變。

有研究顯示，過表達DEL1的細胞促進形成蛋白聚集體，進而刺激產(chǎn)生未折疊蛋白應(yīng)答，這種現(xiàn)象在未突變的細胞內(nèi)不會出現(xiàn)[35]。在MODY8患者中，異常蛋白的聚集、再攝取和降解過程可能會導(dǎo)致胰腺外分泌功能障礙[26]。有研究證實，DEL1 突變體比正常CEL分泌減少，且大部分蛋白保留在細胞內(nèi)，在大鼠AR42J腺泡細胞和人HEK293細胞中，突變蛋白質(zhì)在細胞內(nèi)聚集引起內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激并刺激產(chǎn)生未折疊蛋白質(zhì)應(yīng)答，這種異常蛋白還會引起細胞凋亡和NF-κB的激活， 因此，作者提出DEL1通過細胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的蛋白毒性增強，引起功能不適應(yīng)而導(dǎo)致MODY8[36]。

有學(xué)者運用一種多重PCR和序列分析結(jié)合的方法可以高效地檢測CEL VNTR區(qū)的單堿基插入或缺失突變，以及VNTR的數(shù)量，他們分析了95例丹麥MODY基因陰性(MODYX)患者的CEL VNTR區(qū)，在前8個重復(fù)區(qū)中沒發(fā)現(xiàn)任何單堿基突變，然而一個先證者只含3個VNTR，并發(fā)現(xiàn)該家系中有7個成員攜帶該基因型，其中4人患糖尿病[7]。提示攜帶3個VNTR的基因型可能是MODYX的危險因素，但由于樣本量太少，還有待后續(xù)研究證實并探索其機制。此外，他們還在MODYX和健康人群中檢測到了含有3個完整VNTR拷貝的情況(2.5%和5%)，作者認為這可能是同源不規(guī)則重組引起的。有研究在該類基因攜帶者中發(fā)現(xiàn)了至少兩種不同的重復(fù)突變體(CEL-DUP)，其在北歐人群中具有高于1%的攜帶率，CEL-DUP是否與胰腺疾病有關(guān)還有待研究[27]。

五、小 結(jié)

富含GC的VNTR和高度同源的CELP使得全基因組關(guān)聯(lián)研究和深度測序分析很難全面覆蓋CEL的所有遺傳突變，因此該基因仍然是進一步深入探索與胰腺疾病相關(guān)的優(yōu)勢候選基因。CEL變異可能是CP、胰腺癌以及胰腺內(nèi)外分泌功能不全的重要危險因素。由于CEL的下游相隔11 kb的位置有一個假基因CELP，CEL的這種特殊結(jié)構(gòu)決定了其多態(tài)性，主要表現(xiàn)為散在分布的SNP、不同數(shù)量的VNTR重復(fù)、VNTR內(nèi)的單堿基插入或缺失、涉及整個CEL-CELP基因座的拷貝數(shù)變化這4類遺傳變異。突變蛋白在胰腺細胞內(nèi)聚集引起胞內(nèi)自噬和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激，以及未折疊蛋白質(zhì)應(yīng)答可能是CEL突變參與胰腺疾病發(fā)病的機制，需要新的動物模型以及細胞功能研究來進一步探索。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突