響應面法優(yōu)化樺褐孔菌總三萜回流提取工藝

檀 琪,阮文輝,楊官娥,劉海萍,王進東,*

(1山西醫(yī)科大學藥學院中藥學教研室,太原 030001;2山西省醫(yī)藥與生命科學研究院;*通訊作者,E-mail:844381238@qq.com)

樺褐孔菌(Inonotusobliquus)為擔子菌門多孔菌科纖孔菌屬的真菌[1-3]。生長在溫度相對較低的俄羅斯西伯利亞地區(qū)的原始森林中,常在樹皮破損及傷節(jié)處形成肉瘤狀菌核,菌塊性狀為近球形或不定形塊狀[4,5]。樺褐孔菌是多組分的藥用真菌,主要化學成分有20多種,包括多糖、樺褐孔菌素、樺褐孔菌醇、多種氧化三萜類、類固醇類及低分子多酚類等有效成分[6,7]。三萜類化合物為其中的有效部位,具有抗腫瘤、抗氧化、抗炎,降糖等作用[8-12]。文獻報道,可采用超聲、回流、微波等方法提取樺褐孔菌總三萜類化合物[13-18]。本課題組預備提取純化出總三萜,研究其藥理作用,進一步制作成藥物。本文在單因素試驗基礎上采用響應面設計法,對樺褐孔菌總三萜回流提取工藝進行優(yōu)化。

1 材料和方法

1.1 材料和試劑

1.1.1 實驗原料 樺褐孔菌子實體粉末(購自安徽亳州);白樺脂醇對照品(HPLC純度>97.6%;ChromaDex,批號:20151008)。

1.1.2 主要化學試劑 香草醛(分析純,天津市光復精細化工研究所);冰醋酸、高氯酸、異丙醇、乙酸乙酯、甲醇、乙醇(均為分析純,天津市風船化學試劑科技有限公司)。

1.2 實驗儀器

BIOMATE 3S紫外可見分光光度計(Thermo Fisher);BSN-220.3電子天平(北京塞多利斯有限公司);HH-6電熱恒溫水浴鍋(北京市長風儀器儀表公司);GZX-9140電熱鼓風干燥箱(上海博迅實業(yè)有限公司醫(yī)療設備廠);LYNX-6000離心機(Thermo Fisher);振動式藥物超微粉碎機(濟南倍力粉技術工程有限公司)。

1.3 方法

1.3.1 樺褐孔菌總三萜提取工藝 樺褐孔菌粉末干燥至恒重,超微粉碎8 min,精密稱取1.00 g樺褐孔菌粉末,加入提取溶劑,回流提取后離心(3 500 r/min下離心10 min),收集上清液,取上清液測吸光度,計算總三萜含量。

1.3.2 樺褐孔菌總三萜測定 標準曲線的建立:準確稱取干燥恒重的白樺脂醇對照品4.0 mg于25 ml的容量瓶中,加入無水乙醇溶解,稀釋至刻度搖勻,即為濃度0.16 mg/ml的標準品溶液。精確吸取白樺脂醇對照品溶液0.1,0.15,0.25,0.30,0.35,0.40,0.50,0.55 ml,分別置于10 ml具塞試管,在100 ℃水浴上蒸干后加入0.20 ml新配制的5 g/100 ml香草醛-冰乙酸溶液和0.80 ml高氯酸,搖勻,于70 ℃水浴保溫反應15 min,冷卻至室溫,再加入乙酸乙酯定量至5 ml,搖勻,同時作試劑空白,在550 nm處測定吸光度,以白樺脂醇質量(μg)為橫坐標,吸光度為縱坐標,繪制標準曲線Y=aX+b。

總三萜含量測定方法:按1.3.1項下方法提取樺褐孔菌總三萜,按標準曲線的建立操作進行測定,將測得的吸光度值代入標準曲線,按下列公式計算樺褐孔菌總三萜含量:

M0=(A+b)/a

M1=M0×稀釋倍數/1 000M

其中:M0為測定吸光度時溶液中總三萜的質量(μg);M1為實驗中所取樺褐孔菌中總三萜的含量(mg/g);M為實驗中所取樺褐孔菌的量(g);A為所測樣品吸光度;b為三萜標準曲線方程截距;a為三萜標準曲線方程斜率。

1.3.3 樺褐孔菌總三萜回流提取單因素試驗 選擇提取溶劑、回流時間、回流溫度、料液比、提取次數共5個因素做單因素實驗,以樺褐孔菌總三萜含量為評價提取工藝的指標。

1.3.3.1 提取溶劑對總三萜含量的影響 準確稱取4份(每份1.00 g)樺褐孔菌粉末,固定料液比1 ∶20、回流溫度80 ℃、回流時間2 h、提取次數1次,改變提取溶劑,分別為異丙醇、乙醇、甲醇、乙酸乙酯,按1.3.1項下方法提取,測定總三萜含量,考察提取溶劑對總三萜含量的影響。

1.3.3.2 回流時間對總三萜含量的影響 準確稱取6份(每份1.00 g)樺褐孔菌粉末,固定提取溶劑異丙醇、料液比1 ∶20、回流溫度80 ℃、提取1次。改變回流時間,分別為1,1.5,2,2.5,3,3.5 h。按1.3.1項下方法提取,測定總三萜含量,考察回流時間對總三萜含量的影響。

1.3.3.3 回流溫度對總三萜含量的影響 準確稱取6份(每份1.00 g)樺褐孔菌粉末,固定提取溶劑異丙醇、料液比1 ∶20、回流時間2 h、提取1次。改變回流溫度,分別為60,70,75,80,85,90 ℃。按1.3.1項下方法提取,測定總三萜含量,考察回流溫度對總三萜含量的影響。

1.3.3.4 料液比對樺褐孔菌總三萜含量的影響 準確稱取6份(每份1.00 g)樺褐孔菌粉末,固定提取溶劑為異丙醇、回流溫度80 ℃、回流時間2 h、提取1次。改變料液比,分別為1 ∶5,1 ∶10,1 ∶15,1 ∶20,1 ∶25,1 ∶30。按1.3.1項下方法提取,測定總三萜含量,考察料液比對總三萜含量的影響。

1.3.3.5 提取次數對總三萜含量的影響 準確稱取5份(每份1.00 g)樺褐孔菌粉末,固定提取溶劑為異丙醇、回流溫度80 ℃、回流時間2 h、料液比為1 ∶20。改變提取次數分別為1次至5次。按1.3.1項下方法提取,測定總三萜含量,考察提取次數對總三萜含量的影響。

1.3.4 響應面法優(yōu)化提取樺褐孔菌總三萜的實驗 在單因素實驗的基礎上,利用Design expert 8.0.6分析軟件,選擇料液比、回流時間、回流溫度3個因素為自變量,每個因素取3水平,以-1,0,+1編碼,以樺褐孔菌總三萜含量為響應值,進行實驗設計,因素水平設計見表1。

表1 響應面法分析因子及水平表

Table 1 Analysis factors and levels of response surface method

水平因素溫度A(℃)時間B(h)料液比C(g/ml)-1752150802.520185325

2 實驗結果和分析

2.1 樺褐孔菌總三萜測定

根據總三萜含量和吸光度的關系,以白樺脂醇質量(μg)為橫坐標,吸光度為縱坐標,繪制標準曲線為Y=0.008 5X-0.021 9,R2=0.999 4。

2.2 單因素實驗結果和分析

由圖1提取溶劑的考察結果可知,提取溶劑為異丙醇時,總三萜含量最大。實驗中觀察異丙醇提取液為淡黃色(接近于無色),其他均為黃色,含有較多的雜質,根據相似相溶原理,總三萜的含量與提取溶劑極性有關,由實驗結果可知,異丙醇的極性與樺褐孔菌三萜類化合物最接近,因此,提取溶劑選擇異丙醇為宜。

由圖1回流時間的考察結果可知,在1-2.5 h內,樺褐孔菌總三萜含量隨著時間的增加而增加,當時間2.5 h時,總三萜含量最高;當時間再升高時,含量有所下降。因此,回流時間選擇2.5 h為宜。

由圖1回流溫度的考察結果可知,在提取溫度60-80 ℃內,隨著溫度升高,提取液中總三萜含量增加,但溫度>80 ℃后,總三萜含量降低,表明溫度>80 ℃以后不利于總三萜類化合物的提取。因此,回流溫度選擇80 ℃為宜。

由圖1料液比的考察結果可知,在料液比1 ∶5-1 ∶20內,隨著料液比升高,提取液中總三萜含量增加,但料液比>1 ∶20后,三萜含量增加緩慢,趨于穩(wěn)定。原因可能是溶劑量的增加會導致傳質效率趨于最大,當提取溶劑用量增加到一定程度,該溶劑已將三萜基本溶出。因此,提取料液比選擇1 ∶20為宜。

由圖1提取次數的考察結果可知,隨回流次數增加,總三萜含量略有上升,但基本趨于穩(wěn)定。一般情況下,總三萜提取量隨提取次數增加而上升,但是當提取超過一定次數時,總三萜浸出將達到平衡階段,總三萜含量基本穩(wěn)定不變?？紤]在實際的生產中,對資源的綜合利用,因此,提取次數選擇1次為宜。

圖1 提取影響因素考察結果Figure 1 Effects of influencing factors of extraction on total triterpenoids in Inonotus obliquus

由圖1可知,回流時間、回流溫度和料液比對總三萜含量影響較為顯著,故以總三萜為指標,以回流溫度(因素A)、回流時間(因素B)、液料比(因素C)為考察因素,進行響應面優(yōu)化實驗。

2.3 響應面法優(yōu)化提取樺褐孔菌總三萜

由表2可知,采用Design-Expert8.0.6軟件進行多項式回歸擬合,建立多元二次響應面回歸模型:Y=13.02-0.16A-0.049B+0.46C+0.062AB+0.17AC-0.020BC-0.59A2-0.44B2-0.65C2。因素的ANOVA分析見表3?？梢?F模擬=67.01,且P<0.000 1,表明該模型差異有統(tǒng)計學意義,方程與實際的擬合情況相符;失擬項P=0.170 4,提示失擬檢測無顯著性,表明未知因素對試驗的干擾較小;模型擬合相關系數R2=0.988 5,表明模型可信度較好,該模型可應用于分析和預測提取工藝參數。擬合回歸方程各項方差分析結果表明,對于響應值Y,因素一次項A、C,交互項AC,二次項A2、B2、C2都對總三萜提取率的影響顯著,其余均無顯著性,提示各影響

表2 試驗設計與結果

Table 2 Test design and results

試驗號 A B C總三萜含量(mg/g)1-1-1012.0021-1012.103-11011.74411012.095-10-111.35610-111.407-10111.80810112.5490-1-111.401001-111.38110-1112.501201112.401300012.901400012.991500013.111600013.051700013.04

因素與提取率之間并非簡單的線性關系。由表3可見,單因素A,B,C的F值大小分別為17.46,1.73,156.3,提示單因素對提取率的影響順序為C(液料比)>A(回流溫度)>B(回流時間)。響應面分析的等高線圖和響應面圖見圖2-4,各圖為因素A-C中任意1個變量取零水平時,其余2個變量對總三萜含量的影響,可更直觀地體現2個因素對提取的影響。

由圖2-4可知,樺褐孔菌總三萜的最優(yōu)提取工藝為提取溫度80.92 ℃,提取時間為2.48 h,料液比1 ∶21.9。考慮到實際操作,最終將其確定為料液比1 ∶22,提取溫度80 ℃,提取時間為2.5 h,提取1次。

表3 方差分析

Table 3 Analysis of variance

來源 離均差平方和 自由度均方 F P模型6.6490.7467.01<0.0001A0.1910.1917.460.0041B0.01910.0191.730.2302C1.7211.72156.3 <0.0001AB0.01610.0161.420.2723AC0.1210.1210.810.0133BC1.600×10-311.600×10-30.150.7143A21.4711.47133.83<0.0001B20.8310.8375.40<0.0001C21.8011.80163.60<0.0001殘差0.07770.011- <0.0001失擬項0.05230.0172.830.1704純誤差0.02546.170×10-3- - 總誤差6.7216 -- -

2.4 驗證試驗

精密稱取樣品3份,每份1.00 g,按最優(yōu)提取工藝平行實驗3次。結果,總三萜含量分別為13.10,13.12,13.24 mg/g,平均含量為13.15 mg/g,理論預測值為13.12 mg/g,與理論預測值相比,其相對誤差約為0.2%。表明預測值與實驗值具有良好的一致性,進一步說明該回歸模型的準確性和可靠性,具有一定應用價值。

圖2 溫度和回流時間對總三萜含量的影響Figure 2 Effects of temperature and reflux time on content of total triterpenoids

圖3 溫度和料液比對總三萜含量的影響Figure 3 Effect of temperature and ratio of solid to liquid on content of total triterpenoids

圖4 回流時間和料液比對總三萜含量的影響Figure 4 Effect of reflux time and ratio of solid to liquid on content of total triterpenoids

3 討論

本試驗采用單因素試驗確定因素水平,然后進一步應用響應面法考察各影響因素對總三萜含量的影響,再采用二次回歸設計得到回歸模型,確定最優(yōu)工藝,最佳提取工藝條件下樺褐孔菌提取物中三萜類含量為13.15 mg/g。本試驗僅對三萜這一組分進行提取,為分離純化三萜提供了基礎,與其他方法相比,本方法具有快速,操作成本低,并且對環(huán)境無危害等優(yōu)點,且該工藝穩(wěn)定,重現性好,可為降低能耗、減少成本和工業(yè)化生產提供參考依據。