GSPE對自發(fā)性蛛網(wǎng)膜下隙出血大鼠的腦保護作用

鄧青山,王 東,邱 俊,陶裕川,周世軍,易 勇

(四川省宜賓市第二人民醫(yī)院神經(jīng)外科,宜賓 644000;*通訊作者,E-mail:taoqi748989489@163.com)

蛛網(wǎng)膜下隙出血(subarachnoid hemorrhage,SAH)是導(dǎo)致患者殘疾和死亡的一種重要臨床綜合征,動脈瘤破裂為SAH的最主要原因。40%-80%的SAH患者發(fā)生遲發(fā)性腦血管痙攣及不同程度的腦缺血,從而導(dǎo)致患者神經(jīng)功能損害,甚至死亡。盡管治療措施不斷改進和完善,目前仍缺乏有效手段來控制SAH后繼發(fā)的病理機制。越來越多的研究表明SAH后急性腦損傷是導(dǎo)致SAH患者預(yù)后差的關(guān)鍵因素。而SAH后急性腦損傷的機制主要包括血腦屏障破壞、炎癥反應(yīng)、氧化應(yīng)激、細(xì)胞凋亡等。諸多研究表明氧化應(yīng)激和炎癥反應(yīng)在急性腦損傷的過程中發(fā)揮著至關(guān)重要的作用[1-3]。因此,發(fā)病早期通過各種治療手段以減輕急性腦損傷,保護腦組織,或許能有效改善SAH導(dǎo)致的神經(jīng)功能損害,防止后續(xù)嚴(yán)重并發(fā)癥的發(fā)生。葡萄籽多酚提取物(grape seed polyphenol extract,GSPE)具有極強的抗氧化作用及自由基清除作用,體內(nèi)及體外實驗均證明GSPE可以有效改善氧化應(yīng)激反應(yīng)[4,5]。而且,GSPE比目前已知的主要抗氧化劑如Vit-C、Vit-E等,有更強的抗氧化活性[6]。研究表明GSPE具有顯著的神經(jīng)保護作用,能有效改善阿爾茨海默病[7]、缺血再灌注性腦損傷[8]、神經(jīng)毒性損傷[9,10]等疾病的神經(jīng)損傷,改善疾病進展。盡管GSPE在中樞神經(jīng)系統(tǒng)多種疾病中有明確的作用,但GSPE對SAH后腦功能是否有相應(yīng)保護作用,目前無相關(guān)研究。本研究通過GSPE對SAH模型大鼠的腦缺血面積、氧化應(yīng)激、炎癥指標(biāo)的研究,以明確GSPE對SAH后神經(jīng)功能的相關(guān)作用,以期為臨床研究提供理論支持。

1 材料與方法

1.1 實驗動物與分組

雄性SD大鼠,體質(zhì)量約340-360 g,購自西南醫(yī)科大學(xué)動物實驗中心,實驗動物生產(chǎn)許可證號:SCXK(川)2013-17。大鼠按隨機表法分為以下三組:假手術(shù)組、對照劑組、GSPE組[經(jīng)管胃飼GSPE 200 mg/(kg·d)],每組20只。10%的DMSO被用作GSPE的對照劑;藥物管喂一日一次。

1.2 主要試劑

葡萄籽多酚提取物(GSPE),純度>99%,購自北京艾泰思生物科技有限公司。DMSO購自美國Sigma公司。MDA檢測試劑盒及SOD活性檢測試劑盒購自江蘇碧云天生物技術(shù)公司。Trizol試劑購自美國Sigma公司。FastQuant RT Kit試劑盒購自北京天根生物科技有限公司。Taq DNA聚合酶購自大連Takara公司。

1.3 蛛網(wǎng)膜下隙出血大鼠模型制備

對照劑組和GSPE組采用線刺法制備蛛網(wǎng)膜下隙出血(SAH)大鼠模型。用3.6%水合氯醛腹腔注射麻醉大鼠。常規(guī)消毒鋪巾,頸正中切開皮膚,依次分離左側(cè)頸總動脈(CCA)、頸外動脈(ECA)、頸內(nèi)動脈(ICA)。將ECA結(jié)扎并剪斷,拉直,使其與ICA成一直線。將直徑為0.126 mm的尼龍線經(jīng)ECA置入ICA內(nèi),并送至大腦前動脈(ACA)和大腦中動脈(MCA)的分叉點,當(dāng)感覺有阻力時繼續(xù)置入2 mm,造成SAH,然后迅速將尼龍線拔出。整個置線過程不超過30 s。拔出尼龍線后常規(guī)縫合手術(shù)切口。術(shù)畢將大鼠放回籠中復(fù)蘇。手術(shù)成功后3 d,頸椎脫臼處死大鼠,斷頭取腦,蛛網(wǎng)膜下隙見血液或血凝塊為模型成功。假手術(shù)組的操作步驟同模型組,但置線后不刺破血管。

1.4 腦缺血面積的評估

為了定量分析蛛網(wǎng)膜下隙出血后腦血管痙攣引起的繼發(fā)性腦缺血,取手術(shù)后3 d大鼠用生理鹽水心臟灌注,取腦組織進行冠狀切片,切片用TTC染色,4%多聚甲醛固定24 h后,拍照。圖片用Image J軟件處理,計算腦缺血灶所占同側(cè)大腦面積的百分比。

1.5 MDA和SOD的測定

斷頭處死大鼠后立即收集了大鼠大腦皮層標(biāo)本。組織標(biāo)本在冰RIPA裂解液中進行超聲勻漿,4 ℃,12 000g離心10 min,收集上清液。上清液蛋白濃度用BCA法測定。取上清根據(jù)MDA試劑盒廠商提供的方法測量MDA水平,MDA濃度用nmol/mg蛋白質(zhì)表示。SOD活性根據(jù)Total Superoxide Dismutase Assay試劑盒說明書測定,SOD活性用U/mg蛋白質(zhì)表示。

1.6 RNA提取及qRT-PCR檢測

采用Trizol試劑提取大腦皮層組織總RNA,通過FastQuant RT Kit試劑盒及其方法將RNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA。PCR反應(yīng)由Taq DNA聚合酶及底物在qPCR儀中完成。反應(yīng)體系總體積為20 μl,其中Rtaq Premix 10 μl,ddH2O 8 μl,25 nmol/L Forward Primer 0.5 μl,25 nmol/L Reverse Primer 0.5 μl;樣本DNA 1 μl;擴增條件:所有受測基因均采用相同的擴增條件參數(shù),95 ℃預(yù)變性1 min(1個循環(huán));94 ℃變性30 s,60 ℃復(fù)性30 s,72 ℃延伸1 min(35個循環(huán));72 ℃延伸2 min(1個循環(huán));4 ℃保持。使用的基因引物見表1。

1.7 統(tǒng)計學(xué)分析

表1 基因引物序列

Table 1 Primer sequences of genes

基因正義鏈 反義鏈 TNF-α5′-CGTCAGCCGATTTGCTATCT-3′5′-CGGACTCCGCAAAGTCTAAG-3′ICAM-15′-TTCACACTGAATGCCAGCTC-3′5′-GTCTGCTGAGACCCCTCTTG-3′IL-1β5′-GCCCATCCTCTGTGACTCAT-3′5′-AGGCCACAGGTATTTTGTCG-3′IL-65′-AGTTGCCTTCTTGGGACTGA-3′5′-TCCACGATTTCCCAGAGAAC-3′IL-105′-GCCTTGTCAGAAATGATCAAGTTTT-3′5′-TTTCTGGGCCATGGTTCTCT-3′β-actin5′-AGCCCCCTCTGAACCCTAAG-3′5′-CAACACAGCCTGGATGGCTAC-3′

2 結(jié)果

2.1 GSPE改善SAH大鼠腦缺血狀況

通過評估腦缺血面積可以間接反映腦血管痙攣的嚴(yán)重程度。SAH模型鼠經(jīng)GSPE或?qū)φ談┨幚? d后,取鼠腦標(biāo)本測量腦缺血面積,結(jié)果顯示,對照劑組大鼠腦缺血面積平均達31.6%,而GSPE處理后大鼠腦缺血面積顯著減少(14.58%),組間差異有顯著統(tǒng)計學(xué)意義(t=9.876,P<0.001,見圖1)。

與對照劑組比較，***P<0.001圖1 GSPE處理SAH模型鼠能改善腦血管痙攣致腦缺血面積Figure 1 GSPE treatment reduces the area of cerebral ischemia in SAH rats

2.2 GSPE改善SAH大鼠過氧化反應(yīng)

本實驗對MDA進行檢測顯示,假手術(shù)組MDA水平為(2.50±0.04)nmol/mg,對照劑組為(6.46±0.11)nmol/mg,而GSPE組為(3.48±0.12)nmol/mg。三組間MDA水平具有顯著差異(F=403.44,P=0.000)。說明SAH會顯著提高腦組織中MDA水平,而GSPE處理可以顯著降低SAH模型鼠腦組織中MDA的水平,但GSPE處理仍無法將MDA降至正常水平(GSPE組與對照劑組比較,P<0.001,見圖2)。

本實驗對SOD進行檢測顯示,假手術(shù)組SOD平均水平為(0.40±0.01)U/mg,對照劑組SOD平均水平為(0.19±0.02)U/mg,而GSPE組SOD平均水平為(0.32±0.02)U/mg。各組大鼠整體分組效應(yīng)具有顯著差異(F=92.86,P=0.000),說明分組處理對各組大鼠的SOD水平有顯著影響。SAH會顯著降低腦組織中SOD的水平,而GSPE處理可以顯著提高SAH模型鼠腦組織中SOD的水平(GSPE組與對照劑組比較,P<0.001,見圖2),但仍然達不到假手術(shù)組腦組織中SOD的水平。

與對照劑組比較，***P<0.001圖2 各組鼠腦中MDA與SOD檢測結(jié)果Figure 2 The levels of MDA and SOD in brain tissues of different groups

2.3 GSPE處理改善SAH大鼠炎癥反應(yīng)

取鼠腦皮層標(biāo)本提取RNA進行qPCR檢測以研究相關(guān)炎癥因子表達情況。各因子三組間檢測結(jié)果比較差異均有統(tǒng)計學(xué)意義:TNF-α(F=89.44,P=0.000)、IL-1β(F=111.12,P=0.000)、IL-6(F=140.47,P=0.000)、ICAM-1(F=79.76,P=0.000)、IL-10(F=120.07,P=0.000)。與假手術(shù)組比較，對照劑組大腦皮層中TNF-α、ICAM-1、IL-1β、IL-6的RNA表達水平顯著升高(均P<0.001);而經(jīng)GSPE處理,可以使上述指標(biāo)的RNA水平明顯下降(均P<0.001),但仍然高于假手術(shù)組大腦皮層中這些炎癥因子的表達水平(均P<0.01,見圖3)。IL-10作為重要的抗炎細(xì)胞因子,對照劑組大腦皮層中IL-10水平輕微升高,而經(jīng)GSPE處理后IL-10的水平有更顯著的升高。

與對照劑組比較，***P<0.001圖3 各組鼠腦皮層中TNF-α、ICAM-1、IL-1β、IL-6、IL-10 RNA表達水平檢測結(jié)果Figure 3 The RNA expression levels of TNF-α，ICAM-1，IL-1β，IL-6，IL-10 in cortex of rats in different groups

3 討論

蛛網(wǎng)膜下隙出血(subarachnoid hemorrhage,SAH)是嚴(yán)重威脅人類健康的神經(jīng)血管性疾病,其發(fā)病率、致殘率、致死率均非常高[11]。其發(fā)生與年齡、性別、種族等沒有顯著關(guān)系,且占所有卒中的7%左右[12]。SAH后因顱內(nèi)壓升高、腦血管痙攣等因素導(dǎo)致腦內(nèi)灌注壓及腦血流量降低,從而造成神經(jīng)細(xì)胞的不可逆損傷。目前已經(jīng)明確早期炎癥反應(yīng)在SAH后的急性腦損傷、腦血管痙攣過程中發(fā)揮著重要作用。且臨床研究表明SAH后的血管痙攣及炎癥反應(yīng)主要與IL-1β、IL-6、IL-10、ICAM-1、TNF-α等炎癥因子的水平密切相關(guān)[13,14]。其中IL-10是重要的抗炎細(xì)胞因子,在SAH后的炎癥過程中發(fā)揮著改善炎癥反應(yīng)的保護性作用,而其余幾個因子是重要的促炎細(xì)胞因子,在SAH后起著增強炎癥反應(yīng)、加重腦損傷的作用。尤其以IL-6在SAH后早期即高水平表達,是預(yù)測腦血管痙攣進展的早期標(biāo)志[2]。這些事實表明抗炎治療在SAH的治療中至關(guān)重要。本實驗經(jīng)提取各實驗組大鼠腦皮層的RNA對以上炎癥基因進行檢測,證實對照劑組中促炎因子的RNA水平均顯著升高,抗炎因子的RNA水平均輕微升高;但經(jīng)GSPE處理后促炎基因的轉(zhuǎn)錄水平顯著減低,而抗炎因子IL-10的表達水平則進一步提高,說明GSPE具有明顯的抗炎活性。這與GSPE在其他系統(tǒng)疾病,如哮喘[15]、關(guān)節(jié)炎[16]中的抗炎特性一致。另外,炎癥反應(yīng)在SAH后的血管痙攣中發(fā)揮著重要作用,抑制炎癥因子的表達可以有效改善腦血管痙攣的程度[13]。本研究表明GSPE處理改善了SAH后炎癥反應(yīng),同時顯著減輕了SAH后腦缺血的面積。說明GSPE具有明確的抗炎活性,可調(diào)節(jié)炎癥因子的轉(zhuǎn)錄水平,改善SAH后炎癥損傷及腦缺血的發(fā)生。

SAH后由于腦組織供血不足,可生成大量自由基,從而誘發(fā)氧化應(yīng)激反應(yīng)的發(fā)生。氧化應(yīng)激在諸多中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病中起著免疫反應(yīng)的應(yīng)答器作用。氧化應(yīng)激和抗氧化之間的平衡協(xié)調(diào)促進SAH后神經(jīng)損傷的恢復(fù)。本研究結(jié)果表明SAH后皮層中脂質(zhì)過氧化反應(yīng)明顯增強,導(dǎo)致SAH后氧化應(yīng)激性損傷。GSPE處理明顯逆轉(zhuǎn)了這一病理性改變,顯著降低了SAH后腦皮層中MDA水平,而明顯上調(diào)了SOD水平,說明GSPE對脂質(zhì)過氧化反應(yīng)及氧化應(yīng)激損傷有明顯抑制作用,GSPE可有效保護SAH后氧化應(yīng)激損傷。而氧化應(yīng)激損傷作為SAH后急性腦損傷的重要機制之一,有效抑制氧化應(yīng)激則可以在一定程度上避免急性腦損傷的發(fā)作,對腦組織起保護作用。

本文通過SAH模型鼠的研究證實GSPE對SAH具有神經(jīng)保護性作用。具體機制如下:①GSPE通過抑制炎癥反應(yīng),改善腦血管痙攣,增加腦供血,從而減少SAH后腦缺血區(qū)范圍;②GSPE通過抑制脂質(zhì)過氧化,增加自由基清除,從而抑制氧化應(yīng)激反應(yīng),起到腦保護作用。本實驗為GSPE在中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病中的應(yīng)用提供了新的理論依據(jù),為SAH后急性腦損傷的治療提供了一定的理論支持。