n-3多不飽和脂肪酸對注意缺陷多動障礙小鼠腦組織炎癥的影響

申文雯,戚小紅

(首都醫(yī)科大學(xué)宣武醫(yī)院兒科,北京 100053;*通訊作者,E-mail:meiwenqi@yeah.net)

注意缺陷多動障礙(attention deficit hyperactivity disorder,ADHD)是目前兒童中最常見的一種神經(jīng)發(fā)育障礙性疾病,以注意力缺損、多動、沖動行為為主要癥狀,在我國的發(fā)病率呈逐年上升趨勢?；?、家庭教育、環(huán)境及飲食因素均參與了ADHD發(fā)生,此外有研究報道還指出ADHD是一種高炎癥及免疫相關(guān)性疾病[1]。至今,關(guān)于兒童ADHD的發(fā)病機(jī)制仍不十分清楚,其中神經(jīng)系統(tǒng)免疫及炎癥改變可能在ADHD發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮著十分重要作用[2]。

腦組織中炎性反應(yīng)相關(guān)因子除了可由單核巨噬細(xì)胞、淋巴細(xì)胞、成纖維細(xì)胞和血管內(nèi)皮細(xì)胞等免疫細(xì)胞合成外,激活的星形膠質(zhì)細(xì)胞也具有吞噬功能,并能分泌多種炎性因子。激活的單核細(xì)胞、膠質(zhì)細(xì)胞可分化為2種明顯不同的極化狀態(tài):M1和M2。M1型具有細(xì)胞毒性作用,可引起組織炎性損傷,M1型表面標(biāo)志物包括iNOS、CD11b、CD16、CD32;M2型可抑制免疫反應(yīng),促進(jìn)組織修復(fù),M2型表面標(biāo)志物包括CD206、Agr-1、CCL22等[3]。

n-3多不飽和脂肪酸(n-3 polyunsaturated fatty acids,n-3PUFAs)不僅在調(diào)節(jié)脂代謝、免疫、炎癥反應(yīng)等方面起著重要作用,而且對腦發(fā)育及其功能也至關(guān)重要[4]。已有研究表明膳食補(bǔ)充n-3 PUFAs可減少炎癥介質(zhì)的產(chǎn)生,減輕炎癥反應(yīng),調(diào)節(jié)免疫功能[5]。那么對于ADHD小鼠模型來說,給予n-3 PUFAs喂養(yǎng)是否能有效減輕腦組織的炎癥狀態(tài),對于臨床輔助治療ADHD有明顯的指導(dǎo)意義。

1 材料與方法

1.1 動物分組與模型建立

自斯貝福(北京)生物技術(shù)有限公司(生產(chǎn)許可證:SCXK(京)2012-0006)購買30只12周齡雄性C57BL/6 J小鼠,體質(zhì)量30-32 g。飼養(yǎng)于軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動物中心。小鼠隨機(jī)分為3組:ADHD組(n=10),ADHD+n-3 PUFAs組(n=10)及對照組(n=10)。

ADHD組小鼠稱重后腹腔注射東莨菪堿(3 mg/kg,Sigma公司,美國),每天上午9:00-11:00統(tǒng)一給藥,每日1次,連續(xù)給藥14 d。由于東莨菪堿可與乙酰膽堿競爭M受體,從而抑制膽堿能神經(jīng)突觸的信息傳遞,特異性感覺傳入受阻,小鼠活動次數(shù)顯著增加,大腦出現(xiàn)精神不集中,注意力渙散,建立ADHD小鼠模型。ADHD+n-3 PUFAs組在構(gòu)建ADHD小鼠模型后,給予魚油(100 mg/kg)(湯臣倍健公司提供)劑量給予灌胃,連續(xù)灌胃14 d[6]。魚油的成分為EPA和DHA,即n-3 PUFAs,不含有其他成分,直接喂養(yǎng)魚油即是對小鼠給予n-3 PUFAs干預(yù)。對照組小鼠腹腔注射給予相應(yīng)劑量的生理鹽水。

1.2 腦炎癥因子表達(dá)的測定

實(shí)驗(yàn)結(jié)束后,頸椎脫臼法處死小鼠,快速摘除腦組織,投入液氮中保存。取右側(cè)半腦,稱重,加9倍預(yù)冷PBS于電動勻漿器中勻漿,4 ℃離心10 min,取上清液。酶標(biāo)儀測量上清液中IL-1β及TNF-α(由Ebioscience公司提供,貨號分別為:BMS6002和BMS607-3)的OD值。

1.3 腦皮質(zhì)M1和M2型巨噬細(xì)胞相關(guān)標(biāo)記基因的測定

檢測腦組織中M1和M2巨噬細(xì)胞相關(guān)標(biāo)記基因iNOS、CD11b、CD16、CD32和CD206、Agr-1、CCL22的mRNA表達(dá)。選取左側(cè)半腦,使用Trizol試劑盒(Cat.No.15596-026,Invitrogen公司,美國)對腦組織中的總RNA進(jìn)行抽提,然后應(yīng)用SuperScript TM II逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(Cat.No.18080-051,Invitrogen公司,美國)將RNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA。采用SYBRGreen染料法對目的基因進(jìn)行擴(kuò)增。PCR反應(yīng)條件為95 ℃預(yù)變性10 min,95 ℃變性15 s,60 ℃退火20 s,72 ℃延伸15 s和7 min,進(jìn)行40個循環(huán)。小鼠M1及M2型巨噬細(xì)胞相關(guān)標(biāo)記基因擴(kuò)增引物見表1。

表1 熒光定量PCR所用引物序列

Table 1 Primer sequences used in fluorescence quantitative PCR

基因引物名稱引物序列(5′-3′) 產(chǎn)物(bp)iNOS上游引物CGAGGTCTTACGACTACAAGCC210下游引物CCTTGGTTACACCAGAAGGGAGCD11b上游引物ATGGACGCTGATGGCAATACC203下游引物TCCCCATTCACGTCTCCCACD16上游引物TTTGGCCTACTACCCAAGGG217下游引物TTCGGTTCCTCTGTGGAATGACD32上游引物GGTCCAAGTCTCCGGCTCTA157下游引物AGCACATGACTCAATCCTACAGTCD206上游引物CTCTGTTCAGCTATTGGACGC132下游引物CGGAATTTCTGGGATTCAGCTTCAgr-1上游引物CTCCAAGCCAAAGTCCTTAGAG127下游引物AGGAGCTGTCATTAGGGACATCCCL22上游引物AGGTCCCTATGGTGCCAATGT111下游引物CGGCAGGATTTTGAGGTCCAβ-actin上游引物GGCTGTATTCCCCTCCATCG154下游引物CCAGTTGGTAACAATGCCATGT

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 ADHD小鼠腦炎癥因子表達(dá)變化及n-3 PUFAs的影響

與對照組相比,ADHD組腦組織IL-1β及TNF-α表達(dá)升高,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。ADHD+n-3 PUFAs組小鼠腦組織中IL-1β及TNF-α表達(dá)明顯降低(P<0.05),但接近對照組水平(見圖1,2)。

與對照組相比,*P<0.05;與ADHD組相比,#P<0.05圖1 小鼠腦組織IL-1β的表達(dá)量Figure 1 The expression of IL-1β in brain of mice

與對照組相比,*P<0.05;與ADHD組相比,#P<0.05圖2 小鼠腦組織TNF-α的表達(dá)量Figure 2 The expression of TNF-α in brain of mice

2.2 ADHD小鼠腦組織M1和M2型巨噬細(xì)胞相關(guān)標(biāo)記基因mRNA的表達(dá)及n-3 PUFAs影響

與對照組相比,ADHD組小鼠腦組織中M1型單核巨噬細(xì)胞相關(guān)標(biāo)記基因mRNA表達(dá)量均明顯升高,而ADHD+n-3 PUFAs組M1型單核巨噬細(xì)胞相關(guān)標(biāo)記基因mRNA的表達(dá)量明顯降低,其中以iNOS和CD32表達(dá)改變最為明顯(見圖3,4)。

與對照組相比,ADHD組小鼠M2型單核巨噬細(xì)胞相關(guān)標(biāo)記基因中Agr-1 mRNA表達(dá)量明顯降低,ADHD+n-3 PUFAs組M2型單核巨噬細(xì)胞相關(guān)標(biāo)記基因的mRNA表達(dá)量并未明顯提升(見圖3,4)。

與對照組相比,*P<0.05;與ADHD組相比,#P<0.05圖3 小鼠腦組織M1巨噬細(xì)胞相關(guān)標(biāo)記基因mRNA的相對表達(dá)Figure 3 The expression of M1 macrophage related marker genes in brain of mice

與對照組相比,*P<0.05;與ADHD組相比,#P<0.05圖4 小鼠腦組織M2型巨噬細(xì)胞相關(guān)標(biāo)記基因mRNA的相對表達(dá)Figure 4 The expression of M2 macrophage related marker genes in brain of mice

3 討論

炎癥在兒童ADHD發(fā)生中發(fā)揮十分重要的作用,ADHD兒童機(jī)體中炎癥標(biāo)記物,如中性粒細(xì)胞/淋巴細(xì)胞比值、可溶性細(xì)胞間黏附分子、IL-6、TNF-α、IL-1β等表達(dá)明顯升高[7]。尤其是發(fā)育期炎癥環(huán)境暴露是ADHD發(fā)生的高危因素,已有研究指出伴有免疫性疾病及處于高炎癥狀態(tài)的母親其子代ADHD發(fā)病率明顯升高[8]。ADHD動物模型也顯示腦組織的炎癥不僅可以影響腦結(jié)構(gòu)發(fā)育,還可以改變神經(jīng)遞質(zhì)系統(tǒng)(多巴胺能、五羥色胺能、谷氨酸能神經(jīng)系統(tǒng))功能,常伴有膠質(zhì)細(xì)胞激活及神經(jīng)免疫激活[3]。本研究應(yīng)用腹腔注射東莨菪堿構(gòu)建ADHD小鼠模型,觀測其腦組織炎癥因子IL-1β及TNF-α表達(dá),結(jié)果同樣顯示這些炎癥標(biāo)記物表達(dá)明顯升高。

腦組織的高炎癥狀態(tài)可能與單核細(xì)胞、膠質(zhì)細(xì)胞活化有關(guān)。膠質(zhì)/單核細(xì)胞在不同炎癥階段可活化為促炎M1型,分泌多種炎癥因子,也可以活化為抗炎M2型,抑制促炎表型,有助于神經(jīng)保護(hù)。動物實(shí)驗(yàn)表明膠質(zhì)/單核細(xì)胞向M1型激活增多,可導(dǎo)致神經(jīng)元及認(rèn)知功能長久異常[9]。本研究顯示ADHD小鼠腦組織中M1型巨噬細(xì)胞相關(guān)標(biāo)記基因iNOS和CD32 mRNA表達(dá)明顯增多,而M2型巨噬細(xì)胞相關(guān)標(biāo)記基因Agr-1 mRNA表達(dá)明顯減少。M1型巨噬細(xì)胞的過度激活可能是ADHD小鼠腦組織高炎癥狀態(tài)的原因之一。

隨著對n-3 PUFAs研究的深入,人們發(fā)現(xiàn)ADHD等神經(jīng)精神類疾病的發(fā)生與n-3 PUFAs缺乏密切相關(guān)[10],同時n-3 PUFAs的飲食攝入量及其紅細(xì)胞膜中含量與疾病的嚴(yán)重度成負(fù)相關(guān)關(guān)系。而且應(yīng)用EPA和DHA治療能明顯緩解ADHD患兒的臨床癥狀[4]。我們的研究也顯示,給予ADHD小鼠灌胃n-3 PUFAs,可以明顯降低腦組織IL-1β及TNF-α炎性因子表達(dá)。究其原因,除了EPA和DHA可分別衍生為脂類活性分子E-resolvins(RvEs)和D-resolvins(RvDs)、protectin D1(PD1)而發(fā)揮較強(qiáng)的抗炎作用外,還可能與調(diào)控M1、M2激活改變有關(guān)[11]。本研究也顯示給予n-3 PUFAs灌胃處理后能明顯降低腦組織中M1型單核巨噬細(xì)胞相關(guān)標(biāo)記基因iNOS、CD11b和CD32的mRNA表達(dá),但未顯示有助于提升M2型單核巨噬細(xì)胞相關(guān)標(biāo)記基因的mRNA表達(dá)。