高糖通過抑制Bmal1調控的自噬加重細胞缺氧復氧損傷

高文蔚,袁 泉,江 夢,劉 戀,趙 博*

(1武漢大學人民醫(yī)院重癥醫(yī)學科,武漢 430060;2武漢大學人民醫(yī)院麻醉科;*通訊作者,E-mail:zb14526@163.com)

生物鐘是由各種具有調控作用的信號分子和自動調節(jié)反饋生理活動的回路共同組成[1]。在哺乳動物晝夜節(jié)律核心反饋環(huán)中,時鐘基因Bmal1對于晝夜節(jié)律的生成必不可少。Bmal1是參與能量代謝、細胞自噬、氧化應激、細胞凋亡等各種重要生理功能的關鍵基因[2,3]。更重要的是當Bmal1表達異常時,可導致諸如睡眠剝奪、糖代謝障礙、胰島素抵抗等病理狀態(tài)的發(fā)生[4,5]。

自噬作為維護細胞結構功能完整、氧化系統(tǒng)平衡的重要內源性保護機制,通過排除機體內有害分子,清除活性氧簇進而減輕損傷[6,7]。正常情況下神經元IR期間,自噬激活以對抗氧化應激,產生神經保護作用[8]。而在糖尿病狀態(tài)下神經元IR損傷加重,自噬在糖尿病狀態(tài)下發(fā)揮了怎樣的功能?目前尚未有相關研究報道。本研究擬采用PC-12細胞通過建立高糖缺氧復氧模型觀察高糖狀態(tài)下時鐘基因Bmal1調控的自噬在細胞缺氧復氧損傷中的作用。

1 材料與方法

1.1 材料

PC-12細胞(ATCC,美國),DMEM低糖培養(yǎng)基(Hyclone,美國),RIPA裂解液,乳酸脫氫酶(LDH)試劑盒,活性氧(ROS)測試盒,超氧化物歧化酶(SOD)試劑盒,丙二醛(MDA)試劑盒(南京建成,中國),兔抗鼠Bmal1,Beclin-1抗體(CST,美國)。

1.2 細胞培養(yǎng)及分組

PC-12細胞用10%馬血清、5%胎牛血清、100 U/ml青霉素和100 μg/ml鏈霉素的DMEM低糖培養(yǎng)基(葡萄糖濃度5.5 mmol/L),置于37 ℃、5%CO2,飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。當細胞生長到70%-80%滿瓶時傳代,繼續(xù)培養(yǎng)。取第5-8代對數生長期細胞用于后續(xù)研究。采用隨機數字表法將PC-12細胞分為:低糖組(NG組),低糖缺氧復氧組(NH/R組),高糖組(HG組),高糖缺氧復氧組(HH/R組)。高糖模型的建立:PC-12細胞鋪板用無血清低糖DMEM培養(yǎng)基同步化24 h后加入高糖(葡萄糖終質量濃度25 mmol/L)培養(yǎng)24 h。缺氧復氧模型的建立:NH/R組與HH/R組置于缺氧(1%O2、5% CO2、94%N2)環(huán)境中培養(yǎng)3 h后;置于正常條件下繼續(xù)培養(yǎng)復氧6 h。

1.3 指標檢測

1.3.1 檢測細胞活性與氧化應激水平 收集細胞培養(yǎng)上清液,按照試劑盒說明書操作,在450-525 nm波長的酶標儀下測定LDH,ROS,SOD和MDA水平。

1.3.2 流式細胞儀檢測細胞凋亡 細胞收集并1 000 r/min離心5 min,棄上清。沉淀用500 μl緩沖液重懸,加入5 μl Annexin Ⅴ-異硫氰酸熒光素(FITC)和10 μl碘化丙錠(PI),室溫避光孵育5 min后用流式細胞儀上機檢測。

1.3.3 免疫蛋白印跡法檢測Bmal1、Beclin-1 收集細胞進行蛋白抽提,采用聚丙烯酞胺凝膠電泳分離目的蛋白,冰浴轉膜,脫脂奶粉室溫封閉。加入兔抗鼠Bmal1(1 ∶1 000)，Beclin-1(1 ∶500)一抗4 ℃孵育過夜，加入羊抗兔二抗(1 ∶10 000)室溫避光孵育1 h，用紅外成像系統(tǒng)掃膜并分析測定條帶灰度值。

1.3.4 透射電鏡檢測自噬小體 將6孔板棄上清,加入2.5%戊二醛1 ml,收集細胞,離心后棄上清,1%四氧化鋨后固定后,采用醋酸雙氧鈾-枸櫞酸鉛雙重染色,透射電鏡下計數自噬小體數量。

1.4 統(tǒng)計學方法

2 結果

2.1 氧化應激相關指標結果

與NG組相比,HG組和NH/R組SOD降低,LDH、ROS、MDA升高(P<0.05);與NH/R組相比,HH/R組SOD降低,LDH、ROS、MDA升高(P<0.05);與HG組相比,HH/R組SOD降低,LDH、ROS、MDA升高(P<0.05,見表1)。

表1 PC-12細胞活性變化及氧化應激指標的變化

Table 1 Changes of cell activity and oxidative stress in PC-12 cells

LDH(U/L)ROS(AU)SOD(U/mg)MDA(nmol/mg)NG組133±123384±263187.9±14.62.26±0.32NH/R組204±17a6583±337a146.2±10.7a3.75±0.57aHG組231±26a6427±351a137.2±11.3a4.28±0.49aHH/R組422±32bc9822±462bc 95.7±8.4bc6.73±0.53bc

與NG組相比,aP<0.05;與NH/R組相比,bP<0.05;與HG組相比,cP<0.05

2.2 細胞凋亡指標檢測

與NG組相比,HG組和NH/R組凋亡率升高(P<0.05);與NH/R組相比,HH/R組凋亡率升高(P<0.05);與HG組相比,HH/R組凋亡率升高(P<0.05,見圖1,表2)。

圖1 四組流式細胞凋亡率的比較Figure 1 Comparison of apoptotic rates by flow cytometry in four groups

2.3 Bmal1及自噬指標檢測

與NG組相比,NH/R組Bmal1降低,Beclin-1升高,自噬小體增多(P<0.05);與NG組相比,HG組Bmal1、Beclin-1降低,自噬小體減少(P<0.05);與NH/R組相比,HH/R組Bmal1、Beclin-1降低,自噬小體減少(P<0.05);與HG組相比,HH/R組Bmal1降低(P<0.05),Beclin-1、自噬小體無統(tǒng)計學差異(P>0.05,見表2,圖2)。

表2 四組細胞凋亡率及時鐘基因Bmal1和自噬相關蛋白的比較

Table 2 Cell apoptosis rate and Bmal1 and autophagy related protein expression in different groups

組別凋亡率(%) Bmal1 Beclin-1自噬小體NG組1.72±0.131.00±0.001.00±0.003.6±0.2NH/R組5.28±0.27a0.42±0.06a1.72±0.22a5.7±0.6aHG組4.96±0.33a0.72±0.11a0.86±0.14a2.4±0.3aHH/R組7.67±0.54bc0.31±0.08bc0.84±0.28b2.7±0.5b

與NG組相比,aP<0.05;與NH/R組相比,bP<0.05;與HG組相比,cP<0.05

圖2 四組間Bmal1、Beclin-1表達及自噬小體的變化Figure 2 Expression of Bmal1, Beclin-1 and autophagosome under TEM in four groups

3 討論

生物鐘是廣泛存在于生物體內重要的內源性調節(jié)機制,生物鐘節(jié)律及其穩(wěn)定性是維持機體糖代謝平衡的重要機制之一,生物鐘節(jié)律紊亂可促發(fā)糖尿病,反之糖尿病亦可導致生物鐘節(jié)律紊亂[9]。時鐘基因Bmal1作為維持生物鐘節(jié)律穩(wěn)定的關鍵基因,其更是能量代謝、生物鐘節(jié)律負反饋環(huán)的重要介質。當時鐘基因Bmal1表達降低時可導致糖代謝異常、胰島素抵抗等疾病的發(fā)生[4,10]。

Bmal1在腦組織中廣泛表達,研究發(fā)現,Bmal1可通過調節(jié)大腦中氧化還原基因的表達,進而調控氧化應激[11]。Bmal1缺失則會導致突觸末梢受損變性,進而皮層連接功能受損,神經元氧化應激損傷加重[12]。同時,Bmal1還參與了機體內血管功能障礙和重塑等功能,進而調控腦缺血再灌注損傷的發(fā)生、發(fā)展及預后[13]。

糖尿病作為加重缺血性腦卒中的重要危險因素,在持續(xù)高糖環(huán)境下,腦卒中患者受損程度更重,梗死面積更大,而腦卒中又會導致應激性高血糖,從而形成惡性循環(huán)[14]。研究表明,自噬在缺血再灌注病理進程中發(fā)揮重要作用。具體表現為再灌注階段ROS通過自噬的氧化修飾直接刺激自噬小體的形成進一步增強自噬,有效清除受損的細胞器,進而抑制其內源性凋亡通路[8,15]。因此,我們認為自噬在糖尿病腦卒中的發(fā)生發(fā)展過程中亦扮演著重要的作用。

我們研究結果發(fā)現,在高糖環(huán)境中,HG組較NG組相比,LDH、ROS、MDA升高,SOD降低,細胞凋亡率升高,表明高糖環(huán)境下細胞氧化應激增加,損傷嚴重,缺氧復氧后,HH/G組較HG組細胞損傷更加嚴重。我們進一步研究發(fā)現,在高糖環(huán)境中,HH/G組較HG組相比,自噬相關蛋白Beclin-1和自噬小體并沒有顯著增加,同時時鐘基因Bmal1表達降低。因此,我們推測:自噬功能降低是糖尿病腦卒中的重要病理生理特征。高糖環(huán)境會破壞細胞自噬,從而引發(fā)神經組織產生病理改變。通過恢復自噬,排除機體內的有害分子促進細胞內穩(wěn)態(tài)恢復,可能是改善這一病理生理現象的關鍵所在。然而當細胞內應激持續(xù)存在時(例如:高糖導致的ROS持續(xù)增多),自噬功能無法恢復,則會導致損傷無法修復,持續(xù)加重[16]。

綜上所述,高糖誘導的氧化應激抑制時鐘基因Bmal1的表達,進而導致自噬功能降低,加重缺氧復氧損傷。