SOX2抗原HLA-A*0201限制性CTL表位的預(yù)測(cè)及鑒定

王 宇,袁競(jìng)妍,張憶雯,楊拴盈*

(1西安交通大學(xué)第二附屬醫(yī)院心血管外科,西安 710004;2西安交通大學(xué)第二附屬醫(yī)院呼吸與危重癥醫(yī)學(xué)科;*通訊作者,E-mail:yangshuanying66@163.com)

肺癌是最常見(jiàn)的惡性腫瘤之一,死亡率居各類腫瘤之首。美國(guó)的一項(xiàng)統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)[1]顯示,2016年肺癌死亡患者占所有癌癥死亡人數(shù)的24%(男性)和23%(女性),無(wú)論在男性或者女性中肺癌均是腫瘤的首要死因。在中國(guó),針對(duì)2013年肺癌發(fā)病及死亡分析的一項(xiàng)研究顯示[2],當(dāng)年肺癌新發(fā)病例數(shù)達(dá)73.28萬(wàn)人,因肺癌死亡患者約53.07萬(wàn)人,發(fā)病例數(shù)及死亡例數(shù)在全國(guó)所有惡性腫瘤中占比分別為19.90%和26.20%,均居惡性腫瘤的首位。以上數(shù)據(jù)說(shuō)明肺癌將為全球人口健康和世界經(jīng)濟(jì)發(fā)展帶來(lái)沉重負(fù)擔(dān)。

傳統(tǒng)的肺癌治療方法效果不佳,肺癌患者死亡率高,5年生存率僅為4%-17%[3],免疫治療近年來(lái)蓬勃發(fā)展。肺癌疫苗是免疫治療的一種,適合腫瘤負(fù)荷較小、復(fù)發(fā)危險(xiǎn)性較大的患者,尤其是完全手術(shù)切除后和臨床放化療后達(dá)到完全(或部分)緩解的患者[4],如TG4010、MAGE-A3等在臨床試驗(yàn)中已體現(xiàn)出一定的積極療效[5,6]。MAGE多肽疫苗已被證明對(duì)黑色素瘤療效確切[7]。多肽疫苗已在消除人類腫瘤轉(zhuǎn)移灶和預(yù)防腫瘤復(fù)發(fā)方面顯示出了一定的療效。篩選免疫原性較強(qiáng)的多肽表位是多肽疫苗研發(fā)的重點(diǎn)。

SOX2是一種包含HMG DNA結(jié)構(gòu)域的SRY相關(guān)性基因,在肺癌的發(fā)生、發(fā)展中扮演重要角色,是肺癌診斷、治療的重要指標(biāo)和靶點(diǎn)。本研究應(yīng)用生物信息學(xué)軟件對(duì)SOX2蛋白進(jìn)行HLA-A*0201限制性CTL抗原表位的初步預(yù)測(cè),選取3條優(yōu)勢(shì)表位肽,分別對(duì)其進(jìn)行體外實(shí)驗(yàn)以檢測(cè)其引起免疫效應(yīng)的能力,篩選出免疫原性較強(qiáng)的多肽片段,為治療性肺癌多肽疫苗的制備奠定基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 細(xì)胞株 T2細(xì)胞(TAP缺陷,HLA-A0201限制性),購(gòu)于上海復(fù)祥生物科技有限公司,細(xì)胞懸浮生長(zhǎng),用含10%胎牛血清、1%青鏈霉素的RPMI1640培養(yǎng)基培養(yǎng)。人外周血單個(gè)核細(xì)胞(human peripheral blood mononuclear cells,PBMCs),供血者簽署科學(xué)研究知情同意書(shū)后,抽取其外周血并從中分離而得,用混合培養(yǎng)基培養(yǎng)。

1.1.2 生物信息學(xué)軟件 本次研究采用以下生物信息學(xué)軟件:NCBI NP-00309(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/protein/NP-003097.1);SYFPEITHI(http://www.syfpeithi.de);BIMAS(http://www-bimas.cit.nih.gov/molbio/hla-bind/);ProPred-I(http://imtech.res.in/raghava/propred1/)。

1.1.3 主要試劑 所用各種合成肽凍干粉,由鄭州派和泰德醫(yī)藥科技有限公司合成。人β2微球蛋白(β2m),購(gòu)自美國(guó)Sigma公司。APC標(biāo)記的鼠抗人HLA-A2抗體,購(gòu)自美國(guó)eBioscience公司。預(yù)包被IFN-γ ELISPOT檢測(cè)試劑盒,購(gòu)自深圳達(dá)科為生物技術(shù)有限公司。LDH檢測(cè)試劑盒,購(gòu)自南京建成生物工程研究所。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 SOX2抗原的HLA-A*0201限制性CTL表位的生物信息學(xué)預(yù)測(cè) 在NCBI上進(jìn)行SOX2蛋白氨基酸序列的查詢,將得到的氨基酸序列分別輸入SYFPEITHI、BIMAS和ProPred-1軟件中,限定條件為:“長(zhǎng)度為9個(gè)氨基酸殘基的肽段”和“HLA-A*0201限制性表位”,選取3條評(píng)分高的9肽片段,現(xiàn)按評(píng)分由高到低依次用P1、P2、P3指代。

1.2.2 T2細(xì)胞結(jié)合實(shí)驗(yàn) 將密度為4×106/ml的T2細(xì)胞懸液以50 μl/孔的密度種在96孔板中,調(diào)整每孔內(nèi)含3 μg/ml的人β2微球蛋白。每個(gè)實(shí)驗(yàn)肽均設(shè)100,50,25,12,6,3,1 μmol/L不同濃度組,設(shè)陽(yáng)性表位肽(FLPSDFFPSV)組和陰性表位肽(AHTKDGFNF)組,設(shè)空白對(duì)照組(僅加溶劑和3 μg/ml人β2微球蛋白)。將上述孔板放入37 ℃ 5%CO2孵箱中孵育18 h,將孔板取出,洗滌細(xì)胞后用100 μl 0.01 mol/L PBS溶液重懸,加入5 μl APC標(biāo)記的鼠抗人HLA-A2抗體,4 ℃冰箱孵育30 min,從冰箱取出后洗滌細(xì)胞,再用300 μl 1%多聚甲醛重懸固定至少20 min,隨后流式細(xì)胞儀檢測(cè)APC熒光強(qiáng)度。用HLA-A2分子平均熒光強(qiáng)度增加的百分?jǐn)?shù)(%MFI increase)來(lái)衡量各實(shí)驗(yàn)肽的抗原性,計(jì)算公式:%MFI increase=[(實(shí)驗(yàn)肽MFI-空白對(duì)照組的MFI)/空白對(duì)照組的MFI]×100%。

1.2.3 人PBMCs的分離和鑒定 本研究招募健康志愿者5名,按照操作說(shuō)明用淋巴細(xì)胞分離液進(jìn)行PBMCs的分離,制備細(xì)胞懸液,采用流式細(xì)胞儀檢測(cè)別藻青蛋白(allophycocyanin,APC,一種染料)的熒光強(qiáng)度,選取熒光強(qiáng)度較強(qiáng)的健康人作為后續(xù)實(shí)驗(yàn)的供血者。

1.2.4 效應(yīng)細(xì)胞的誘導(dǎo) 用不含肽的混合培養(yǎng)基和含10 μmol/L合成肽(P1、P2、P3、陽(yáng)性肽、陰性肽分別培養(yǎng),每種溶液僅含一種肽)的混合培養(yǎng)基分別重懸PBMCs細(xì)胞,在96孔板中按照每孔2×105個(gè)細(xì)胞的密度進(jìn)行細(xì)胞接種,每孔總體積200 μl,37 ℃ 5%CO2孵箱中培養(yǎng),每隔2 d分別用不含肽的混合培養(yǎng)基和含20 μmol/L相對(duì)應(yīng)合成肽的混合培養(yǎng)基給細(xì)胞進(jìn)行換液。

1.2.5 靶細(xì)胞的誘導(dǎo) 各實(shí)驗(yàn)肽誘導(dǎo)的靶細(xì)胞制備:用混合培養(yǎng)基將T2細(xì)胞重懸為1×106個(gè)/ml密度的細(xì)胞懸液,取5 ml分為5管,每管中加入5 μl 0.4 mmol/L的不同肽(P1、P2、P3、陽(yáng)性肽、陰性肽)溶液,混勻。

總而言之，現(xiàn)階段房屋建筑工程數(shù)量及規(guī)模已然呈現(xiàn)出逐年增長(zhǎng)的發(fā)展態(tài)勢(shì)，因此為更好的保障房屋建筑工程質(zhì)量，實(shí)現(xiàn)工程穩(wěn)定有序建設(shè)目標(biāo)，相關(guān)管理部門(mén)就應(yīng)從認(rèn)清建筑土建施工中質(zhì)量監(jiān)督管理重要性入手，結(jié)合工程具體建設(shè)需求，構(gòu)建科學(xué)且長(zhǎng)效土質(zhì)量管理機(jī)制，及時(shí)發(fā)現(xiàn)工程施工中存在的風(fēng)險(xiǎn)因素，更好的降低工程事故發(fā)生幾率。

抗體封閉的T2細(xì)胞制備:用混合培養(yǎng)基將T2細(xì)胞重懸為1×106個(gè)/ml密度的細(xì)胞懸液,取5 ml加入250 μl APC標(biāo)記的鼠抗人HLA-A2抗體,4 ℃冰箱孵育30 min,洗滌3遍,用5 ml混合培養(yǎng)基重懸后分為5管,每管中加入5 μl 0.4 mmol/L的不同肽(P1、P2、P3、陽(yáng)性肽、陰性肽)溶液,混勻。

1.2.6 hIFN-γ ELISPOT實(shí)驗(yàn) 收集誘導(dǎo)第15天的效應(yīng)細(xì)胞,將未經(jīng)肽刺激的PBMCs和不同肽誘導(dǎo)的效應(yīng)細(xì)胞按5×104個(gè)/孔的密度接種于96孔板上,同時(shí)設(shè)只含培養(yǎng)基的空白對(duì)照組。將孔板分為三部分:第一部分為參照組,將10 μl 25 μg/ml的有絲分裂原PHA溶液分別加入不同肽誘導(dǎo)的效應(yīng)細(xì)胞及一組未經(jīng)肽刺激的PBMCs細(xì)胞中制備而得,使得各種合成肽誘導(dǎo)的PBMCs與有絲分裂原PHA反應(yīng);第二部分為實(shí)驗(yàn)組,將50 μl各實(shí)驗(yàn)肽誘導(dǎo)的T2細(xì)胞懸液分別加入不同肽誘導(dǎo)的效應(yīng)細(xì)胞及一組未經(jīng)肽刺激的PBMCs細(xì)胞中制備而得,使得各種合成肽誘導(dǎo)的PBMCs與相應(yīng)肽誘導(dǎo)的T2細(xì)胞反應(yīng);第三部分為抗體封閉組,將50 μl結(jié)合對(duì)應(yīng)肽抗體封閉的T2細(xì)胞懸液分別加入不同肽誘導(dǎo)的效應(yīng)細(xì)胞及一組未經(jīng)肽刺激的PBMCs細(xì)胞中制備而得,使得各種合成肽誘導(dǎo)的PBMCs與HLA-A2抗體封閉的相應(yīng)肽所誘導(dǎo)的T2細(xì)胞反應(yīng)。每個(gè)孔設(shè)2個(gè)復(fù)孔。置于37 ℃ 5% CO2孵箱中培養(yǎng)18 h,取出孔板,按照試劑盒操作說(shuō)明進(jìn)行顯色后寄回深圳達(dá)科為生物技術(shù)有限公司進(jìn)行讀板。

1.2.7 LDH釋放實(shí)驗(yàn) 在96孔板中分別加入100 μl密度為1×105個(gè)/ml的各種靶細(xì)胞懸液,再相應(yīng)地加入100 μl對(duì)應(yīng)合成肽誘導(dǎo)的PBMCs細(xì)胞,效靶比為5 ∶1-20 ∶1。每組預(yù)留出不加效應(yīng)細(xì)胞的靶細(xì)胞自然釋放組(加100 μl培養(yǎng)液)和最大釋放組(加入100 μl 2%Triton X-100),每孔設(shè)2個(gè)復(fù)孔。置于37 ℃ 5%CO2孵箱中培養(yǎng)4 h后取出孔板,離心后每孔吸出20 μl上清加入到另一塊96孔板,按照試劑盒操作說(shuō)明進(jìn)行顯色,在波長(zhǎng)450 nm處酶標(biāo)儀檢測(cè)各孔OD值。殺傷活性的計(jì)算公式:殺傷活性(%)=[(實(shí)驗(yàn)組OD值-自然釋放組OD值)/(最大釋放組OD值-自然釋放組OD值)]×100%。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 HLA-A*0201限制性CTL表位的生物信息學(xué)預(yù)測(cè)

在NCBI上查詢SOX2蛋白氨基酸序列,可得到317個(gè)氨基酸殘基序列,如下:

1 MYNMMETELKPPGPQQTSGGGGGNSTAAAAGG NQKNSPDRVKRPMNAFMVWSRGQRRKMA

61 QENPKMHNSEISKRLGAEWKLLSETEKRPFIDE AKRLRALHMKEHPDYKYRPRRKTKTLM

121 KKDKYTLPGGLLAPGGNSMASGVGVGAGLGAG VNQRMDSYAHMNGWSNGSYSMMQDQLGY

181 PQHPGLNAHGAAQMQPMHRYDVSALQYNSMT SSQTYMNGSPTYSMSYSQQGTPGMALGSM

241 GSVVKSEASSSPPVVTSSSHSRAPCQAGDLRDM ISMYLPGAEVPEPAAPSRLHMSQHYQS

301 GPVPGTAINGTLPLSHM

用SYFPEITHI軟件預(yù)測(cè)得到評(píng)分較高的前5條多肽:SMYLPGAEV、LLAPGGNSM、LMKKDKYTL、ALGSMGSVV、TAINGTLPL(見(jiàn)表1)。

用BIMAS軟件預(yù)測(cè)得到評(píng)分較高的前5條多肽:SMYLPGAEV、TLMKKDKYT、RLGAEWKLL、ALGSMGSVV、SMTSSQTYM(見(jiàn)表2)。

用ProPred-1軟件預(yù)測(cè)得到評(píng)分較高的前5條多肽:SMYLPGAEV、TLMKKDKYT、RLGAEWKLL、ALGSMGSVV、SMTSSQTYM(見(jiàn)表3)。

綜合分析上述結(jié)果,選取3條九肽:SMYLPGAEV、TLMKKDKYT、ALGSMGSVV,依次用P1、P2、P3指代。

2.2 T2細(xì)胞結(jié)合實(shí)驗(yàn)

經(jīng)流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè),不同肽處理后,T2細(xì)胞表面的HLA-A2分子表達(dá)出現(xiàn)變化,體現(xiàn)在平均熒光強(qiáng)度增長(zhǎng)百分?jǐn)?shù)的改變上。肽濃度為100 μmol/L和50 μmol/L時(shí),與其他組相比P1組%MFI increase明顯增高,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05,見(jiàn)圖1)。

表1 SYFPEITHI軟件預(yù)測(cè)HLA-A*0201限制性CTL表位得分表

Table 1 Prediction score of HLA-A *0201 restricted CTL epitope by SYFPEITHI software

序號(hào)起始位點(diǎn)氨基酸序列得分1275SMYLPGAEV262131LLAPGGNSM253119LMKKDKYTL224236ALGSMGSVV225306TAINGTLPL21

表2 BIMAS軟件預(yù)測(cè)HLA-A*0201限制性CTL表位得分表

Table 2 Prediction score of HLA-A *0201 restricted CTL epitope by BIMAS software

序號(hào)起始位點(diǎn)氨基酸序列得分1275SMYLPGAEV160.7422118TLMKKDKYT151.648374RLGAEWKLL36.3164236ALGSMGSVV28.5165209SMTSSQTYM19.734658KMAQENPKM12.5587194NQPMHRYDV11.988

表3 ProPred-1軟件預(yù)測(cè)HLA-A*0201限制性CTL表位得分表

Table 3 Prediction score of HLA-A*0201 restricted CTL epitope by ProPred-1 software

序號(hào)起始位點(diǎn)氨基酸序列得分1275SMYLPGAEV160.7422118TLMKKDKYT151.648374RLGAEWKLL36.3164236ALGSMGSVV28.5165209SMTSSQTYM19.7346298YQSGPVPGT7.9947224SMSYSQQGT5.382

與其他肽組相比,*P<0.05圖1 不同濃度各合成肽誘導(dǎo)T2細(xì)胞后%MFI increase的改變Figure 1 The changes of %median fluorescence intensity increase in T2 cells induced by different concentrations of different synthetic peptides

2.3 hIFN-γ ELISPOT實(shí)驗(yàn)

第一部分各組之間斑點(diǎn)數(shù)目有肉眼可辨的差異(見(jiàn)圖2)。P1組斑點(diǎn)數(shù)目[(359.5±6.36)個(gè)]明顯多于P2組[(279.5±9.19)個(gè)]和P3組[(278.5±13.44)個(gè)],差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);陽(yáng)性肽組斑點(diǎn)數(shù)目[(413±11.31)個(gè)]明顯多于陰性肽組[(291.5±19.09)個(gè)],差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

A.SMYLPGAEV誘導(dǎo)組;B.TLMKKDKYT誘導(dǎo)組;C.ALGSMGSVV誘導(dǎo)組;D.陽(yáng)性肽誘導(dǎo)組;E.陰性肽誘導(dǎo)組;F.無(wú)肽誘導(dǎo)組;G.無(wú)細(xì)胞組圖2 效應(yīng)細(xì)胞與PHA反應(yīng)的hIFN-γ ELISPOT實(shí)驗(yàn)斑點(diǎn)Figure 2 The spots of reaction between effector cells and PHA in hIFN-γ ELISPOT test

第二、三部分斑點(diǎn)肉眼難以分辨,在讀板儀上讀板后得到相應(yīng)數(shù)據(jù)。陽(yáng)性肽組第二部分斑點(diǎn)數(shù)大于第三部分,且此組斑點(diǎn)數(shù)明顯多于其他各組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05,見(jiàn)表4)。

表4 不同肽誘導(dǎo)的效應(yīng)細(xì)胞與PHA組、誘導(dǎo)T2組、抗體封閉組的相應(yīng)靶細(xì)胞相互反應(yīng)產(chǎn)生的hIFN-γ ELISPOT實(shí)驗(yàn)斑點(diǎn)數(shù)(個(gè))

Table 4 The number of spots of reaction between effector cells induced by different peptides and target cells in PHA group, induced T2 group, antibody-blocking group in hIFN-γ ELISPOT test

分組 SMYLPGAEVTLMKKDKYTALGSMGSVV陽(yáng)性肽陰性肽無(wú)刺激組 PHA組359.50±6.36?279.50±9.19278.50±13.44413.00±11.31?291.50±19.09205.00±9.90 誘導(dǎo)T2組2.50±0.711.50±0.71 2.00±1.4110.50±0.71# 3.00±1.412.50±0.71 抗體封閉組3.00±1.410.50±0.71 0±06.50±2.12 1.50±0.710.50±0.71

與TLMKKDKYT組、ALGSMGSVV組和陰性肽組相比,*P<0.05;與抗體封閉組相比,#P<0.05

2.4 LDH釋放實(shí)驗(yàn)

各合成肽誘導(dǎo)的PBMCs作為效應(yīng)細(xì)胞,殺傷相應(yīng)肽誘導(dǎo)的T2細(xì)胞(靶細(xì)胞),通過(guò)檢測(cè)LDH的釋放量的改變來(lái)評(píng)估殺傷效果,趨勢(shì)見(jiàn)圖3。各組效靶比P1組殺傷率明顯高于陰性肽組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);效靶比20 ∶1和10 ∶1時(shí),P2組殺傷率明顯高于陰性肽組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。P1、P2、陽(yáng)性肽及陰性肽組,隨著效靶比的增高,殺傷率逐漸增高。

與陰性肽組相比,*P<0.05圖3 各種肽誘導(dǎo)的效應(yīng)細(xì)胞在不同效靶比時(shí)對(duì)靶細(xì)胞的殺傷率Figure 3 The killing rate of effector cells induced by various peptides at different E/T ratios

3 討論

目前腫瘤疫苗的主要成分是肽、蛋白、重組載體及腫瘤細(xì)胞等具有免疫原性的腫瘤相關(guān)抗原,通過(guò)抗原提呈細(xì)胞的提呈和免疫佐劑輔助,達(dá)到增強(qiáng)疫苗免疫原性的目的。腫瘤通常通過(guò)降低腫瘤抗原處理相關(guān)轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(即腫瘤異常蛋白,tumor abnormal protein,TAP)的表達(dá)來(lái)逃脫CD8 T細(xì)胞免疫。在腫瘤免疫逃逸過(guò)程中出現(xiàn)的與損傷肽處理相關(guān)的T細(xì)胞表位是具有免疫原性的非突變新抗原。HLA-A2限制性表位屬于上述表位,而且在已發(fā)生免疫逃逸的腫瘤治療中很有前景[8]。SOX家族是一組轉(zhuǎn)錄因子,在胚胎發(fā)育和干細(xì)胞生物學(xué)中有舉足輕重的作用。在多種類型腫瘤中均發(fā)現(xiàn)了SOX2基因的擴(kuò)增,如膠質(zhì)母細(xì)胞瘤以及許多鱗狀細(xì)胞癌[9,10]。SOX2是多種腫瘤干細(xì)胞的標(biāo)志物,并參與了干細(xì)胞自我更新的過(guò)程,且在非小細(xì)胞肺癌(non-small cell lung cancer,NSCLC)中已被證實(shí)[11]。因此,SOX2在肺癌的發(fā)生、發(fā)展中扮演重要角色,成為肺癌診斷、治療的重要指標(biāo)和靶點(diǎn)。本研究應(yīng)用BIMAS、SYFPEITHI、ProPred-1軟件對(duì)SOX2蛋白進(jìn)行HLA-A*0201限制性CTL抗原表位的初步預(yù)測(cè),選取3條優(yōu)勢(shì)表位肽:位點(diǎn)為275-283的表位肽SMYLPGAEV,在SYFPEITHI中評(píng)分為26分,在SYFPEITHI、ProPred-1中評(píng)分為160.742,處于第一;位點(diǎn)為118-126的表位肽TLMKKDKYT,在SYFPEITHI、ProPred-1中評(píng)分為151.648,處于第二;位點(diǎn)為74-82的表位肽RLGAEWKLL,在SYFPEITHI、ProPred-1中評(píng)分為36.316,處于第三,但并不在BIMAS軟件所預(yù)測(cè)的前五名中;位點(diǎn)為236-244的表位肽ALGSMGSVV,在SYFPEITHI中評(píng)分為22,處于第四,在SYFPEITHI、ProPred-1中評(píng)分為28.516,處于第四。綜合以上3個(gè)軟件的結(jié)果,選取3個(gè)表位肽進(jìn)入下一步實(shí)驗(yàn):SMYLPGAEV、TLMKKDKYT和ALGSMGSVV。

CTL表位需經(jīng)抗原提呈細(xì)胞處理加工與MHC Ⅰ類分子結(jié)合,進(jìn)而呈遞給T細(xì)胞受體,才可引起T細(xì)胞的免疫應(yīng)答。較強(qiáng)的結(jié)合力是較高免疫原性的必要條件[12]。T2細(xì)胞缺失MHC Ⅱ基因大部分區(qū)域,細(xì)胞表面僅表達(dá)不含內(nèi)源性抗原的MHC Ⅰ類分子,使得其合成的大部分MHC Ⅰ類分子在細(xì)胞表面不穩(wěn)定,當(dāng)溫度為37 ℃左右時(shí)極其不穩(wěn)定,但在特定條件下可以在細(xì)胞表面暫時(shí)穩(wěn)定存在,如低溫或添加外源抗原肽、單克隆抗體等[13]?；谝陨嫌^點(diǎn),可知若外源抗原肽免疫原性較強(qiáng),與MHC Ⅰ類分子有較強(qiáng)結(jié)合力,可使細(xì)胞表面的MHC Ⅰ類分子表達(dá)量暫時(shí)升高。通過(guò)檢測(cè)MHC Ⅰ類分子在T2細(xì)胞表面表達(dá)量的多少,可以說(shuō)明該外源性抗原肽的免疫原性強(qiáng)弱。本研究在經(jīng)表位肽沖擊誘導(dǎo)的T2細(xì)胞與HLA-A2的結(jié)合實(shí)驗(yàn)中,陽(yáng)性肽與MHC Ⅰ類分子之間親和力高,而陰性肽與MHC Ⅰ類分子之間親和力低,與文獻(xiàn)報(bào)道一致[14,15];在3條預(yù)測(cè)的SOX2表位肽中,SMYLPGAEV與MHC Ⅰ類分子結(jié)合力隨著肽濃度的升高而升高,在肽濃度為50 μmol/L、100 μmol/L時(shí)%MFI increase數(shù)值分別為244.75±30.53和369.03±66.75,顯著高于陽(yáng)性肽數(shù)值160.48±46.31和183.93±24.15(P<0.05),說(shuō)明該表位肽有較強(qiáng)免疫原性。

健康人PBMCs通過(guò)在體外經(jīng)抗原沖擊可獲得抗原特異的T細(xì)胞。輔助T淋巴細(xì)胞1(Th1)能合成IFN-γ、IL-2等細(xì)胞因子,以促進(jìn)CTL、NK細(xì)胞和巨噬細(xì)胞的活化和增殖,介導(dǎo)細(xì)胞毒效應(yīng)的發(fā)生。細(xì)胞毒性T細(xì)胞(Tc)具有對(duì)靶細(xì)胞的直接破壞能力。因此,T細(xì)胞的免疫效應(yīng)可通過(guò)體外細(xì)胞因子分析、細(xì)胞毒性分析等來(lái)驗(yàn)證。本實(shí)驗(yàn)中表位肽誘導(dǎo)出的CTLs的殺傷能力主要通過(guò)LDH釋放實(shí)驗(yàn)和ELISPOT實(shí)驗(yàn)評(píng)價(jià)。在本研究的hIFN-γ ELISPOT實(shí)驗(yàn)中,SMYLPGAEV組顯著多于TLMKKDKYT組、ALGSMGSVV組,后兩組無(wú)明顯差異。直接殺傷實(shí)驗(yàn)(LDH釋放實(shí)驗(yàn))結(jié)果顯示,表位肽SMYLPGAEV誘導(dǎo)的效應(yīng)細(xì)胞對(duì)靶細(xì)胞的殺傷率在效靶比為5 ∶1,10 ∶1,20 ∶1時(shí)分別為22.90±5.00,39.50±8.29,48.44±1.74,表位肽TLMKKDKYT誘導(dǎo)的效應(yīng)細(xì)胞對(duì)靶細(xì)胞的殺傷率在效靶比為10 ∶1,20 ∶1時(shí)分別為32.10±7.43,57.18±4.16,陰性肽誘導(dǎo)的效應(yīng)細(xì)胞對(duì)靶細(xì)胞的殺傷率在效靶比為5 ∶1,10 ∶1,20 ∶1時(shí)分別為7.76±0.70,8.29±1.17,17.60±8.56,表位肽SMYLPGAEV組和TLMKKDKYT組均高于陰性肽組,且差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

綜合本實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果分析可得以下結(jié)論:表位肽SMYLPGAEV具有更優(yōu)的免疫學(xué)效應(yīng),可用于肺癌疫苗的制備。本研究結(jié)果為肺癌疫苗的研發(fā)奠定了基礎(chǔ)。