冬凌草有效成分的提取方法及含量測定方法研究進(jìn)展

張婉晴，涂祖月

冬凌草有效成分的提取方法及含量測定方法研究進(jìn)展

張婉晴，涂祖月

（信陽職業(yè)技術(shù)學(xué)院， 河南 信陽 464000）

冬凌草是一種具有多種生物活性的藥材，常用的提取方法有溶劑浸提法，水蒸氣蒸餾法，超臨界CO2萃取法。目前，人們采用紫外分光光度法、高效液相色譜法等技術(shù)，對冬凌草甲素、冬凌草乙素、迷迭香酸、熊果酸、齊墩果酸和貓眼草黃素等有效成分的含量進(jìn)行測定。對近年來冬凌草的提取方法及有效成分的含量測定進(jìn)行了綜述和研究，為更好地開發(fā)和利用冬凌草提供理論依據(jù)。

冬凌草； 提取方法； 含量測定方法； 研究進(jìn)展

冬凌草，為唇形科香茶菜屬植物碎米椏(Hemsl.)Hara的干燥地上部分?，F(xiàn)代研究表明：冬凌草中含有萜類、甾體、生物堿類、黃酮、揮發(fā)油、內(nèi)酯、皂苷等化學(xué)成分；藥理實(shí)驗(yàn)表明冬凌草具有清熱、解毒、消炎等作用，如冬凌草醇劑對金葡菌、甲型溶鏈菌有明顯的抑制作用以及抗炎、免疫增強(qiáng)作用；冬凌草對治療咽喉腫痛、扁桃體炎、蛇蟲咬傷等具有很好的作用，此外具有較好的抗癌、抗腫瘤活性，對食管癌、賁門癌有很好的療效，且毒性較低[1]。冬凌草作為一種活性良好、毒性低的藥物受到眾多學(xué)者關(guān)注，人們采用各種提取技術(shù)及含量測定方法不斷對其進(jìn)行深入研究。為更好發(fā)揮冬凌草作用，現(xiàn)就近年來一些研究方法進(jìn)行總結(jié)。

1 冬凌草的化學(xué)成分

研究發(fā)現(xiàn)[1]，冬凌草藥材中化學(xué)成分主要有：冬凌草甲素、冬凌草乙素、盧氏冬凌草甲素、貴州冬凌草素等二萜類，冬凌草堿、7-羥基-4-(1H)-喹啉酮、黃嘌呤等生物堿類， 5-羥基-3'、4'、7-三甲氧基黃酮，苜蓿素，胡麻素等黃酮類，α-香樹脂醇、熊果酸、齊墩果酸等甾體類，棕櫚酸甲酯、棕櫚酸乙酯、β-蒎烯等揮發(fā)油類，香草酸、阿魏酸等有機(jī)酸類，以及葡萄糖、α-D-呋喃果糖等糖類。另外冬凌草中含有17中氨基酸，人體必需的8種氨基酸除了色氨酸外，其余都含有并且含量較高。

2 冬凌草的提取方法

2.1 傳統(tǒng)提取方法

所用溶劑包括水和有機(jī)溶劑，如不同體積分?jǐn)?shù)的乙醇，體積分?jǐn)?shù)為70%的丙酮，體積分?jǐn)?shù)為95%的甲醇。目前對冬凌草的浸提方法有浸漬法、滲漉法、回流法、水蒸氣蒸餾法等。

2.1.1 浸漬法

宋發(fā)軍[2]等用體積分?jǐn)?shù)為95%的乙醇冷浸提取冬凌草粉末，濃縮后將乙醇提取物溶于水，然后依次用石油醚、乙酸乙酯、正丁醇萃取，得粗提物。

荊綺[3]等采用HPLC法測定冬凌草甲素的含量，考察不同濃度乙醇對冬凌草甲素提取率的影響，在此基礎(chǔ)上選取乙醇用量、冷浸時(shí)間、提取次數(shù)和藥材規(guī)格4因素，得最佳提取工藝：冬凌草粉碎成細(xì)粉（全部過5號篩，能通過6號篩的粉末占98%），加入15倍量體積分?jǐn)?shù)為95%的乙醇，冷浸提取2次，每次4 d。

2.1.2 滲漉法

俞莉[4]等以冬凌草甲素的含量為考察指標(biāo)，采用正交試實(shí)驗(yàn)法研究冬凌草的滲漉提取工藝；結(jié)果優(yōu)選出滲漉提取的最佳工藝為：采用體積分?jǐn)?shù)為95%的乙醇浸泡12 h后，以每千克藥材每分鐘3 mL流速滲漉，收集10倍量滲漉液。

2.1.3 水蒸氣蒸餾法

唐倩囡[5]等取粉碎好的冬凌草，用正己烷萃取2次后，濃縮萃取液并把濃縮后的油狀物置于揮發(fā)油提取器中，加水，加熱提取12 h得到淡黃色的油狀液體，經(jīng)無水硫酸鈉干燥，過濾，得揮發(fā)油待測品。

2.1.4 回流提取法

盧海英[6]等用體積分?jǐn)?shù)85%乙醇回流提取，濃縮并靜置過夜，得上清液。下層沉淀再用體積分?jǐn)?shù)50%乙醇熱提，冷卻靜置抽濾得上清液，合并上清液并濃縮，再經(jīng)石油醚、氯仿、乙酸乙酯和正丁醇依次萃取，得冬凌草各萃取部分粗提取物。

楊元風(fēng)[7]等用體積分?jǐn)?shù)95%甲醇回流提取冬凌草粉碎物，濃縮后加甲醇至含醇體積分?jǐn)?shù)90%，用適量活性炭回流脫色，過濾得提取液，最后濃縮得粗提物。

劉建群[8]等取粉碎后的冬凌草，用8倍體積分?jǐn)?shù)95%乙醇在室溫下浸泡12 h，回流提取3次每次1.5 h，合并提取液，濃縮得總浸膏?？偨嘤盟稚⒊驶鞈乙海来斡檬兔?、乙酸乙酯、正丁醇萃取，濃縮得各萃取部分。

2.2 現(xiàn)代提取方法

新方法新技術(shù)不斷涌現(xiàn)并被應(yīng)用于冬凌草有效成分的提取之中，如超臨界流體萃取技術(shù)、超聲提取技術(shù)、組織破碎提取、頂空固相微萃取等。

2.2.1 超臨界流體萃取法

將臨界狀態(tài)下的流體如CO2，以一定溫度下通入提取器中，可溶組分溶解在超臨界流體中，并且隨同該流體一起經(jīng)過減壓閥降壓后進(jìn)入分離器，溶質(zhì)從氣體中分離出來。

陳瑩[9]等以冬凌草甲素的提取率為指標(biāo)，通過正交試驗(yàn)考察冬凌草甲素的超臨界CO2萃取工藝，結(jié)果：壓力35 MPa，溫度328.15 K，夾帶劑流量4 mL·min-1, CO2流量25 g·min-1，以HPLC法對萃取物定量分析，得冬凌草甲素提取率為0.402%。

張彥燾[10]等將 14.0 kg 干燥冬凌草粉碎，過 20 目（830 μm）篩，以料液比 1∶1.5 的配比加入夾帶劑（90%乙醇水）21.0 L，充分混勻。然后采用SPE24×2-(32) 超臨界萃取裝置進(jìn)行 CO2萃取，提取條件：壓力 30 MPa，提取溫度 50 ℃，提取時(shí)間為3 h。 50 ℃下減壓濃縮提取液，得到粗浸膏445.16 g。從冬凌草中分離得到1個(gè)黃烷類化合物，命名為冬凌烷 A。

2.2.2 超聲波萃取

是在水浸提的同時(shí)加超聲波輔助法，不僅能縮短提取時(shí)間，提高效率，同時(shí)避免高溫對有效成分的影響。

李菲[11]等采用HPLC 法測定冬凌草甲素含量，Box-Be-hnken 設(shè)計(jì)考察超聲時(shí)間、超聲溫度和液料比對提取率的影響，硅膠柱層析結(jié)合重結(jié)晶法進(jìn)行純化。結(jié)果最佳條件為超聲時(shí)間30 min，超聲溫度 50 ℃，液料比25∶1，提取率為4.79 mg·g-1。石油醚-丙酮梯度洗脫結(jié)合重結(jié)晶法可得到體積分?jǐn)?shù)99.17% 的冬凌草甲素。

汪倫記[12]等對超聲輔助乙醇回流提取冬凌草抑菌活性成分的工藝進(jìn)行研究，以金黃色葡萄球菌為供試菌，考察了乙醇體積分?jǐn)?shù)、超聲功率、提取溫度、料液比和提取時(shí)間對冬凌草抑菌活性物質(zhì)提取的影響，得最優(yōu)提取工藝條件為：乙醇體積分?jǐn)?shù)為95%、超聲功率200 W、提取溫度62 ℃、提取時(shí)間44 min、料液比1∶25 g·mL-1。

2.2.3 水蒸氣蒸餾法

組織破碎提取法是通過閃式提取器來實(shí)現(xiàn)的，適用于植物軟、硬材料組織?；驹硎窃谑覝睾瓦m當(dāng)溶劑存在下，將物料在數(shù)秒鐘內(nèi)破碎至細(xì)微顆粒，通過高速攪拌、振動、負(fù)壓滲濾 3 種因素的最佳結(jié)合，使有效成分迅速達(dá)到藥材組織內(nèi)外平衡，通過濾過達(dá)到提取目的。在鞣質(zhì)、黃酮類、皂苷類等成分的提取等方面均取得了較大進(jìn)展[13]。

馮衛(wèi)生[14]等用體積分?jǐn)?shù)70%丙酮水溶液組織破碎提取冬凌草地上部分，提取液用相當(dāng)于提取物10%的活性炭脫色，濾液濃縮后，依次用石油醚、乙酸乙酯、正丁醇萃取，得各部位萃取物。

2.2.4 頂空固相微萃取（HS-SPME）法

頂空固相微萃取是固相微萃取的一種，可用于揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)的提取，常與高效液相色譜、氣相色譜和氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用多種分析技術(shù)聯(lián)用。

李高申[15]采用頂空固相微萃法提取冬凌草中的揮發(fā)性成分，即萃取樣品溫度85 ℃，時(shí)間30 min，在250 ℃下脫附1 min；然后用氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法測成分及計(jì)算各成分相對含量。

3 含量測定方法

已報(bào)道的冬凌草有效成分含量測定方法較單一?？赦昜16]等采用紫外分光光度法測定冬凌草提取物中總二萜的含量，即238 nm處測定吸光度；還有學(xué)者用高效液相色譜法，對冬凌草甲素、冬凌草乙素、迷迭香酸、熊果酸、齊墩果酸、貓眼草黃素等6種有效成分的含量測定，具體方法如下。

鄒盛勤[17]等建立反高效液相色譜法（RP-HPLC）測定冬凌草中烏索酸和齊墩果酸的含量，方法是色譜柱為C18RP柱（250 mm×46 mm，5 μm），流動相為甲醇-水（87∶13）；流速0.8 mL·min-1，光電二極管陣列檢測器，檢測波長210 nm，柱溫25 ℃。

張靜[18]等采用Waters UPLC色譜系統(tǒng)，ACQUITY BEH Shield PR18色譜柱（2.1 mm×100 mm，1.7 μm），流動相為體積分?jǐn)?shù)0.1%甲酸甲醇溶液（A）-體積分?jǐn)?shù)0.1%甲酸甲醇溶液（B），梯度洗脫（0~9 min，體積分?jǐn)?shù)70%A→體積分?jǐn)?shù)57%A；9~10 min，體積分?jǐn)?shù)57%A→體積分?jǐn)?shù)48%A；10~11 min，體積分?jǐn)?shù)48%A→體積分?jǐn)?shù)48%A；11~14 min，體積分?jǐn)?shù)48%A→體積分?jǐn)?shù)14%A；14~22 min，體積分?jǐn)?shù)14%A→體積分?jǐn)?shù)14%A），流速0.2 mL·min-1；檢測波長為250 nm和210 nm；柱溫23 ℃?？稍?2 min內(nèi)完成冬凌草甲素、冬凌草乙素、迷迭香酸、齊墩果酸和熊果酸，5個(gè)成分的色譜分析，且各成分色譜峰之間具有良好的分離度。

趙新燕[19]等對冬凌草采用體積分?jǐn)?shù)95%乙醇熱浸取法保溫回流30 min，過濾，提取液經(jīng)濃縮得到粗品，粗提浸膏經(jīng)反相色譜分離純化，分離條件為：色譜柱（ID63×700 mm, Diamonsil C18, 粒徑25~40 μm），流動相：甲醇-水（55∶45），流速：35mL∶min-1, 檢測波長239 nm，進(jìn)樣體積5 mL，將搜集到的洗脫液蒸發(fā)濃縮干燥，得冬凌草甲素粉末。120 g冬凌草可提取370 mg冬凌草甲素，可供工業(yè)化生產(chǎn)工藝參考。

袁興利[20]等建立同時(shí)測定冬凌草藥材中迷迭香酸、冬凌草甲素和貓眼草黃素含量的高效液相色譜方法。采用 Ultimate C18色譜柱( 4.6 mm×250 mm，5 μm) ; 流動相甲醇體積分?jǐn)?shù)0.1%甲酸水溶液，梯度洗脫；流速 1.0 mL·min-1；柱溫30 ℃；檢測波長338、242 nm。

4 結(jié)束語

冬凌草具有較強(qiáng)生物活性且有效成分種類繁多，人們對冬凌草提取方法和含量測定的研究還在不斷深入。在對冬凌草化學(xué)成分分析和藥理作用等研究中，多采用傳統(tǒng)的浸漬法提取，該法雖然耗時(shí)長，提取不完全，但浸膏提取率大。組織破碎提取法由于破碎后過濾難，提取容器受限等原因，多用于實(shí)驗(yàn)室之中[16]；超臨界CO2萃取法、頂空固相微萃取法等新技術(shù)能加速中藥材有效成分的溶出，同時(shí)操作簡便，但萃取成分主要為揮發(fā)性化合物，較單一。冬凌草的含量測定方法較少，文獻(xiàn)報(bào)道有紫外分光光度法和高效液相色譜法，且主要測定冬凌草甲素、冬凌草乙素、迷迭香酸、熊果酸、齊墩果酸、貓眼草黃素等6種有效成分上，其他成分的含量測定還未見報(bào)道，仍需進(jìn)一步的研究。

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Research Progress of Extraction Method and Assay Method of Effective Components From()

,

（Xingyang Vocational and Technical College, Xingyang Henan 464000, China）

(Hemsl.)is a Chinese herbal medicine with wide biological activities.Its extraction methods include alcohol extraction method, ultrasound extraction method, steam distillation, supercritical CO2extraction. So far, new technologies (such as UV spectrophotometry, high-performance liquid chromatography and so on) are always used to determine effective constituents including oridonin, ponicidin, rosmarinic acid, olesnolic, ursolic acid. In this paper,the extraction methods and assay methods of effective components from(Hemsl.)in recent years wereintroduced, in order to provide theoretical foundation for better development and use of the plant.

;; Assay method; Research progress

2020-08-20

張婉晴（1986-），女，河南省駐馬店市人，助教，碩士學(xué)位， 2013年畢業(yè)于河南中醫(yī)學(xué)院中藥學(xué)專業(yè)，研究方向：中藥規(guī)范化種植及質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究。

O657

A

1004-0935（2020）09-1182-04