枇杷果肉總多酚提取及體外抗氧化活性研究

湯承浩

枇杷果肉總多酚提取及體外抗氧化活性研究

湯承浩1,2

（1. 凱里學(xué)院大健康學(xué)院, 貴州 凱里 556011; 2. 貴州省普通高等學(xué)校黔東南民族藥綜合利用工程技術(shù)研究中心，貴州 凱里 556011）

目的：以枇杷果肉為研究對(duì)象，輔以超聲波法提取總多酚。方法：通過正交試驗(yàn)確定最優(yōu)提取工藝條件：提取溫度為60 ℃，料液比1∶35（g·mL-1），乙醇體積分?jǐn)?shù)60%，超聲提取時(shí)間18 min，總多酚提取率達(dá)0.94%。通過1, 1-二苯基-2-苦肼基（DPPH·）清除率的測(cè)定對(duì)枇杷果肉總多酚進(jìn)行體外抗氧化活性評(píng)價(jià)。結(jié)果：枇杷果肉總多酚DPPH·清除率明顯高于維生素C（Vc），且枇杷果肉總多酚 DPPH·半數(shù)抑制濃度（IC50=7.04 μg·mL-1）優(yōu)于Vc（IC50=7.70 μg·mL-1）。結(jié)論：枇杷果肉總多酚是一種天然的抗氧化活性劑。

枇杷果肉； 總多酚； 提取工藝； 抗氧化活性

植物多酚的提取方法較多，主要包括超臨界CO2萃取法[1]、超聲波輔助提取[2]、超聲協(xié)同酶法提取[3]、酶法輔助提取[4]、微波協(xié)同輔助提取法[5]、回流提取法[6]等，且由于超聲波產(chǎn)生的機(jī)械振動(dòng)能夠快速、高效的破壞組織細(xì)胞結(jié)構(gòu)，故而有利于加速多酚的提取，同時(shí)也可避免使用高溫對(duì)多酚的毀壞[7]，因此，超聲波提取法被廣泛應(yīng)用于植物多酚的提取。

近來，大多數(shù)研究人員主要對(duì)枇杷葉中熊果酸、齊墩果酸揮發(fā)油和β-葡萄糖苷酶[8-9]以及枇杷核中的總黃酮和總多酚[10-11]等部分進(jìn)行提取研究，對(duì)枇杷果肉總多酚的提取工藝及其體外抗氧化活性研究目前少有報(bào)道。因此，本文采用L9（33）正交試驗(yàn)對(duì)枇杷果肉總多酚的超聲輔助提取工藝進(jìn)行優(yōu)化，并采用DPPH·清除率來評(píng)價(jià)其抗氧化活性，為枇杷果肉多酚類化合物的綜合開發(fā)利用提供重要依據(jù)。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 材料與儀器

枇杷采自麻江縣下司鎮(zhèn)，經(jīng)植物學(xué)博士鑒定為定為薔薇科植物枇杷(Thunb.) Lindl.的成熟果實(shí)。枇杷果肉樣品于50oC 鼓風(fēng)干燥箱中干燥，再用小型植物粉碎機(jī)粉碎并過100目（150μm）篩，待用。DPPH、三氯乙酸、沒食子酸和Folin﹠ciocalteu’s酚試劑均由上海阿拉丁生化有限公司提供；紫外-可見分光光度計(jì)（日本島津UV-2550型）；粉碎機(jī)（科偉永興儀器有限公司FW200型）；水浴振蕩器（予華儀器有限公司SHA-C型）；超聲波清洗器（上?？茖?dǎo)儀器有限公司SK2510LHC型）；電子天平（奧豪斯儀器有限公司AR224CN型）。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 枇杷果肉總多酚的提取

取新鮮枇杷果肉洗凈切片，50oC干燥。稱取1 g粉碎過100目（150μm）篩的枇杷果肉，加入20 mL 體積分?jǐn)?shù)為70%的乙醇溶液，270 W超聲條件下60oC水浴提取14 min，離心，取上清液用蒸餾水定容至50 mL，取0.7 mL于50 mL量瓶中加12 mL蒸餾水，搖勻，加1 mL Folin-Ciocalteu（FC）試劑和4 mL 體積分?jǐn)?shù)為10%的Na2CO3溶液，蒸餾水定容，避光2 h，測(cè)定總多酚提取率。通過改變?nèi)軇舛取⒘弦罕群吞崛r(shí)間等因素來探討溶劑回流法提取生姜多酚的工藝條件。

式中：—多酚質(zhì)量濃度。

1.2.2 枇杷果肉總多酚的測(cè)定

精確稱量0.010 0 g沒食子定容至100 mL。分別取該溶液0、0. 5、1.0、1. 5、2.0、2.5 mL于6個(gè)25 mL容量瓶中，加6.0 mL超純水，搖勻，再加入0.5 mL FC試劑，加入2.0 mL 體積分?jǐn)?shù)為10％的Na2C03溶液，用超純水定容。避光2 h后于760 nm波長(zhǎng)下測(cè)定吸光度，平行此操作3次后取平均值。以沒食子酸濃度（）為橫坐標(biāo)，吸光度（）為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。線性回歸得標(biāo)準(zhǔn)曲線方程：

= 72.5+ 0.111 2，相關(guān)系數(shù)2 = 0.999 8。

在沒食子酸質(zhì)量濃度為2～10 μg·mL-1范圍內(nèi)該方法線性關(guān)系良好。

1.2.3 單因素試驗(yàn)設(shè)計(jì)

考察乙醇體積分?jǐn)?shù)、提取時(shí)間和液料比等3個(gè)單因素的影響。

1）乙醇體積分?jǐn)?shù)分別采用30%、40%、50%、60%、70%和80%的條件下進(jìn)行比較，超聲時(shí)間14 min，料液比1∶20（g∶mL）；

2）超聲時(shí)間采用6、10、14、18、22和26 min的條件下進(jìn)行比較，乙醇體積分?jǐn)?shù)60%；

3）料液比采用1∶15、1∶20、1∶25、1∶30、1∶35、1∶40（g∶mL）的條件下進(jìn)行比較，超聲時(shí)間為18 min，乙醇體積分?jǐn)?shù)為60%，從而確定料液比的影響。

1.2.4 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)

根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，選擇乙醇體積分?jǐn)?shù)、提取時(shí)間和料液比進(jìn)行3因素3水平做L9（33）正交試驗(yàn)優(yōu)化提取條件，因素水平設(shè)計(jì)見表１。

表1 正交試驗(yàn)因素與水平

1.2.5 清除DPPH·能力試驗(yàn)

將超聲輔助提取的枇杷果肉總多酚溶液分別配制成0.001 8、0.003 6、0.005 4、0.007 2、0.009 0 mg·mL-15種不同質(zhì)量濃度。向2.0 mL DPPH乙醇溶液（0.08 mg·mL-1）中分別加2.0 mL不同質(zhì)量濃度的枇杷果肉總多酚溶液，混合反應(yīng)30 min，并用紫外-可見分光光度計(jì)（517 nm）測(cè)其吸光度，記為Ai；同時(shí)測(cè)2.0 mL DPPH乙醇溶液（0.08 mg·mL-1）與2.0無水乙醇混合液的吸光度，記為Ao。以維生素Ｃ為陽(yáng)性對(duì)照，枇杷果肉總多酚對(duì)DPPH·清除率計(jì)算公式為：

2 結(jié)果與分析

2.1 乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)枇杷果肉多酚提取影響

由圖1分析可知，在乙醇體積分?jǐn)?shù)為30%~60%范圍內(nèi)，隨乙醇體積分?jǐn)?shù)的增大總多酚提取率增大，當(dāng)乙醇體積分?jǐn)?shù)達(dá)到60%時(shí)，總多酚得率最大（9.5375 mg·g-1），之后隨乙醇體積分?jǐn)?shù)增大，提取率反而呈下降趨勢(shì)。因此，選取乙醇體積分?jǐn)?shù)50%、60％、70%３個(gè)水平作為正交試驗(yàn)。

圖1 乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)枇杷果肉總多酚提取效果的影響

2.2 超聲時(shí)間對(duì)枇杷果肉多酚提取效果的影響

由圖2可知，隨著超聲時(shí)間的加長(zhǎng)，枇杷果肉總多酚提取率逐漸升高，當(dāng)超聲時(shí)間為18 min時(shí)，多酚得率為9.6950 mg·g-1，達(dá)最大值；之后超聲時(shí)間延長(zhǎng)，總多酚提取率下降。因此，選取超聲時(shí)間14、18、22 min３個(gè)水平繼續(xù)正交試驗(yàn)。

圖2 超聲時(shí)間對(duì)枇杷果肉總多酚提取效果的影響

2.3 料液比對(duì)枇杷果肉多酚提取效果的影響

由圖3可知，溶劑用量的不斷增加，枇杷果肉中總多酚提取率提高，當(dāng)料液比在1∶35（g·mL-1）時(shí)多酚得率最大，為9.992 5 mg·g-1，但隨著溶劑用量的進(jìn)一步增加，枇杷果肉總多酚提取率呈下降趨勢(shì)。 因此，選取料液比1∶30、1∶35和1∶40（g·mL-1）３個(gè)水平進(jìn)行正交試驗(yàn)。

圖3 料液比對(duì)枇杷果肉總多酚提取效果的影響

2.4 枇杷果肉總多酚最優(yōu)提取工藝的確定

采用表2的L9（33）因素水平進(jìn)行正交試驗(yàn)，以枇杷果肉總多酚提取率為指標(biāo)。從表2分析可知，枇杷果肉總多酚提取率的影響因素由大到小為料液比＞超聲時(shí)間＞乙醇體積分?jǐn)?shù)。枇杷果肉總多酚最優(yōu)提取因素水平組合為A2B2C2，即料液比1∶35（g·mL-1）、超聲時(shí)間18 min、乙醇體積分?jǐn)?shù)60%。

表2 對(duì)枇杷果肉總多酚提取率的影響因素正交試驗(yàn)結(jié)果

2.5 驗(yàn)證性實(shí)驗(yàn)

在最佳提取工藝條件下（溫度60oC、料液比1∶35（g·mL-1）、超聲時(shí)間18 min、乙醇體積分?jǐn)?shù)60%），用相同方法提取５個(gè)樣品，測(cè)定多酚提取率分別為0.941 2%、0.942 4%、0.943 1%、0.945 3%和0.947 0%，平均提取率為0.943 8%，RSD值為0.25%，表明該最佳提取工藝穩(wěn)定可靠。

2.6 枇杷果肉總多酚清除DPPH·能力評(píng)價(jià)

從圖4可以看出，枇杷果肉總多酚質(zhì)量濃度的提高，清除DPPH·的能力逐步增強(qiáng)，即清除率與總多酚的質(zhì)量濃度間存在較明顯的量效關(guān)系。當(dāng)總多酚質(zhì)量濃度小于0.009 mg·mL-1時(shí)，枇杷果肉總多酚的DPPH·的清除率優(yōu)于對(duì)照品Vc。由插值法可得其清除DPPH·自由基的 IC50為7.04 μg·mL-1，稍大于Vc的IC50值7.70μg·mL-1，表明枇杷果肉總多酚可作為天然抗氧化劑使用。

圖4 枇杷果肉總多酚對(duì)DPPH·清除作用

3 結(jié)論與討論

本試驗(yàn)以枇杷果肉為原料，采用超聲輔助提取法，通過單因素試驗(yàn)及正交試驗(yàn)討論了枇杷果肉總多酚提取工藝條件，并確定最佳提取工藝為：提取溫度為60oC，料液比1∶35（g·mL-1），乙醇體積分?jǐn)?shù)60%，超聲提取時(shí)間18 min，枇杷果肉總多酚提取率達(dá)0.943 7%。在該實(shí)驗(yàn)條件下進(jìn)行驗(yàn)證性試驗(yàn)，重復(fù)5次，平均提取率為0.943 8%，RSD值為0.25%，表明該工藝具有提取率高，且穩(wěn)定可靠等優(yōu)點(diǎn)?？寡趸瘜?shí)驗(yàn)表明，枇杷果肉總多酚具有一定的清除DPPH·自由基的能力，且IC50值大于Vc的IC50值，表現(xiàn)出了較好的抗氧化活性。

在一定范圍內(nèi)，隨著乙醇體積分?jǐn)?shù)的增大，多酚的溶出量不斷增加，這可能是醇溶性物質(zhì)的溶出量隨著乙醇體積分?jǐn)?shù)的逐漸增大而增加，提取率呈增大趨勢(shì)；但乙醇體積分?jǐn)?shù)過大亦可導(dǎo)致枇杷果肉中的某些脂溶性物質(zhì)溶出量不斷增大，這些物質(zhì)可與多酚類物質(zhì)形成競(jìng)爭(zhēng)關(guān)系，影響枇杷果肉多酚類物質(zhì)的溶出。當(dāng)超聲提取時(shí)間較短時(shí)，總多酚提取量隨超聲提取時(shí)間增加而增大，但是當(dāng)超聲提取時(shí)間超過18 min時(shí)，枇杷果肉總多酚提取量反而下降，這可能是超聲時(shí)間過長(zhǎng)后，其具有的較強(qiáng)機(jī)械效應(yīng)與熱效應(yīng)，使多酚類物質(zhì)發(fā)生變質(zhì)。

本研究結(jié)果表明，利用超聲輔助方法提取枇杷果肉多酚類化合物具有提取率高、重現(xiàn)性好、多酚類物質(zhì)結(jié)構(gòu)穩(wěn)定等優(yōu)點(diǎn)，該法所得多酚類化合物具有較強(qiáng)的抗氧化生物活性，為枇杷果肉的綜合開發(fā)利用和尋找高效的天然抗氧化劑提供科學(xué)的依據(jù)。

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Extraction of Total Polyphenols Fromand Its Antioxidant Activity in Vitro

1,2

（1. School of Life and Health Science, Kaili University, Kaili Guizhou 556011, China; 2. Qiandongnan Engineering and Technology Research Center for Comprehensive Utilization of National Medicine,Kaili Guizhou 556011, China）

Objective: To extract total polyphenols fromby ultrasonic method. Methods: The optimum extraction conditions were determined by orthogonal test: extraction temperature 60 ℃, solid-liquid ratio 1∶35 (g·mL-1), ethanol volume fraction 60%, ultrasonic extraction time 18 min. Under above conditions, the extraction rate of total polyphenols was 0.94%. The antioxidant activity of total polyphenols fromwas evaluated by the determination of DPPH· scavenging rate. Results: DPPH· scavenging rate of total polyphenols inwas significantly higher than that of vitamin C (VC), and DPPH· 50 (IC50= 7.04 μg·mL-1) was better than VC(IC50 = 7.70 μg·mL-1). Conclusion: The total polyphenols inis a natural antioxidant.

; Total polyphenols；Ultrasonic extraction；Antioxidant activity

凱里學(xué)院2015年度科技合作協(xié)議項(xiàng)目（黔科合HL字[2015]7745號(hào)）資助。

2020-08-10

湯承浩（1986-），男，江蘇省連云港市人，講師，碩士研究生，2014年畢業(yè)于貴州大學(xué)農(nóng)藥學(xué)專業(yè)，研究方向：藥物合成及活性研究。

R284.1

A

1004-0935（2020）09-1055-04