生物鐘核受體RORα 和REV-ERBα在血管病理生理中的作用

蘇潔，成扶雨，卜軍

（上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬仁濟(jì)醫(yī)院心血管內(nèi)科，上海 200127）

核受體（nuclear receptors，NRs）是一種配體調(diào)控的轉(zhuǎn)錄因子，多數(shù)NRs 在配體激素誘導(dǎo)后，可與核受體輔助調(diào)節(jié)因子結(jié)合，從而調(diào)控下游基因的表達(dá)。NRs 參與調(diào)節(jié)能量代謝，包括脂質(zhì)的利用與儲存、膽固醇的合成與分解、胰島素信號和葡萄糖代謝信號通路等。另外，NRs 在調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)及晝夜節(jié)律等生物學(xué)功能方面發(fā)揮著重要作用。視黃酸受體相關(guān)的孤兒核受體（retinoic acid-related orphan receptors，RORs）和REV-ERBs（reverse viral erythroblastosis oncogene product）是2 種特殊的核受體亞群，參與調(diào)節(jié)晝夜節(jié)律等多種生理過程。得益于二者的脂溶性，RORs 和REV-ERBs 能夠直接進(jìn)入胞核參與下游基因的調(diào)控。有研究顯示，在RORs 和REV-ERBs 參與調(diào)控的不同生理過程中[1]，其對血管穩(wěn)態(tài)的調(diào)節(jié)以及對心血管系統(tǒng)的作用是多方面的，本文將通過二者在維持血管穩(wěn)態(tài)與調(diào)節(jié)血管病理重構(gòu)方面的貢獻(xiàn)進(jìn)行綜述，進(jìn)一步歸納生物鐘核受體RORs 和REV-ERBs 在血管病理生理過程中的作用。

1 RORα 和REV-ERBα 的結(jié)構(gòu)與功能

NRs 作為重要的配體激活因子，可與其他蛋白質(zhì)協(xié)同作用，調(diào)節(jié)對機(jī)體發(fā)育、代謝平衡有重要作用的基因表達(dá)。當(dāng)配體與NRs 的配體結(jié)合域結(jié)合后，NRs 的構(gòu)象發(fā)生改變，從而募集輔因子蛋白，以配體依賴的方式調(diào)節(jié)靶基因轉(zhuǎn)錄的水平。大多數(shù)NRs以二聚體的形式與DNA 結(jié)合，包括同型二聚體（如類固醇激素）和異型二聚體[如類視黃醇X 受體（retinoid X receptors，RXRs）][2-3]；少量NRs 可作為單體與DNA 結(jié)合，被稱為孤兒核受體。

REV-ERBs 作為孤兒核受體家族的一員，之前由于尚未發(fā)現(xiàn)其配體，其參與調(diào)節(jié)重要生理功能的作用一直被忽視。直至紫質(zhì)/原血紅素（porphyrin/heme）被發(fā)現(xiàn)是REV-ERBα/β 的配體[4-5]，REVERBs 的作用才開始逐漸受到重視。另一個孤兒核受體亞群——RORs，也是十分重要的晝夜節(jié)律調(diào)節(jié)因子，它與REV-ERBs 具有相同的DNA 結(jié)合位點，并且常常與之在相同的組織中表達(dá)。它們的表達(dá)與機(jī)體免疫反應(yīng)和代謝過程密切相關(guān)，了解這些受體包括它們動態(tài)的相互作用以及它們在機(jī)體生理學(xué)中的作用可進(jìn)一步提高研究人員對NRs 家族的認(rèn)識。

1.1 RORs

RORs 由3 種亞型組成，分別為RORα、RORβ和RORγ，3 種亞型呈現(xiàn)出高度的序列相似性，僅在受體的氨基末端區(qū)域有一定變化[6]。RORα 廣泛存在于哺乳動物的各種組織中，如肝臟、骨骼肌、皮膚、肺、脂肪組織、腎臟、胸腺和大腦等[7]。人體中存在4種RORα 亞基（α1～α4），而小鼠體內(nèi)只存在2 種亞基（α1 和α4）[8]。RORβ 在體內(nèi)分布不及RORα 廣泛，其僅限于在中樞神經(jīng)系統(tǒng)表達(dá)，且小鼠體內(nèi)含有2 種亞基（β1 和β2），而其中只有β1 存在于人體[9]。RORγ 的2 種亞基γ1、γ2 均存在于人體和小鼠體內(nèi)，其分布較為廣泛。RORγ（主要是RORγt，即RORγ2）在胸腺中表達(dá)量最高，參與機(jī)體免疫反應(yīng)[10]，同時也表達(dá)在肝臟、骨骼肌、脂肪組織和腎臟?？傊@3 種RORs 亞型均表現(xiàn)出不同的組織表達(dá)模式，并參與特定靶基因調(diào)控的生理過程。

所有的RORs 都能識別特定的DNA 序列并以單體形式與之結(jié)合，這種特定的DNA 序列被稱為ROR 反應(yīng)元件（ROR response elements，ROREs）。當(dāng)與該元件結(jié)合時，ROR 蛋白會招募共激活因子，促進(jìn)靶基因的轉(zhuǎn)錄。在控制節(jié)律方面，ROR基因轉(zhuǎn)錄具有生物節(jié)律性，它可通過調(diào)控生物時鐘關(guān)鍵因子BMAL1、CLOCK 等對晝夜節(jié)律產(chǎn)生影響，在敲除Rorα和Rorβ后，小鼠機(jī)體代謝表現(xiàn)出明顯的晝夜節(jié)律紊亂[11]。

1.2 REV-ERBs

REV-ERBs 包含2 個亞單位REV-ERBα 和REVERBβ，顯示出與RORs 同等重要的結(jié)構(gòu)特異性[1]。REV-ERBs 多存在于脂肪組織、骨骼肌、大腦和肝臟等組織。然而，不同組織REV-ERBα 和REVERBβ 特異性表達(dá)水平不同。REV-ERBα 在分布部位廣泛高表達(dá)，而REV-ERBβ 只在特定的組織中高度表達(dá)，如REV-ERBβ 在大腦局部組織（松果腺和前額葉皮層）、甲狀腺、子宮和垂體等呈現(xiàn)出高水平表達(dá)的特征，在脂肪組織等表達(dá)量極低。與RORs基因的轉(zhuǎn)錄激活作用相比，REV-ERBs 是轉(zhuǎn)錄抑制因子，這是由于REV-ERBs 缺乏AF-2（activationfunction-2）區(qū)域，該區(qū)域是參與基因共激活結(jié)合過程的關(guān)鍵DNA 區(qū)域。因此，REV-ERBs 與RORs 結(jié)合在相同的RORE 的DNA 反應(yīng)元件上，但REVERBs 負(fù)責(zé)結(jié)合輔阻遏蛋白，如核受體輔阻遏蛋白（nuclear receptor corepressor，NCoR）。REV-ERBs可以作為單體結(jié)合到AGGTCA 序列，形成5' AT 富集延伸區(qū)域，這種功能為轉(zhuǎn)錄沉默過程。REV-ERBs也可以作為同型二聚體與RORE 直接結(jié)合，形成高度穩(wěn)定的同型二聚體，起著轉(zhuǎn)錄抑制子的作用。

2 晝夜節(jié)律與RORα 和REV-ERBα

2.1 晝夜節(jié)律

晝夜節(jié)律是指在一天內(nèi)基因表達(dá)、行為以及許多生理過程發(fā)生的周期性振蕩。生理節(jié)律的調(diào)節(jié)與行為、代謝活動、免疫反應(yīng)和許多其他生理功能的晝夜控制是相互聯(lián)系的。晝夜節(jié)律對生物體至關(guān)重要，它使機(jī)體能夠預(yù)測和優(yōu)化代謝調(diào)節(jié)、激素分泌和運動活動，以適應(yīng)環(huán)境每天的變化，如晝/夜和活動/休息周期、食物供應(yīng)時間等。哺乳動物的晝夜節(jié)律鐘位于下丘腦視交叉上核（suprachiasmatic nucleus，SCN），調(diào)控并維持晝夜交替與生理功能的同步性。在晝夜周期性振蕩過程中，SCN 的時鐘振蕩器通過整合明暗周期信號，同時同步外周組織的自主振蕩，驅(qū)使晝夜節(jié)律相關(guān)的激素水平和酶活性發(fā)生變化，從而調(diào)控多種代謝過程，實現(xiàn)包括脂質(zhì)和碳水化合物代謝、激素（胰島素、瘦素、皮質(zhì)醇）分泌等的晝夜節(jié)律性改變。當(dāng)晝夜節(jié)律紊亂時，多種生物鐘基因表達(dá)水平及代謝過程也會相繼發(fā)生混亂[12]。規(guī)律的工作周期及晝夜節(jié)律對于人體新陳代謝穩(wěn)態(tài)的維持至關(guān)重要，現(xiàn)代社會不健康的生活方式如倒班工作、倒時差、不規(guī)律的睡眠習(xí)慣或長期暴露于人造光下會對晝夜節(jié)律的平穩(wěn)運作產(chǎn)生不良影響。有研究表明[13-15]，晝夜節(jié)律紊亂可導(dǎo)致許多疾病的發(fā)生，包括睡眠和情緒障礙、糖尿病、肥胖、神經(jīng)精神疾病和癌癥。

2.2 RORα 和REV-ERBα 的節(jié)律性調(diào)控

核受體RORα 和REV-ERBα 的表達(dá)被認(rèn)為是受晝夜節(jié)律鐘調(diào)節(jié)的，同時，新近研究發(fā)現(xiàn)，RORα和REV-ERBα 的表達(dá)或功能異常還影響諸多病理過程，如腫瘤、心血管疾病[16]、免疫炎癥性疾病和代謝性疾病等，而這些疾病的發(fā)生發(fā)展與晝夜節(jié)律密切相關(guān)[17-18]。目前，研究者們已經(jīng)建立了由生物鐘驅(qū)動的NRs 表達(dá)、NRs 功能和晝夜節(jié)律之間的相互交叉聯(lián)系。生物鐘的周期性振蕩是通過調(diào)控幾種轉(zhuǎn)錄/翻譯反饋回路實現(xiàn)的（見圖1）。在該反饋回路中，RORα 與REV-ERBα 的核心功能最為關(guān)鍵，它們通過調(diào)控幾種生物鐘基因的轉(zhuǎn)錄，包括Bmal1和Clock等[19]，實現(xiàn)對下游 Period-2（Per2）、隱花色素-1（cryptochrome-1，Cry1）和隱花色素-2（cryptochrome-2，Cry2）等依賴Bmal1和Clock轉(zhuǎn)錄的基因的調(diào)控作用。而PER/CRY 異源二聚體濃度一旦達(dá)到臨界水平，PER/CRY 異源二聚體又可進(jìn)入細(xì)胞核，轉(zhuǎn)而抑制BMAL1/CLOCK 的活化和自身轉(zhuǎn)錄，并開始一個新的調(diào)節(jié)周期。這個反饋循環(huán)致使BMAL1/CLOCK和PER/CRY 的表達(dá)振蕩遵循晝夜節(jié)律模式。有研究表明，RORα 可同時接受BMAL1/CLOCK 和REVERBα 的雙重調(diào)控[20]。在大鼠肝臟的RORα 近端啟動子上，BMAL1/CLOCK 和REV-ERBα 可被分別被招募到E-box 和RORE[17]。E-box 元件中包含2 個突變位點，單獨E1 或E2 的突變可降低RORα 的激活，雙突變則可完全消除BMAL1/CLOCK 對RORα 的誘導(dǎo)。另外，BMAL1/CLOCK 激活的啟動子可被Cry1抑制。另外有研究顯示，在Bmal1敲除小鼠肝臟中，RORγ 亞型的表達(dá)極大地增強(qiáng)，尤其是在ZT4-8 階段，繼而很大程度上抑制了RORγ 的節(jié)律性表達(dá)模式。RORγ 的mRNA 表達(dá)增加很大程度上是由于在Bmal1敲除肝臟中，REV-ERBs 的生物活性喪失，導(dǎo)致本應(yīng)在ZT4-8 進(jìn)行Rorγ基因抑制的過程丟失[21]。

圖1 RORα 和REV-ERBα 參與的生物鐘節(jié)律性調(diào)控的分子機(jī)制Figure 1 The molecular mechanisms of RORα and REV-ERBα involved in the circadian clock

同時，由于核受體REV-ERBs、谷胱甘肽還原酶（gluathione reductase，GR）、RORs 和過氧化物酶體增殖物激活受體（peroxisome proliferatorsactivated receptors，PPARs）均與生物鐘系統(tǒng)相互作用，能夠從分子水平介導(dǎo)巨噬細(xì)胞、T 細(xì)胞活性，因此是聯(lián)系炎癥和節(jié)律的關(guān)鍵，參與多種免疫性疾病的發(fā)生發(fā)展。目前研究已經(jīng)證實類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎（rheumatoid arthritis，RA）不僅顯示出病理癥狀的晝夜節(jié)律性[22]，而NRs 及其調(diào)控的代謝通路紊亂也參與RA 的病理過程，現(xiàn)已證實RA 病理基礎(chǔ)是免疫炎癥反應(yīng)，并且存在生物鐘晝夜節(jié)律紊亂的表現(xiàn)。因此，通過對以上NRs 與節(jié)律和炎癥等相關(guān)性的研究，有望促進(jìn)對RA、腫瘤等難治性疾病發(fā)病機(jī)制認(rèn)識的提升，拓展難治性疾病的治療手段，進(jìn)一步指導(dǎo)臨床用藥。

另一項研究表明，在回腸中，RORα 和REVERBα 調(diào)節(jié)與Toll 樣受體（Toll-like receptor，TLR）信號相關(guān)的多個節(jié)律性基因的表達(dá)。健康個體和炎癥性腸病（inflammatory bowel diseases，IBD）患者中包括ARNTL2、NPAS2、PER1和RORα在內(nèi)的幾個晝夜節(jié)律基因的表達(dá)上調(diào)，這與這些蛋白在病理生理學(xué)中的作用一致[23]。生理行為學(xué)實驗中觀察到，敲除Rorα或Rorβ后的小鼠的神經(jīng)精神疾病風(fēng)險增加，包括自閉癥、雙相情感障礙、精神分裂癥、抑郁癥和創(chuàng)傷后應(yīng)激綜合征，這些病癥可能與晝夜節(jié)律障礙相關(guān)[24]。

綜合來看，這些研究都表明RORα 和REVERBα 作為生物鐘系統(tǒng)的重要調(diào)控因子，調(diào)節(jié)各種免疫炎癥通路的調(diào)節(jié)，并為晝夜節(jié)律紊亂與多種疾病風(fēng)險增加提供了一個可能的機(jī)制。

3 晝夜節(jié)律與血管穩(wěn)態(tài)

人類的各項生理活動，從大腦活動到心臟、腎臟或免疫功能等各個方面都表現(xiàn)出節(jié)律性。近年來的證據(jù)顯示，在心血管系統(tǒng)中，晝夜節(jié)律與血管健康、血管穩(wěn)態(tài)與重構(gòu)之間關(guān)系密切[25-26]，同時也對心血管系統(tǒng)的生理運作產(chǎn)生了重要影響[27]。人類最明顯的晝夜節(jié)律是睡眠/覺醒周期，心率變化和血流、血管張力、纖溶活性和內(nèi)皮功能都自然地受到日/夜變化的影響，這些隨時間變化的影響不僅是睡眠/清醒或休息/鍛煉變化的結(jié)果，而且還與血管固有特性的顯著波動有關(guān)。因此，晝夜節(jié)律紊亂已成為破壞血管穩(wěn)態(tài)和促進(jìn)心血管疾病發(fā)生發(fā)展的一大危險因素。雖然心血管疾病和晝夜節(jié)律之間的聯(lián)系已有大量研究[28-29]，但心血管生物鐘調(diào)控病理生理的機(jī)制仍有待闡明，這就需要進(jìn)一步探討組成血管系統(tǒng)的主要細(xì)胞類型固有的生物節(jié)律，包括內(nèi)皮細(xì)胞、血管平滑肌細(xì)胞、成纖維細(xì)胞和干細(xì)胞。

3.1 晝夜節(jié)律在血管穩(wěn)態(tài)中的作用

上世紀(jì)90 年代，外科手術(shù)證明了SCN 的消融可破壞血壓的晝夜變化以及行為和內(nèi)分泌節(jié)律[30]。但這種初步的方法并不能從分子水平上直接洞察晝夜節(jié)律/生物鐘和血壓之間的相互作用。隨后有研究者制定了另一種方案[31]，即通過檢測大鼠主動脈對血管活性物質(zhì)的敏感性，以確定一天中收集組織的時間。作者發(fā)現(xiàn)主動脈血管反應(yīng)性呈現(xiàn)出明顯的時間依賴效應(yīng)，提示血管中存在潛在分子特性的周期性變化。這些發(fā)現(xiàn)與Zhang 等[32]近年的一項研究一致，該研究表明，小鼠主動脈轉(zhuǎn)錄組中有相當(dāng)高比例（約5%）的蛋白編碼基因顯示出晝夜節(jié)律性。

在改變了控制外周時鐘的基因的轉(zhuǎn)基因小鼠體內(nèi)，血管生理的晝夜節(jié)律控制發(fā)生了明顯的改變；在小鼠主動脈管中生物鐘基因的晝夜節(jié)律表達(dá)被首次報道后[33]，后續(xù)的一系列研究證實這些生物鐘基因參與了血管生理變化。例如，將主動脈從Bmal1敲除小鼠移植到野生型小鼠后，受體小鼠仍然發(fā)展為嚴(yán)重的動脈粥樣硬化，而血流動力學(xué)沒有改變，這也意味著外周時鐘在這種表型的產(chǎn)生中起著重要的作用[34]。也有研究表明，生理時鐘的其他基因（如Per）的遺傳缺失會影響乙酰膽堿的內(nèi)皮依賴性舒張功能障礙，導(dǎo)致血管功能紊亂[35]。另外，在睡眠剝奪（sleep deprivation，SD）小鼠模型中，晝夜節(jié)律鐘功能障礙會導(dǎo)致血管系統(tǒng)硬化，而這一現(xiàn)象與細(xì)胞外基質(zhì)調(diào)控功能受損有關(guān)。

在人體試驗中，也得到了相似的結(jié)論。有研究入組了60 名健康男性，在不同時間的SD 后，分析其對心臟、血流動力學(xué)和內(nèi)皮參數(shù)的影響，并確定這些影響是否隨著SD 期延長而持續(xù)；結(jié)果發(fā)現(xiàn)健康男性的SD 與血壓升高有關(guān)，血壓升高出現(xiàn)在SD發(fā)作24 h 后，并在SD 發(fā)作期間持續(xù)升高；觀察到的血流動力學(xué)變化可能是由于血管內(nèi)皮功能紊亂引起的，與血管對L-精氨酸（L-Arginine，L-Arg）和非對稱二甲基精氨酸（asvmmetric dimethylarginine，ADMA）的反應(yīng)性有關(guān)[36]。可見晝夜節(jié)律發(fā)生紊亂后，血管功能與血管內(nèi)皮反應(yīng)性均有不同程度影響。

3.2 晝夜節(jié)律與血管疾病

在時間節(jié)律規(guī)律的概念出現(xiàn)之前，人們相信心血管事件的發(fā)生是隨機(jī)的。然而，一系列的流行病學(xué)研究表明，幾乎所有的急性心血管事件，如不穩(wěn)定型心絞痛、心肌梗死、心源性猝死或卒中等，都表現(xiàn)出晝夜節(jié)律，在清晨出現(xiàn)的頻率最高；這些心血管事件與晨起血壓升高、血管舒張功能下降、血小板聚集能力增強(qiáng)和復(fù)極化改變相一致[37-38]。而如今，大量研究表明，心肌梗死面積隨癥狀出現(xiàn)時間的變化而變化，并且這種關(guān)系與晝夜節(jié)律周期相關(guān)，支持了心肌易受缺血/再灌注影響的24 h 周期這一假設(shè)，且這些結(jié)果與缺血時間和護(hù)理質(zhì)量無關(guān)，二者在白天和晚上都有顯著差異[39-40]。

現(xiàn)代生活方式強(qiáng)加了外部的時間限制和行為模式的改變，這極易使人體暴露于晝夜節(jié)律紊亂的環(huán)境中。長期的不良睡眠習(xí)慣和夜間持續(xù)暴露在光線下導(dǎo)致的睡眠障礙是造成生物鐘紊亂的主要因素。事實上，相當(dāng)一部分人的睡眠時間達(dá)不到建議的7～8 h[27]?；A(chǔ)研究顯示，剝奪睡眠會改變小鼠的晝夜基因表達(dá)，從而導(dǎo)致心臟和肺中基因表達(dá)的改變[41]。此外，流行病學(xué)研究表明，夜班工人患心血管疾病、糖尿病和肥胖的風(fēng)險增加，這可能是由于直接改變活動-休息周期和不斷暴露在光線下，通過抑制褪黑素的產(chǎn)生而造成睡眠障礙[35]。這些變化繼而可能會導(dǎo)致內(nèi)部節(jié)律振蕩器之間失去協(xié)調(diào)。雖然在早期的研究中，由于飲食改變、更高的工作量和伴隨的疾病可能產(chǎn)生的間接影響，因果關(guān)系沒有被明確定義。但對健康輪班工人的研究表明，晝夜節(jié)律失調(diào)會使血壓升高，炎癥標(biāo)志物水平升高[42]。此外，一些關(guān)于輪班工作和心血管疾病的薈萃分析顯示，輪班工作會導(dǎo)致心血管事件的風(fēng)險增加。

綜上所述，考慮到晝夜節(jié)律紊亂和心血管疾?。╟ardiovascular disease，CVD）之間的聯(lián)系[43]，了解生物鐘節(jié)律內(nèi)的節(jié)律基因的表達(dá)變化，找出關(guān)鍵因子，從而加強(qiáng)血管功能的保護(hù)和CVD 的防治是一種潛在的治療策略，這有助于開發(fā)新的治療策略，提高治療方案的療效和患者耐受性。

4 RORα 和REV-ERBα 在血管病理生理中的作用

異常生長的微血管和大血管生長被視為結(jié)構(gòu)性冠狀循環(huán)阻塞和功能障礙的臨床病理改變，可以誘發(fā)多種心血管疾病（缺血再灌注損傷、動脈粥樣硬化易損斑塊破裂、血管重建、內(nèi)皮功能障礙等[44]）。在這些血管的病理變化中，動脈粥樣硬化性血管疾病已成為急性心血管疾病的主要病因[45]。易損斑塊破裂已被認(rèn)為是心肌梗死、卒中甚至猝死的主要威脅，以脂質(zhì)代謝紊亂為主要病理改變。針對斑塊內(nèi)巨噬細(xì)胞極化過程，在動脈粥樣硬化和易損動脈粥樣硬化斑塊形成的上游效應(yīng)物中尋找新的治療靶點和干預(yù)策略是有必要的，這將會促進(jìn)研究人員加強(qiáng)對穩(wěn)定的動脈粥樣硬化斑塊向易損斑塊轉(zhuǎn)變的過程的理解。如前所述，幾乎所有器官中存在的晝夜節(jié)律鐘都會影響組織的代謝穩(wěn)態(tài)。因此，生物鐘控制的節(jié)律基因異常是血管功能受損不容忽視的獨立危險因素。研究表明，一些核受體參與了動脈粥樣硬化的發(fā)生和進(jìn)展，更重要的是，由于其對斑塊纖維帽降解的正向調(diào)控作用，斑塊的穩(wěn)定性也受到了影響[1]。本文歸納了RORα 和REV-ERBα 在生物鐘節(jié)律中對血管病理生理變化的幾種影響。

4.1 RORα 和REV-ERBα 與血管功能

4.1.1 RORα與血管功能 動脈粥樣硬化性心血管疾病在系統(tǒng)性紅斑狼瘡（systemic lupus erythematosus，SLE）患者中具有很高的發(fā)病率和死亡率。有研究探究了SLE 誘發(fā)的內(nèi)皮功能障礙和RORα 的作用之間的關(guān)系[46]。該研究發(fā)現(xiàn)，SLE 患者的血清可誘導(dǎo)人臍靜脈血管內(nèi)皮細(xì)胞（human umbilical vein endothelial cell，HUVEC）出現(xiàn)功能損傷，而褪黑素的作用可通過增加HUVEC 中超氧化物歧化酶-1（superoxide dismutase-1，SOD1）、谷胱甘肽過氧化物酶-1（glutathione peroxidase-1，GPX1）、過氧化氫酶（catalase，CAT）活性，減少活性氧水平，從而延緩內(nèi)皮細(xì)胞衰老，促進(jìn)損傷后HUVEC 的增殖和修復(fù)；并且，SLE 炎性介質(zhì)誘導(dǎo)的RAW264.7 巨噬細(xì)胞遷移也被抑制，細(xì)胞間黏附分子-1（intercellular cell adhesion molecule-1，ICAM-1）和血管細(xì)胞黏附分子-1（vascular cell adhesion molecule-1，VCAM-1）表達(dá)減少，這些保護(hù)作用在很大程度上是由于RORα 的參與。當(dāng)特異性抑制RORα 活性后，褪黑素的抗炎、抗氧化和抗凋亡作用即消失，可見RORα 有潛力成為預(yù)防或治療內(nèi)皮功能障礙和動脈粥樣硬化性心血管疾病的有效治療靶點。

近期有研究顯示，RORα 可激活活化蛋白激酶（AMP-activated protein kinase，AMPK），這與血管平滑肌細(xì)胞（vascular smooth muscle cell，VSMC）增殖的抑制作用相關(guān)[47]。其一，RORα 及其激活劑膽固醇硫酸（cholesterol sulfate，CS）可誘導(dǎo)人體主動脈VSMC 和大鼠A7r5 細(xì)胞激活A(yù)MPK 通路，并伴隨著哺乳動物雷帕霉素靶蛋白（mammalian target of rapamycin，mTOR）和p70 核糖體蛋白S6 激酶1的活性抑制。其二，RORα 和CS 還參與調(diào)控細(xì)胞周期因子的表達(dá)，如p53、p27 和cyclin D。激活的RORα 可能通過細(xì)胞周期G1期的抑制作用，抑制人體主動脈VSMC 和大鼠A7r5 細(xì)胞的增殖。二維和三維細(xì)胞遷移實驗也驗證了過表達(dá)RORα 或使用CS 能夠抑制A7r5 細(xì)胞的遷移。其三，體內(nèi)使用腺病毒在主動脈內(nèi)過表達(dá)RORα 后，球囊誘導(dǎo)的大鼠的動脈損傷也得到了緩解。這些結(jié)果都表明，RORα 通過AMPK 誘導(dǎo)的mTOR 通路，抑制VSMC的增殖和遷移，提示RORα 可能是心血管疾病的一個潛在治療靶點。同時，針對RORα 與內(nèi)皮祖細(xì)胞（endothelial progenitor cell，EPC）的關(guān)系，也有研究認(rèn)為，RORα 可誘導(dǎo)循環(huán)中促紅細(xì)胞生成素的產(chǎn)生，繼而激活EPC 分化所需的AMPK 活性，促進(jìn)EPC 的分化與新生血管形成，加速組織修復(fù)并維持血管功能的穩(wěn)定[48]。

4.1.2 REV-ERBα 與血管功能 大部分研究都表明，REV-ERBα 主要表達(dá)于VSMC。有研究顯示，過表達(dá)REV-ERBα 可上調(diào)白細(xì)胞介素-6（interleukin 6，IL-6）和環(huán)氧酶（cyclo-oxygenase，COX）的表達(dá)，活化核因子κB（nuclear factor kappa-B，NF-κB），促進(jìn)p65 向A7r5 細(xì)胞核的轉(zhuǎn)位；此外，在A7r5 VSMCs 中，RORα 可上調(diào)REV-ERBα 的表達(dá)，但這種作用可被REV-ERBα 本身抑制[49]。這些結(jié)果提示REV-ERBα 和NF-κB 通路之間存在相關(guān)性。

另有研究探索了REV-ERBα 與血管內(nèi)皮功能之間的關(guān)系。Li 等[50]發(fā)現(xiàn)由機(jī)械損傷或慢性炎癥引起的血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷是引起血管疾病的重要原因。該研究證明，低劑量、安全的外源性一氧化碳（carbon monoxide，CO）可通過誘導(dǎo)REV-ERBα 促進(jìn)染色質(zhì)重構(gòu)和組蛋白H3 乙酰化實現(xiàn)，從而增強(qiáng)內(nèi)皮細(xì)胞的遷移能力。該研究通過觀察靶細(xì)胞REV-ERBα調(diào)控DNA 表達(dá)的作用，發(fā)現(xiàn)其可以招募組蛋白脫乙酰酶/核受體輔阻遏物（histone deacetylase/nuclear receptor corepressor，HDAC/N-CoR），調(diào)節(jié)負(fù)責(zé)內(nèi)皮細(xì)胞遷移和血管生成的轉(zhuǎn)錄基因生成。當(dāng)正常野生型小鼠移植了REV-ERBα+/-小鼠骨髓后，受體小鼠體內(nèi)REV-ERBα 表達(dá)水平降低，導(dǎo)致CO 對金屬絲損傷后新內(nèi)膜形成的保護(hù)作用喪失?？偟膩碚f，REV-ERBα 作為CO 對內(nèi)皮細(xì)胞保護(hù)作用機(jī)制中的關(guān)鍵因子，它參與調(diào)節(jié)EPC 和內(nèi)皮細(xì)胞的運動，增強(qiáng)了血管損傷后的組織修復(fù)。因此，通過調(diào)控REVERBα 及其下游基因可能有利于治療與血栓形成失調(diào)和血管生成有關(guān)的血管綜合征等血管疾病。

4.2 RORα 和REV-ERBα 與動脈粥樣硬化

4.2.1 RORα 與動脈粥樣硬化 由于RORα 在血管壁細(xì)胞（包括VSMC、內(nèi)皮細(xì)胞和單核細(xì)胞）上的節(jié)律性表達(dá)[51]，可以推測RORα 也參與易損斑塊的發(fā)生發(fā)展。研究顯示，RORαsg/sg突變小鼠可發(fā)生嚴(yán)重的動脈粥樣硬化，并伴隨著血清總膽固醇和高密度脂蛋白膽固醇含量顯著降低[52]。另有研究顯示，RORα 的激活可有效抑制動脈粥樣硬化的產(chǎn)生；另外，通過心臟切片形態(tài)學(xué)以評估冠狀動脈粥樣硬化斑塊的發(fā)生率，研究者們發(fā)現(xiàn)Rorα敲除小鼠可發(fā)生嚴(yán)重的冠狀動脈粥樣硬化[53]。除了在動脈粥樣硬化中可發(fā)揮有益作用外，RORα 也被報道參與調(diào)控脂質(zhì)穩(wěn)態(tài)相關(guān)基因APOA Ⅴ的轉(zhuǎn)錄，這些結(jié)果均提示RORα 可以作為治療動脈粥樣硬化的潛在靶標(biāo)；在體外細(xì)胞HepG2 和HuH7 中，RORα 缺失條件下，APOA Ⅴ活動強(qiáng)度降低，APOA Ⅴ轉(zhuǎn)錄被抑制，而過表達(dá)RORα，可增加APOA Ⅴ的表達(dá)水平；有趣的是，APOA Ⅴ對RORα 的功能性依賴，以及對脂質(zhì)代謝的影響只在人體中產(chǎn)生，并不存在于小鼠體內(nèi)[54-55]。

高發(fā)生率的自發(fā)性斑塊破裂和腔內(nèi)血栓形成是動脈粥樣硬化的主要特征。最近的一項研究表明[53]，通過部分結(jié)扎動脈可以刺激小鼠形成主動脈易損斑塊。頸動脈結(jié)扎的同時，增加左腎動脈處結(jié)扎可誘導(dǎo)腎血管性高血壓，促進(jìn)內(nèi)生Ang II 的產(chǎn)生，這種手術(shù)可導(dǎo)致頸部脂質(zhì)斑塊的產(chǎn)生，促進(jìn)血栓形成，斑塊自發(fā)破裂，這些形態(tài)學(xué)表現(xiàn)均得到了證實。研究通過斑塊免疫熒光染色和mRNA 水平分析證明，在易損頸動脈斑塊中，RORα 水平被抑制。此外，RORα 缺乏的小鼠血小板功能受損，RORα 產(chǎn)生各種異?，F(xiàn)象，如易損斑塊出血的發(fā)生率更高，自發(fā)的斑塊破裂和血栓，收縮期血流速度改變，脂質(zhì)過度堆積等。重要的是，異常表達(dá)的RORα還影響著一些炎癥因子的釋放，包括IL-1β、IL-2、IL-6、單核細(xì)胞趨化蛋白-1（monocyte chemotactic protein 1，MCP-1）、巨噬細(xì)胞炎癥蛋白-1α（macrophage inflammatory protein 1α，MIP-1α）和腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor α，TNF-α），這進(jìn)一步加劇了血管損傷。鑒于RORα 對脂質(zhì)的調(diào)控作用，正如前面所示，相較于野生型小鼠，RORαsg/sg小鼠血漿三酰甘油和總膽固醇水平降低，表明RORα可能通過抗炎活動穩(wěn)定斑塊。

不過，也有研究得出了相反的結(jié)論，即抑制RORα 可有效抑制動脈粥樣硬化的形成[56]。該研究使用低密度脂蛋白受體（low-density lipoprotein receptor precursor，LDL-R）-/-小鼠，以高膽固醇飲食作為動脈粥樣硬化模型組，隨后使用ROR 抑制劑SR1001 給藥4 周。結(jié)果發(fā)現(xiàn)該藥可有效降低血漿LDL 水平，增加腸內(nèi)膽固醇排泄，但不影響高密度脂蛋白水平。同時SR1001 處理組還可誘導(dǎo)抗免疫作用，其特征是Th17 細(xì)胞減少，Treg 和Th2 細(xì)胞增多。該數(shù)據(jù)表明，RORα 在動脈粥樣硬化發(fā)展上發(fā)揮重要作用，抑制RORs 的活性可有效抑制斑塊形成。

總的來說，RORα 作為轉(zhuǎn)錄因子可調(diào)控代謝和炎癥反應(yīng)，參與動脈粥樣硬化的形成，但其具體作用還需進(jìn)一步的研究確認(rèn)。

4.2.2 REV-ERBα 與動脈粥樣硬化 代謝綜合征和血脂異常均具有導(dǎo)致動脈粥樣硬化血栓形成的共同機(jī)制，成為心血管疾病的高危因素。晝夜節(jié)律在脂質(zhì)代謝紊亂中起著關(guān)鍵作用，晝夜節(jié)律的紊亂同樣會破壞其他生物過程的平衡，尤其是血管，從而引發(fā)炎癥、內(nèi)皮功能障礙和血栓形成。巨噬細(xì)胞被廣泛認(rèn)為是參與炎癥和脂質(zhì)代謝相互作用的斑塊發(fā)展各個階段的關(guān)鍵組織者。REV-ERBα 在巨噬細(xì)胞中表達(dá)豐富，這使REV-ERBα 參與動脈粥樣硬化斑塊形成成為可能。在人肝細(xì)胞HepG2 中，轉(zhuǎn)染REVERBα 顯示出特定的ApoC--III 水平抑制作用，這可能為REV-ERBα 抑制三酰甘油脂蛋白的產(chǎn)生提供新的途徑[57]。越來越多的證據(jù)闡明，在巨噬細(xì)胞內(nèi)REV-ERBα 主要控制膽固醇體內(nèi)平衡與脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）引起的炎癥反應(yīng)，進(jìn)一步驗證了REV-ERBα 的抗動脈粥樣硬化作用。此外，動脈粥樣硬化的過程中炎癥反應(yīng)加速可能是由于體內(nèi)缺乏REV-ERBα，而動脈粥樣硬化后，斑塊中巨噬細(xì)胞傾向于過表達(dá)REV-ERBα 從而延緩炎癥反應(yīng)。Wang 等[58]發(fā)現(xiàn)ERV-ERBα 可有效抑制纖溶酶原激活物抑制物-1（plasminogen activator inhibitor type 1，PAI-1）的節(jié)律性表達(dá)，PAI-1 的水平變化被視為調(diào)節(jié)炎癥和動脈粥樣硬化的核心細(xì)胞因子，ERV-ERBα通過結(jié)合PAI-1 啟動子，達(dá)到抑制PAI-1 活性的作用。節(jié)律性表達(dá)的PAI-1 可導(dǎo)致急性血栓和其他嚴(yán)重的心血管事件，如缺血性疾病。另一項研究使用REV-ERBα 特定合成配體SR9009，測試藥理學(xué)激活REV-ERBα 是否能類似地抑制血管并發(fā)癥；結(jié)果發(fā)現(xiàn)LDL 受體缺陷小鼠在接受SR9009 處理后，油紅染色和HE 染色均顯示斑塊沉積明顯減少，顯示出潛在的抗動脈粥樣硬化的效果，處理組與對照組相比血漿脂質(zhì)沒有顯著性差異；在分子水平上，骨髓來源的小鼠巨噬細(xì)胞中，藥理學(xué)激活REV-ERBα 后，干擾素γ（interferon γ，IFNγ）的mRNA 和促炎因子的表達(dá)被明顯抑制，如IL-6、巨噬細(xì)胞移動抑制因子（macrophage migration inhibitory factor，MIF）和MCP-1，說明激活的REV-ERBα 可能通過抑制巨噬細(xì)胞炎癥反應(yīng)從而保護(hù)血管功能[59]?？傊?，這項最新研究得出的結(jié)論與之前的研究基本一致。

從這些研究發(fā)現(xiàn)可見，REV-ERVα 可在一定程度上預(yù)防和治療動脈粥樣硬化，并且在穩(wěn)定斑塊問題上，抑制巨噬細(xì)胞炎癥可能成為REV-ERBα 保護(hù)動脈粥樣硬化的主要作用機(jī)制。因此，藥理學(xué)干預(yù)REV-ERBα，增強(qiáng)其內(nèi)源活性或可作為抗動脈粥樣硬化，延緩動脈粥樣硬化進(jìn)展的有效治療手段。

4.3 RORα 和REV-ERBα 與高血壓

如前所述，由于交感神經(jīng)活動的節(jié)律性變化，人體血壓也在一天中呈現(xiàn)節(jié)律性改變。血壓一般在清晨覺醒時開始升高，在上午10 點左右達(dá)到最高值，而后不斷下降，在凌晨3 點左右達(dá)到最低點[60]。正是因為交感神經(jīng)系統(tǒng)的晝夜節(jié)律與心血管穩(wěn)態(tài)之間的關(guān)系，所以清晨較高的心血管事件發(fā)生率與早晨血壓峰值有關(guān)。血壓變化受節(jié)律基因調(diào)控，有研究指出，Bmal1的遺傳缺失可以消除血壓的晝夜變化，減少兒茶酚胺的產(chǎn)生[61]。臨床數(shù)據(jù)表明，急性心肌梗死、心源性猝死和缺血性卒中的發(fā)生率在清晨最高[37,62]。而血壓變化受生物節(jié)律鐘基因軸調(diào)節(jié)。有證據(jù)表明，不良或短暫的睡眠習(xí)慣（即睡眠時間少于6.5 h）極易導(dǎo)致健康個體血壓和心率升高[27,63]，產(chǎn)生嚴(yán)重的心血管疾病，并與發(fā)病率和死亡率升高相關(guān)。

褪黑素作為交感神經(jīng)系統(tǒng)中時鐘基因的授時因子，在中樞神經(jīng)系統(tǒng)結(jié)構(gòu)如SCN、外周組織如脂肪細(xì)胞和心肌細(xì)胞中發(fā)揮重要作用。褪黑素對野生型SD（Sprague-Dawley）大鼠和高血壓大鼠Bmal1和Per2的表達(dá)呈晝夜節(jié)律作用，但未改變SCN 中時鐘基因的表達(dá)。研究顯示，在高血壓大鼠SCN 中，注射褪黑素的首個24 h 的夜晚并不影響生物鐘基因轉(zhuǎn)錄，但它卻改變了生物鐘的表達(dá)模式，在第2 個周期夜晚顯示褪黑素明顯維持REV-ERBα 的mRNA長期高表達(dá)，特別是在褪黑素治療后12 h 內(nèi)，避免了REV-ERBα 的mRNA 下降[64]。因此，可以推測，在成年大鼠心肌細(xì)胞內(nèi)，REV-ERBα 在光信號傳導(dǎo)至外周器官（如心臟）時，調(diào)節(jié)外周器官的血壓節(jié)律性中發(fā)揮重要作用。具體機(jī)制可能是褪黑素受體MT1和MT2的活性被抑制，喪失了對REV-ERBα 表達(dá)的調(diào)控。而褪黑素對心肌細(xì)胞生物鐘的作用可能也涉及翻譯后機(jī)制，這需要進(jìn)一步研究。另一項研究也表明，大鼠的程序性高血壓事件與節(jié)律基因表達(dá)相關(guān)，當(dāng)給予褪黑素治療后，交感神經(jīng)系統(tǒng)接受褪黑素刺激，從而使腎臟內(nèi)MT2受體活性增加，導(dǎo)致RORα 表達(dá)明顯升高，有效保護(hù)程序性高血壓大鼠的血壓[65]。

綜上可見，受交感神經(jīng)系統(tǒng)釋放的褪黑素支配，血壓變化與REV-ERBα 和RORα 的活性密切相關(guān)，升高REV-ERBα 和RORα 的基因表達(dá)水平可有效保護(hù)高血壓帶來的危害。

5 臨床前景

由于在血管病理生理過程中發(fā)揮的重要作用，以REV-ERBα 和RORα 為靶點的藥物正不斷被研發(fā)，以期獲得較好的血管健康及臨床療效。

褪黑素是松果體分泌的一種吲哚類神經(jīng)內(nèi)分泌素，而RORα 作為內(nèi)源性褪黑素受體，可能在晝夜節(jié)律、血管功能、血運重建中存在一定的作用。在一般人群和心血管疾病患者中，心率和血壓升高是各種原因死亡的危險因素。夜間心率下降不足，即心率不下降，也會增加心血管風(fēng)險。心率/血壓異常反映了自主神經(jīng)系統(tǒng)中交感神經(jīng)張力相對地不平衡。一項臨床試驗中，對26 名健康清醒的男性以仰臥位給予2 mg 褪黑素，60 min 后，與給予安慰劑的受試者相比，觀察到心率和血壓明顯下降，心率變異性增加，血漿去甲腎上腺素和多巴胺含量顯著降低[66]。在另一項臨床試驗中，共篩選了97 位正常血壓和高血壓老年志愿者，于睡覺前持續(xù)2 周給予1.5 mg 褪黑素，結(jié)果顯示受試者的收縮壓和舒張壓出現(xiàn)了不同程度的降低，于3:00 — 8:00 間（最易發(fā)生心血管事件的時間段）產(chǎn)生心率降低現(xiàn)象[67]。一項涉及78 名體位性心動過速綜合征患者的研究表明，與安慰劑相比，褪黑素在使用后2 h 內(nèi)站立時間明顯延長[68]。綜合上述臨床試驗結(jié)果可見，褪黑素可以降低心率和血壓，同時褪黑素的時間生物學(xué)作用可以使夜間心率下降不足現(xiàn)象恢復(fù)正常。褪黑素的抗高血壓和抗心動過速等特性預(yù)示著它在對抗心率升高及控制血壓方面很有前途。

雖然RORα 與REV-ERBα 的特異性小分子激動劑，如REV-ERBα 藥理性激動劑SR9009、GSK4112等已被研制并可用于細(xì)胞實驗與動物實驗，但由于目前關(guān)于穩(wěn)定晝夜節(jié)律對冠心病和心力衰竭的影響的前瞻性研究還很少，該類小分子新型藥物仍處于臨床前研究階段，而目前已知的大部分基礎(chǔ)研究均表明，以RORα 與REV-ERBα 為靶點進(jìn)行抗動脈粥樣硬化、抗高血壓的藥物有樂觀的臨床研究前景，未來圍繞二者開展的藥物臨床試驗具有極大的臨床意義和治療前景。

6 結(jié)語

綜上所述，RORα 和REV-ERBα 是生物鐘系統(tǒng)的重要組成部分，其不僅是經(jīng)典生物鐘基因，更是生物鐘調(diào)節(jié)的關(guān)鍵因子，在維持生物節(jié)律中發(fā)揮關(guān)鍵作用，并且在血管穩(wěn)態(tài)及心血管系統(tǒng)疾病中占有重要地位。近年來很多研究都在關(guān)注RORα 和REVERBα，在維持血管結(jié)構(gòu)穩(wěn)態(tài)、血管健康以及動脈粥樣硬化疾病發(fā)展中具有重要作用。在RORα 和REVERBα 基因水平改變后，容易在促動脈粥樣硬化的危險因素下造成血管損傷，促進(jìn)脂質(zhì)斑塊形成，并且易轉(zhuǎn)變?yōu)橐环N易損斑塊表型。但仍有部分研究對于RORα 和REV-ERBα 這2 種生物鐘核受體在機(jī)體內(nèi)的作用持對立觀點，因此RORα 和REV-ERBα 對人體心血管疾病發(fā)展的影響仍有待進(jìn)一步的深入探討。隨著人們對生物鐘基因的認(rèn)識和研究的不斷加深，生物節(jié)律在血管病理生理過程中發(fā)揮的作用將逐漸被解密，有理由相信，干預(yù)生物節(jié)律將為預(yù)防和治療心血管疾病提供重要的理論依據(jù)。