糧食中真菌毒素和快速定量檢測方法的探討

陳明偉，王 巖，張永君，李俊飛

1.中央儲備糧淄博直屬庫有限公司 (淄博 256499) 2.中央儲備糧淄博直屬庫有限公司高青分公司 (淄博 256400)

糧食是人類賴以生存的根本，也是我們的物質(zhì)基礎(chǔ)，在保證食物美味營養(yǎng)的前提下，我們應(yīng)該從源頭上抓好我們食用的玉米、小麥、大豆等其他作物的安全。我國糧食生產(chǎn)主要集中在高溫、高濕區(qū)域，導(dǎo)致真菌毒素的污染比較嚴(yán)重，已經(jīng)威脅到人們的健康和生命安全。糧食中真菌毒素的檢測勢在必行。同時不斷提高糧食中真菌毒素的檢測分析技術(shù)，對確保國家糧食安全，保障人們身體健康具有重要意義。

1 糧食中的真菌毒素

1.1 真菌毒素的產(chǎn)生

真菌在新陳代謝過程中能夠產(chǎn)生大量化學(xué)結(jié)構(gòu)各異的生物活性物質(zhì)，許多這類物質(zhì)對人和動物具有毒性，被稱為真菌毒素。真菌毒素一般分為霉菌毒素和蘑菇毒素兩類。與食品關(guān)系較為密切的為黃曲霉毒素，赭曲霉毒素等，危害較大的主要有黃曲霉毒素(AFLA),玉米赤霉烯酮(ZEAR/ZEN/F-2)，嘔吐毒素(Vomitoxin/DON).赭曲霉毒素(OTA),伏馬菌素(FUM)，T2/HT2毒素。

1.2 真菌毒素對人類的危害

1.2.1真菌引起食品變質(zhì)，真菌毒素能夠引起人畜中毒

真菌毒素是農(nóng)產(chǎn)品的主要污染物之一,人畜進(jìn)食被其污染的糧油可導(dǎo)致急,慢性真菌毒素中毒。根據(jù)聯(lián)合國糧農(nóng)組織的調(diào)查,全球每年約有25%的糧食受到真菌毒素的污染,約有2%的農(nóng)作物因污染嚴(yán)重失去利用價值[1]。受氣候和儲藏等因素的影響，我國是世界上受真菌毒素污染最嚴(yán)重的國家之一。根據(jù)國家糧食局不完全統(tǒng)計，每年真菌毒素污染造成的糧油損失累計約3 100萬t，超過陜西、甘肅、青海、寧夏、西藏5個西部省區(qū)全年糧食產(chǎn)量的總和。

1.2.2真菌毒素具有強(qiáng)毒性和致癌性

黃曲霉毒素是由黃曲霉和寄生曲霉在生長繁殖過程中所產(chǎn)生的一種對人類危害極為突出的一類強(qiáng)致癌物質(zhì)，主要作用于動物的肝臟易誘發(fā)腫瘤，24周內(nèi)就能夠?qū)е赂闻K壞死癌變。黃曲霉毒素B1(AFB1)是目前為止所發(fā)現(xiàn)的毒性最大的真菌毒素，其毒性為氰化鉀的10倍、砒霜的68倍，是目前已知最強(qiáng)的化學(xué)致癌物之一[2]。嘔吐毒素毒性較低，它是一種全球性的谷物污染物，主要毒性作用影響動物免疫系統(tǒng)及胃腸道，受污染的糧食制品能引起人的頭痛、頭暈、嘔吐、腹瀉及中樞神經(jīng)絮亂等。玉米赤霉烯酮具有生殖毒性、腎臟、免疫毒性、肝臟毒性，誘發(fā)腫瘤形成。妊娠期的人或動物食用含有玉米赤霉烯酮的食物會引起流產(chǎn)，死胎和畸胎,還可引起中樞神經(jīng)中毒癥狀。

1.3 針對真菌毒素污染，我國制定的幾種真菌毒素的限量標(biāo)準(zhǔn)

我國國家標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定玉米及玉米制品中黃曲霉毒素B1的限量20 μg/kg，稻谷、糙米、大米中黃曲霉毒素B1的限量為10 μg/kg；小麥及其他谷物中黃曲霉毒素B1的限量為5.0 μg/kg。我國國家標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定谷物及其制品中赭曲霉毒素A的限量為5.0μg/kg。我國國家標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定谷物及其制品中玉米赤霉烯酮的限量為60 μg/kg。我國國家標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定谷物及其制品中脫氧雪腐鐮刀菌烯醇的限量為1 000 μg/kg[3]。

2 真菌毒素的測定

2.1 真菌毒素的幾種測定方法

國家標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定的糧油及其制品中真菌毒素的檢測方法為薄層層析法、酶聯(lián)免疫吸附法、儀器方法(氣相色譜，液相色譜，質(zhì)譜等)、快速檢測條方法。根據(jù)我們目前收購入庫的特點(diǎn)，要求檢驗方法快速，簡便，低成本。以上幾種方法存在樣品前處理復(fù)雜，檢測成本高，檢測速度慢等問題，不適合收購現(xiàn)場檢驗。目前很多機(jī)構(gòu)檢驗采用了快速檢測條方法。Charm Rosa真菌毒素檢測系統(tǒng)與其他真菌毒素檢測系統(tǒng)相比具有明顯優(yōu)勢，它檢測范圍寬且不受作物機(jī)制的影響,在糧食及其制品中檢測的范圍和項目最為全面,適合多種基質(zhì)如玉米、小麥、大米、大豆、高粱、黑麥、燕麥、食用油等糧食及其制品等多種作物，且檢測方法均相同。全國257家國家糧食質(zhì)量監(jiān)測機(jī)構(gòu)中已有212家配備Charm Rosa真菌毒素定量檢測系統(tǒng)。它被稱為“便攜實用的實驗室”。

2.2 Charm Rosa真菌毒素檢測的優(yōu)勢

2.2.1采用糧食行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)

曲霉毒素B1采用LS/T 6111—2015標(biāo)準(zhǔn)，脫氧雪腐鐮刀菌烯醇采用LS/T 6113—2015標(biāo)準(zhǔn)，霉烯酮采用LS/T 6112—2015標(biāo)準(zhǔn)，赭曲霉毒素采用LS/T 6114—2015標(biāo)準(zhǔn)。

2.2.2檢測項目多

除能檢測國家規(guī)定的四種真菌毒素(黃曲霉B1，嘔吐毒素，玉米赤霉烯酮，赭曲霉A)還可以檢測伏馬菌素、T2毒素等。

2.2.3Charm Rosa檢測速度快

曲霉毒素B1、玉米赤霉烯酮、嘔吐毒素、伏馬菌素檢測時間5 min；赭曲霉毒素A、T2/HT2毒素檢測時間10 min可得到準(zhǔn)確的定量檢測結(jié)果。整個操作過程步驟簡單，對于操作人員沒有較高的要求，適合收購入庫快速檢驗。

2.3 Charm Rosa真菌毒素的定量檢測

2.3.1檢驗原理

試樣提取液中的真菌毒素與檢測條中的膠體金微粒發(fā)生呈色反應(yīng)，顏色深淺與試樣中真菌毒素含量相關(guān)，真菌毒素含量越高，檢測線顏色越淺。用讀數(shù)儀測定檢測條的顏色深淺，根據(jù)顏色深淺和讀數(shù)儀內(nèi)置曲線自動計算出試樣中真菌毒素的含量。

2.3.2檢驗材料與儀器

試樣：玉米；試劑：蒸餾水、70%甲醇；儀器：粉碎機(jī)、離心機(jī)、渦旋儀、天平、定量檢測條、孵育器、讀數(shù)儀。

2.3.3檢驗流程

原始樣品→按GB 5491分取→試樣約500 g→粉碎試樣(全部過20目篩)→混勻樣品備用→稱樣10.00 g→加20.0 mL(70%甲醇)或50 mL(蒸餾水)提取液→漩渦震蕩提取(震蕩1.5 min)→靜置(1 min)→取1.0mL混合液→離心1 min→100 μL上清液+1.0 mL緩沖液→渦旋震蕩10 s→一次提取稀釋液→加樣300 μL→孵育5 min或10 min(45 ℃±1 ℃)→讀數(shù)→數(shù)值≥30+，≥350+，≥1 501+→二次稀釋→報告含量。

流程解析: 曲霉毒素、玉米赤霉烯酮、赭曲霉毒素定量測定加入20.0 mL(70%甲醇)提取液；嘔吐毒素定量測定加入50ml(蒸餾水)提取液；根據(jù)測定的毒素項目選擇對應(yīng)的緩沖溶液和試劑條。

2.3.4檢驗結(jié)果

DON(嘔吐毒素頻道)：300 μg/kg；ZEAR(玉米赤霉烯酮頻道):5 μg/kg;AFLASL(黃曲霉毒素B1頻道):2 μg/kg。

3 真菌毒素定量測定注意事項

(1) 試劑條和緩沖溶液收到后，先檢查保質(zhì)期；并查看緩沖溶液是否有絮狀物，絮狀物對檢測結(jié)果干擾大。導(dǎo)致結(jié)果不準(zhǔn)確。

(2) 使用前檢查干燥劑的顏色,正常顏色為藍(lán)色,如果是紫色或粉色說明檢測條不可用。

(3) 每次檢測結(jié)束,剩余檢測條應(yīng)該立即密封并冷藏。

(4) 檢測條從冰箱取出后20～30 min左右恢復(fù)到室溫再使用。

(5) 實驗室環(huán)境溫度最好控制在20 ℃～25 ℃，檢測條不用時2.8 ℃密封冷藏保存,首次打開包裝桶時,應(yīng)撕掉鋁箔并丟棄,保留塑料蓋。

(6) 小心撕開檢測條薄膜至指標(biāo)線處,避免提起檢測條和海綿。

(7) 加樣時保持移液管垂直,緩慢勻速加入檢測液.用力過猛會使溶液直接跑標(biāo)線上方，影響結(jié)果。

(8) 觀察c線的清晰度，如果無c線顯示檢測無效，需重新檢測。

(9) 孵育結(jié)束后在2 min內(nèi)讀取結(jié)果。

4 糧食中真菌毒素的控制

糧食中真菌毒素的污染主要是在收獲期和儲藏期。通過加強(qiáng)田間管理是抑制真菌毒素產(chǎn)生最有效的方法[4]。在儲存過程中控制濕度低于70%，干燥，低溫，密封的環(huán)境能控制真菌毒素的產(chǎn)生。也可以通過減少氧氣，加入二氧化碳的方法制約糧食中真菌毒素的產(chǎn)生。