喹諾酮類藥物的抗菌和抗性機制

卞佳豪，奉竹，林穎崢，李思思，李樹清，王恒安*，陳志飛*

(1.上海交通大學(xué)農(nóng)業(yè)與生物學(xué)院，上海市獸醫(yī)生物技術(shù)重點實驗室，上海200240;2.中華人民共和國上海海關(guān)，上海200002)

喹諾酮類(quinolones)藥物是一類含有4-喹諾酮母核的人工合成藥物的總稱，具有生物利用度好、體內(nèi)代謝穩(wěn)定、抗菌譜廣和抑菌高效等優(yōu)點，廣泛應(yīng)用于細菌性疾病的預(yù)防與治療，但隨之而來的是細菌對該類藥物的耐藥性日趨嚴重，已嚴重影響其臨床的有效使用。本文將從喹諾酮類藥物的分類和抑菌機制及細菌的耐藥機制和耐藥基因等方面作一系統(tǒng)梳理。

1 喹諾酮類藥物的分子結(jié)構(gòu)

1.1 第一代喹諾酮類藥物 以萘啶酸(nalidixic acid)為代表。萘啶酸可以說是Lesher等在合成抗瘧疾藥物-氯喹(7-氯-1-乙基-1，4-二氫-4-氧代喹啉-3-羧酸)(圖1)過程中的意外收獲[1]。萘啶酸是合成氯喹過程中的中間產(chǎn)物，兩者的分子結(jié)構(gòu)具有一定相似性，區(qū)別在于氯喹和萘啶酸的C-7位分別引入了Cl和Me、氯喹的8-C對應(yīng)于萘啶酸的8-N (圖1)。由于萘啶酸為第一代喹諾酮藥物，其抗菌譜較窄，只對部分革蘭氏陰性細菌有一定抑制作用，臨床療效不夠理想，且萘啶酸具有一定的毒副作用，因此，未能在臨床廣泛應(yīng)用。但其獨特的抗菌機制引起諸多研究者的關(guān)注，經(jīng)不斷修飾和完善，截至目前已發(fā)展到第四代喹諾酮類藥物。

1.2 第二代喹諾酮類藥物 以氟甲喹和吡哌酸為代表。氟甲喹(flumequine)是第一個在母核C-6位引入氟原子的喹諾酮藥物，吡哌酸(pipemidic acid)是第一個在C-7位引入哌嗪基(堿性含氮六元雜環(huán)基團)的喹諾酮藥物(圖1)。母核C-6位和C-7的基團修飾為喹諾酮類藥物的后續(xù)開發(fā)提供了新的思路。與萘啶酸相比，這些修飾顯著增強了藥物對DNA促旋酶活性的抑制，提高了抗菌活性，并拓展了抗菌譜，例如對銅綠假單胞菌等表現(xiàn)抗菌活性，第二代喹諾酮藥物主要應(yīng)用于臨床泌尿和消化道細菌性感染的治療。

1.3 第三代喹諾酮類藥物 以諾氟沙星為代表。諾氟沙星(圖1)的合成結(jié)合了氟甲喹與吡哌酸的結(jié)構(gòu)特征，是第一個具有6-氟-7-哌嗪基結(jié)構(gòu)的喹諾酮藥物，這種修飾進一步增強了抗菌活性，并拓寬了抗菌譜, 不僅對革蘭氏陰性細菌，而且還對金黃色葡萄球菌和鏈球菌等革蘭氏陽性細菌，以及衣原體和支原體等病原體具有很好的抑制作用，廣泛應(yīng)用于臨床的消化道、呼吸道、泌尿生殖道和創(chuàng)傷性細菌感染治療。

1.4 第四代喹諾酮類藥物 以莫西沙星為代表。莫西沙星(圖1)保留了第三代C-6位的氟原子和C-7位的3-氨基吡咯烷基結(jié)構(gòu)，并增加了C-8位的甲氧基結(jié)構(gòu)。其毒性更低、抗菌活性更強、抗菌譜更廣，且對厭氧菌有較好的抗菌活性，被稱為超廣譜抗菌藥物。

圖1 氯喹及部分喹諾酮類藥物分子結(jié)構(gòu)圖

2 喹諾酮類藥物抗菌機制

2.1 拓撲異構(gòu)酶Ⅱ的功能 在細菌DNA復(fù)制過程中，拓撲異構(gòu)酶Ⅱ?qū)τ谡{(diào)節(jié)DNA拓撲結(jié)構(gòu)至關(guān)重要，細菌拓撲異構(gòu)酶Ⅱ包括DNA促旋酶(gyrase)和拓撲異構(gòu)酶Ⅳ(topoisomerase Ⅳ)，絕大多數(shù)細菌都同時擁有這兩個酶，但有少數(shù)細菌例外，如分枝桿菌僅有DNA促旋酶[2]。DNA促旋酶和拓撲異構(gòu)酶Ⅳ都是A2B2型的異源四聚體，革蘭氏陰性菌和革蘭氏陽性菌的DNA促旋酶均為GyrA2GyrB2，革蘭氏陰性菌和革蘭氏陽性菌的拓撲異構(gòu)酶Ⅳ分別為ParC2ParE2和GrlA2GrlB2[3-4]。DNA促旋酶和拓撲異構(gòu)酶Ⅳ與DNA結(jié)合，使雙鏈DNA斷裂，從而引入負超螺旋，解除超螺旋DNA拓撲張力及復(fù)制叉前端超螺旋DNA的扭力，隨后的基于復(fù)制叉的DNA半保留不連續(xù)復(fù)制才能順利進行，此時，拓撲異構(gòu)酶Ⅱ的酪氨酸殘基與DNA斷裂形成的5′末端共價結(jié)合，形成酶-斷裂DNA的共價復(fù)合物，DNA復(fù)制完成后，拓撲異構(gòu)酶Ⅱ再將斷裂的雙鏈DNA重新連接起來，并在拓撲異構(gòu)酶Ⅳ作用下，分配到新生子代細菌細胞中[5-7]。

2.2 抗菌機制 喹喏酮類藥物正是通過抑制拓撲異構(gòu)酶Ⅱ型的功能，進而阻斷DNA復(fù)制，發(fā)揮抑菌作用，DNA促旋酶和拓撲異構(gòu)酶Ⅳ分別于1977年和1990年確認為喹喏酮類藥物的靶酶[8-9]。

Wohlkonig等[10]通過制備并解析莫西沙星-鮑曼不動桿菌拓撲異構(gòu)酶Ⅳ-斷裂DNA復(fù)合物的晶體結(jié)構(gòu)(圖2)，發(fā)現(xiàn)藥物的C-3/C-4酮酸基螯合了非催化金屬離子(Mg2+)，非催化金屬離子(Mg2+)與4個水分子配位，水分子與拓撲異構(gòu)酶Ⅳ關(guān)鍵位點氨基酸(Ser84和Glu88)形成氫鍵。通過水-金屬離子橋介導(dǎo)，莫西沙星與拓撲異構(gòu)酶Ⅳ結(jié)合，阻礙酶的正常功能，導(dǎo)致DNA無法復(fù)制。環(huán)丙沙星的作用機制與此相似[11]。此外，喹喏酮類藥物還可以非共價結(jié)合于DNA促旋酶或拓撲異構(gòu)酶Ⅳ-斷裂DNA的缺口處，阻斷后續(xù)的DNA再連接，導(dǎo)致DNA永久性斷裂[12]。

圖2 莫西沙星-鮑曼不動桿菌拓撲異構(gòu)酶Ⅳ-斷裂DNA復(fù)合物的晶體結(jié)構(gòu)(PBD: 2XKK)

3 細菌對喹諾酮類藥物的抗性機制

隨著喹諾酮類藥物的廣泛使用，細菌已演化出針對該類藥物的耐藥性，其抗性機制主要有基因突變、保護、抗生素修飾等，相應(yīng)的抗性基因位于染色體或質(zhì)粒上。

3.1 染色體靶酶的編碼基因突變 DNA促旋酶和拓撲異構(gòu)酶Ⅳ最常見的突變位點為錨定水-金屬離子橋的絲氨酸和酸性氨基酸殘基，突變導(dǎo)致藥物與靶酶的結(jié)合能力大幅度下降，但不影響靶酶的功能。大腸桿菌GyrA的大多數(shù)突變都發(fā)生在氨基末端區(qū)域(Ala67-Gln106)，故該區(qū)域又被稱為GyrA的喹諾酮抗性決定區(qū)(Determining Region of Quinolone Resistance，QRDR)，且最常見的突變位點為Ser83，其次為Asp87；其他種類細菌的GyrA和ParC都有一個等效的絲氨酸和酸性殘基，其喹諾酮耐藥菌株也常是這些位點發(fā)生突變[13-14]。GyrB和ParE特定區(qū)域的氨基酸突變也會導(dǎo)致細菌的喹諾酮耐藥，但臨床耐藥分離株的GyrB和ParE的突變比GyrA和ParC的突變少得多[15]。

3.2 染色體調(diào)節(jié)蛋白編碼基因突變 通過調(diào)節(jié)蛋白編碼基因突變，調(diào)節(jié)下游抗性基因的轉(zhuǎn)錄和表達。

3.2.1 上調(diào)下游主動外排系統(tǒng) 主動外排系統(tǒng)是耐藥菌中比較常見的耐藥機制之一，是細菌細胞內(nèi)膜上的能量依賴性外排泵蛋白。通過主動外排作用，降低胞內(nèi)藥物濃度，達到減弱或消除藥物對細菌細胞的抑制及致死作用。這種類型的抗性機制是通過上游調(diào)節(jié)蛋白的突變，上調(diào)下游主動外排系統(tǒng)的轉(zhuǎn)錄和表達，但外排泵蛋白及其編碼基因本身并不發(fā)生突變，如調(diào)節(jié)蛋白AcrR的突變上調(diào)外排泵AcrA/AcrB的表達[16]。

3.2.2 下調(diào)細菌膜孔蛋白表達，降低通透性 細菌以降低細菌膜通透性的方式增強其對抗生素滲透障礙的作用。通過改變跨膜通道孔蛋白(OMP)和脂多糖(LPS)的結(jié)構(gòu)或者數(shù)量，阻礙藥物進入，對藥物產(chǎn)生耐藥。例如，NorB、NorC、Nfxc、NfxB 和 CfxB 等的突變，下調(diào)外膜孔蛋白 OmpF表達，阻礙藥物進入細菌細胞[17]。

3.3 質(zhì)粒介導(dǎo)的喹諾酮抗性基因 與染色體抗性基因堿基突變相比，質(zhì)粒介導(dǎo)的喹諾酮抗性(Plasmid-Mediated Quinolone Resistance，PMQR)水平相對較低，但質(zhì)粒的水平傳播能力強，此外，臨床發(fā)現(xiàn)喹諾酮抗性質(zhì)粒上常常會攜帶其他藥物的抗性基因，如廣譜β-內(nèi)酰胺酶(Extended Spectrum Beta-Lactamases，ESBL)基因，這可能會導(dǎo)致喹諾酮類藥物的使用間接篩選并促進ESBL基因傳播。截至目前，PMQR基因大體可分為3類。

3.3.1 編碼重復(fù)五肽家族蛋白的qnr基因 目前已發(fā)現(xiàn)相關(guān)的抗性基因有6種，即qnrA、qnrS、qnrB、qnrC、qnrD和qnrVC。

qnrA。 Martínez等[18]1994年從阿拉巴馬大學(xué)一名患者尿液標本中分離到多重耐藥菌肺炎克雷伯菌，該菌攜帶抗性質(zhì)粒(pMG252)，從中克隆到一個長度為657 bp的喹諾酮抗性基因，蛋白命名為QnrA1。

qnrS。2003年10月，日本愛知縣發(fā)生由福氏志賀菌2b引發(fā)的食源性腸炎感染事件，2005年Hata等[19]從當時收集的臨床樣本中分離到一株環(huán)丙沙星耐藥菌株，并從該分離株中分離到一個獨特的接合型抗性質(zhì)粒，該質(zhì)粒上攜帶一個編碼218個氨基酸的環(huán)丙沙星抗性蛋白，該蛋白與QnrA1僅有59%的氨基酸一致性，命名為QnrS。

qnrB。Jacoby等[20]在調(diào)查印度肺炎克雷伯菌耐藥性時，發(fā)現(xiàn)其中幾個分離株所攜帶質(zhì)粒能夠水平轉(zhuǎn)移低水平的喹諾酮類藥物抗性，并從這些質(zhì)粒中發(fā)現(xiàn)一個抗性基因，該抗性基因編碼一個由214個氨基酸組成的多肽，該多肽與QnrA和QnrS分別僅有43%和44%的氨基酸一致性，并命名該基因為qnrB。

qnrC。王明華等[21]在研究分離自中國上海的奇異變形桿菌臨床分離菌株時，分離到可水平轉(zhuǎn)移低水平喹諾酮抗性的質(zhì)粒(pHS9)，該質(zhì)粒攜帶有一個666 bp的喹諾酮抗性基因，命名為qnrC。QnrC分別與QnrA1，QnrB1，QnrS1和QnrD有64%，41%，59%和43%的氨基酸序列一致性。

qnrD。Cavaco等[22]從中國河南省的人源腸炎沙門菌分離株中分離到一個小型質(zhì)粒，該質(zhì)?？墒勾竽c桿菌的環(huán)丙沙星MIC增加32倍，且攜帶一個編碼214個氨基酸的五肽重復(fù)蛋白的基因，命名為qnrD。

qnrVC。Fonseca等[23]于2008年首次在霍亂弧菌整合子中發(fā)現(xiàn)的一個編碼五肽重復(fù)多肽的基因，且在其他細菌的整合子或質(zhì)粒上也有存在。

除了上述首次發(fā)現(xiàn)的qnr抗性基因，后續(xù)研究發(fā)現(xiàn)它們或多或少都還存在變異體。由這些qnr基因編碼的Qnr蛋白主要發(fā)揮保護功能，一方面，通過與細菌中游離靶酶結(jié)合，減少基因組DNA上的結(jié)合靶酶數(shù)目，從而降低喹諾酮類藥物經(jīng)靶酶與DNA的結(jié)合幾率，保護細菌細胞；另一方面，通過與DNA上的靶酶結(jié)合，抑制喹諾酮類藥物進入靶酶-斷裂DNA復(fù)合物，防止DNA永久性斷裂的發(fā)生[15]。

3.3.2 外排泵蛋白編碼基因qepA。Yamane 等從住院患者尿液中的大腸桿菌分離株中, 分離到多重耐藥質(zhì)粒pHPA，該質(zhì)粒攜帶一個511個氨基酸多肽的編碼基因，命名為qepA，QepA有14個跨膜結(jié)構(gòu)域，能使大腸桿菌對萘啶酸、環(huán)丙沙星和諾氟沙星的MIC值分別增加2倍、32倍和64倍[24]。

oqxAB。Hansen等從豬糞便樣品大腸桿菌分離株中，分離到一個質(zhì)粒pOLA52，該質(zhì)粒上的oqxAB基因編碼一個多藥物外排泵，此兩個基因通常共轉(zhuǎn)錄，提供萘啶酸、環(huán)丙沙星、氯霉素等多種藥物抗性[25]。

3.3.3aac(6′)-Ib的突變體aac(6′)-Ib-cr這是一個很有意思的喹諾酮類藥物抗性基因，aac(6′)-Ib是一個氨基糖苷類抗生素的抗性基因，所編碼抗性蛋白AAC(6′)-Ib具氨基糖苷乙酰轉(zhuǎn)移酶功能。aac(6′)-Ib-cr(ciprofloxacin resistance)本質(zhì)上是aac(6′)-Ib的一個突變體，其編碼區(qū)5′端增加了12個堿基，編碼一個172個氨基酸的多肽，與AAC(6′)-Ib相比，AAC(6′)-Ib-cr發(fā)生了Trp102Arg 和Asp179Tyr兩個氨基酸位點的突變，野生型和突變體的氨基糖苷乙酰轉(zhuǎn)移酶功能均正常，但是，突變體AAC(6′)-Ib-cr對喹諾酮類藥物中的諾氟沙星和環(huán)丙沙星具有抗性，進一步的研究發(fā)現(xiàn)，該突變體酶的作用機制是對哌嗪環(huán)上的亞氨基進行乙酰化修飾，而現(xiàn)有喹諾酮類藥物中，只有諾氟沙星和環(huán)丙沙星有此結(jié)構(gòu)[26]。

喹諾酮類藥物是人工合成的抗菌藥，廣泛應(yīng)用于醫(yī)學(xué)臨床和畜牧業(yè)生產(chǎn)，細菌必然會演化各種抗性機制，并通過抗性基因編碼的抗性蛋白呈現(xiàn)對喹諾酮類藥物的抗性表型，而抗性基因具垂直和水平傳播特性，因此，發(fā)現(xiàn)并研究新的抗性機制和抗性基因?qū)⒂兄诜揽剜Z酮耐藥菌。首先，新的抗性機制的發(fā)現(xiàn)往往伴隨新的抗性基因的發(fā)現(xiàn)，例如，AAC(6′)-Ib-cr的發(fā)現(xiàn)，在Robicsek等[26]發(fā)現(xiàn)AAC(6′)-Ib-cr的喹諾酮抗性之前，AAC(6′)-Ib-cr長期被誤認為只是氨基糖苷類抗生素的抗性蛋白，但實際上AAC(6′)-Ib-cr可對臨床廣泛使用的諾氟沙星和環(huán)丙沙星進行分子修飾，降低藥效，表現(xiàn)抗性。其次，發(fā)現(xiàn)新的抗性基因或已有抗性基因的突變體，將有助于研究這些抗性基因在醫(yī)學(xué)臨床、動物生產(chǎn)、食品生產(chǎn)和環(huán)境等領(lǐng)域的分布和豐度，同時結(jié)合抗性基因在基因組上的定位，在染色體上，還是在質(zhì)粒上，將有助于研究相關(guān)抗性基因的傳播機制，評估其健康危害和風(fēng)險。最后，根據(jù)抗性基因的核苷酸序列，可以利用現(xiàn)代分子生物學(xué)手段，定向破壞抗性基因，消除特定抗性使其致敏，并阻斷抗性基因的傳播，達到防控耐藥菌的目的，例如，利用CRISPR基因編輯技術(shù)，Bikard等[27]靶向破壞金黃色葡萄球菌質(zhì)粒上的甲氧西林抗性基因mecA，Citorik等[28]靶向破壞腸出血性大腸桿菌攜帶的碳青霉烯類抗生素抗性基因blaNDM-1，國內(nèi)吉林大學(xué)Dong等[29]靶向破壞大腸桿菌攜帶的質(zhì)粒介導(dǎo)的粘菌素抗性基因mcr-1。抗性基因的溯源、傳播機制、風(fēng)險評估和阻斷策略是目前我國防控耐藥細菌的幾個需要重點關(guān)注和研究的問題。