涼山州腹瀉仔豬豬圓環(huán)病毒2型感染情況調查

韓松偉，郝桂英*，何金川，王 輝，蒲響林，郭嘉玲，曾令強，張 濤，周國燕，黃劍鋒

(1.西昌學院動物科學學院，四川西昌 615013；2.涼山州畜牧獸醫(yī)科學研究所，四川西昌 615000)

豬圓環(huán)病毒2型(Porcine circovirus type 2，PCV2)屬于圓環(huán)病毒科(Circoviridae)圓環(huán)病毒屬(Circovirous)，為無囊膜的單股負鏈環(huán)狀DNA病毒，是已知最小的動物病毒之一[1]，也是當今危害世界養(yǎng)豬業(yè)的重要病原之一[2]。

PCV2可引起斷奶仔豬多系統(tǒng)衰竭綜合征(postweaning multisystemic wasting syndrome，PMWS)、豬呼吸道病綜合征(porcine respiratory disease complex，PRDC)、豬皮炎與腎病綜合征(porcine dermatitis and nephropathy syndrome，PDNS)、增生性壞死性肺炎(proliferative and necrotizing pneumonia，PNP)、豬壞死性淋巴結炎(PNL)、新生仔豬先天性震顫(congenital tremors of piglet，PCT)及母豬繁殖障礙(reproductive failure)等豬圓環(huán)病毒相關疾病(porcine circovirus associated diseases，PCVADs)[3-5]。另外，PCV2可導致感染豬免疫抑制，易引發(fā)其他病原混合感染或繼發(fā)感染，給養(yǎng)豬業(yè)造成巨大的經(jīng)濟損失，已引起世界各國的廣泛關注。

PCV2基因組包含11個可能的開放閱讀框(ORF1-ORF11)，其中ORF2全長702 bp或705 bp，編碼病毒的核衣殼蛋白——Cap蛋白(capsid protein)，并參與宿主的免疫應答和病毒復制[6]。由于PCV2全基因組的大部分突變區(qū)主要集中在ORF2基因，因此，ORF2常用于PCV2分子流行病學調查的標記[7]。

目前PCV2在四川省涼山彝族自治州豬群的感染情況尚不清楚，僅見鹽源縣有報道[8]。因此，本研究于2017-2019年共采集西昌市和喜德縣7個豬場57份腹瀉仔豬糞便樣品及28只病死仔豬病變組織樣品(淋巴結、肺臟、肝臟、脾臟、腎臟等)，通過PCR擴增PCV2的ORF2基因片段，并對PCR陽性擴增產(chǎn)物進行序列測定及分析，以了解PCV2在涼山州的流行情況，進一步豐富該病毒流行病學調查的相關數(shù)據(jù)，以期為PCV2的防控提供參考。

1 材料與方法

1.1 病料采集 2017年4月-2019年6月對涼山州西昌市和喜德縣7個豬場的發(fā)病豬群進行病料采集，共采集85份樣品：腹瀉仔豬糞便樣品57份、組織樣品28套。組織樣品采集自臨床表現(xiàn)腹瀉、咳嗽、呼吸困難、消瘦的28只病死仔豬的淋巴結、肺臟、肝臟、脾臟、腎臟等，編號后帶回實驗室-60 ℃保存?zhèn)溆?。其中西昌?#豬場5份(均為糞便，標記為XCXY1～XCXY5)、2#豬場10份(9份糞便、1套病變組織，標記為XCKX1～XCKX10)、3#豬場9份(6份糞便、3套病變組織，標記為XCZL1～XCZL9)、4#豬場25份(10份糞便、15套病變組織，標記為XCXR1～XCXR25)、5#豬場3份(3套病變組織，標記為XCHT1～XCHT3)，喜德縣1#豬場22份(16份糞便、6套病變組織，標記為XDZY1～XDZY22)、2#豬場11份(均為糞便，標記為XDCY1～XDCY11)。

1.2 主要試劑 病毒基因組DNA/RNA提取試劑盒、DL2000 DNA Marker、GreenView核酸染料、2×Taq PCR Master Mix等均購自天根生化科技(北京)有限公司。

1.3 總DNA的提取 取采集的病死豬病變組織0.5 g，加入2倍體積滅菌生理鹽水用球磨儀進行勻漿，反復凍融3次；糞便樣品取適量裝入干凈的EP管中，加入2倍體積滅菌生理鹽水制成懸浮液，反復凍融3次；將凍融好的樣品漩渦振蕩混勻，12000 r/min離心10 min，取200 μL上清液于干凈的EP管中，按照病毒基因組DNA/RNA試劑盒說明書提取總DNA，-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 PCR檢測及序列測定 參考索朗扎西等[9]報道的一對擴增PCV2 ORF2基因片段的特異性引物進行檢測。上游引物F：5’-CGGATATTGTAGTCCTGGTCG-3’，下游引物R：5’-ACTGTCAAGGCTACCACAGTCA-3’，預期擴增片段大小為481 bp。引物由上海杰李生物技術有限公司合成。

PCR擴增體系50 μL：2×Taq PCR Master Mix 25 μL，上、下游引物(10 pmol/μL)各2 μL，模板DNA 2 μL，ddH2O 19 μL；擴增條件：94 ℃預變性5 min；94 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，35個循環(huán)；72 ℃延伸6 min。反應結束后分別取5 μL PCR擴增產(chǎn)物用10 g/L瓊脂糖凝膠電泳，用凝膠成像系統(tǒng)檢測目的條帶的有無及大小。將陽性PCR產(chǎn)物送上海杰李生物技術有限公司測序。

1.5 序列分析 檢索GenBank收錄的PCV2 ORF2基因序列并下載(表1)，用DNAstar Lasergene7.1軟件中的MegAlign程序將本研究的序列與下載的PCV2參考毒株 ORF2基因序列進行核苷酸和氨基酸同源性比對；用MEGA 5.0軟件進行遺傳進化分析，采用Neighbor-Joining(NJ)法生成系統(tǒng)進化樹。

表1 PCV2 參考毒株ORF2基因序列信息

2 結果與分析

2.1 PCR檢測結果 PCV2總陽性率為25.9%(22/85)，其中西昌市1#-5#豬場和喜德縣1#-2#豬場的陽性率分別為0%(0/5)、80%(8/10)、11.1%(1/9)、44%(11/25)、0%(0/3)、4.5%(1/22)和9.1%(1/11)。陽性豬場占71.4%(5/7)，其中糞便、病變組織陽性率分別為29.8%(17/57)和17.9%(5/28)，西昌市、喜德縣發(fā)病豬群的陽性率分別為38.5%(20/52)和6.1%(2/33)。

2.2 ORF2基因部分序列的分析 將22個陽性樣品的測序序列對齊剪切多余序列后，長度均為459 bp，不存在插入/缺失，核苷酸同源性為92.8%～100%，其中XCKX1與XCKX2、XCKX3、XCKX4、XCKX10序列相同，XCKX7與XCKX9序列相同，XCXR4與XCXR6、XCXR16、XCXR17、XCXR18、XCXR19序列相同。因此，本研究共獲得12個不同的測序序列，與GenBank下載的PCV2參考毒株核苷酸序列同源性為86.7%～99.8%(圖1)。

本研究獲得的ORF2氨基酸序列同源性為93.5%～100%，有11個氨基酸發(fā)生了變異，與GenBank下載的PCV2 ORF2的氨基酸序列同源性為85.1%～99.4%(圖2)。

圖1 ORF2基因部分序列核苷酸同源性比較

圖2 ORF2基因部分序列氨基酸同源性比較

2.3 基于ORF2基因部分序列構建的系統(tǒng)進化樹基于ORF2基因部分序列(459 bp)構建的NJ樹(圖3)顯示，46個PCV2 ORF2基因部分序列分成三大支，未形成明顯的地理分支。其中Slovak株(斯洛伐克，JN133305)單獨為一支，與其他PCV2分離株親緣關系遠；在22個測序序列中，XDCY7和XCZL9單獨聚為一支，與墨西哥參考毒株(JQ034426)親緣關系最近，與國內(nèi)云南分離株、貴州分離株、山東分離株親緣關系較近；其余的20個序列均聚在另一支上，與NIVS-1株(塞爾維亞，HQ378157，PCV2d亞型)親緣關系最近，與國內(nèi)的四川分離株、福建分離株、河北分離株等親緣關系較近。根據(jù)遺傳進化樹，將XDCY7和XCZL9推導為PCV2b亞型，其余20個樣品推導為PCV2d亞型。

圖3 基于PCV2 ORF2基因片段核酸序列的系統(tǒng)發(fā)育分析

3 討論與結論

由于PCV2單獨感染導致豬只大批死亡現(xiàn)象較少見，因此很多養(yǎng)豬場對豬圓環(huán)病毒病不夠重視。PCV2對養(yǎng)豬業(yè)的危害呈逐年上升趨勢，豬圓環(huán)病毒病已成為目前危害豬場健康發(fā)展的重要疫病之一，曾被我國農(nóng)業(yè)部規(guī)定為二類動物疫病。

已有許多學者開展了PCV2分子流行病學調查，且國內(nèi)不同地方PCV2感染的分子檢測率有差異。吳璦等[10]報道江蘇省金華地區(qū)PCV2感染陽性檢出率為59.8%(61/102)；劉濤等[11]報道河南省信陽地區(qū)220份病料(其中50份為血清)的陽性檢出率為36.8%(81/220)；李海超等[12]報道山東、廣西等8省送檢的病料平均陽性檢出率為71.4%(162/227)，其中安徽最高(100%，11/11)，山東最低(50%，8/16)；鄧靜等[13]報道四川省11市的平均陽性檢出率為70.7%，其中樂山市為100%；張智明等[14]報道黑龍江多個地區(qū)平均陽性檢出率為78.46%；趙軍等[15]報道四川省13市平均陽性檢出率為71.55%，其中攀枝花市陽性率最高(88.89%)；焦文強等[16]報道河南及周邊地區(qū)平均陽性檢出率為43.7%(69/158)；翟寶庫等[17]報道大慶市5區(qū)4縣5家病豬場和6家屠宰場448套組織樣本平均陽性檢出率為22.32%(100/448)；王利麗等[18]報道天津、河北和北京10個地區(qū)平均陽性檢出率為32.5%(117/360)，其中天津市、河北省和北京市通州區(qū)分別為25.0%～37.1%、28.0%～38.1%和26.3%；何長生等[19]報道安徽省8個縣(區(qū))17個健康豬群439份生豬扁桃體樣品平均陽性檢出率為23.0%(101/439)。

涼山彝族自治州地處四川省西部，養(yǎng)殖條件較為落后，規(guī)?；i場較少。本次調查結果表明，涼山州西昌市和喜德縣PCV2感染的平均陽性檢出率為25.9%，且西昌市豬群的陽性率高于喜德縣，但均稍低于四川省其他地區(qū)的檢出率。周厚繼等[8]報道鹽源縣平均陽性檢出率為78.52%(106/135)；王剛等[20]報道樂山市定點屠宰生豬脾臟樣品陽性檢出率為68.1%(109/160)；李海全等[21]報道四川省7個市縣14個豬場的平均陽性檢出率為49.2%(89/181)，且14個豬場均檢出了陽性。本次調查的陽性豬場占71.4%(5/7)，說明西昌市和喜德縣豬群PCV2感染已比較普遍，應引起獸醫(yī)主管部門、技術人員和養(yǎng)殖戶的重視，加強對該病的防控工作因此，在涼山州對豬群采取有效的綜合防控措施。PCV2感染防控工作包括：(1)制定科學的免疫程序。建議懷孕母豬在懷孕第10周和12周各免疫1次；后備母豬和青年公豬配種前免疫1次，間隔2周后再免疫1次；仔豬在5周齡和7周齡各免疫1次，如果母豬未免疫，則提前至2周齡和4周齡免疫[22]。由于本研究檢測時僅選擇了ORF2基因部分序列進行擴增，因此不能準確地推導出涼山州PCV2流行的基因型，但根據(jù)遺傳進化樹，推導有PCV2b和PCV2d兩種亞型，且以PCV2d亞型為主。(2)加強日常飼養(yǎng)管理和衛(wèi)生消毒工作，減少應激因素。如：嚴格引種檢疫，實行全進全出制度；嚴禁不同大小、批次豬只混養(yǎng)；保證初生仔豬吸吮初乳，提高仔豬抗病力；注意通風和保溫，禁止飼喂霉變飼料；定期滅鼠、滅蚊，無害化處理污物；保持圈舍清潔衛(wèi)生，建立消毒制度等。(3)定期開展PCV2檢測工作，及時淘汰隱性感染豬只。建議每季度開展1次PCV2血清抗體檢測，每半年進行1次PCV2病原檢查，及時挑出和淘汰隱性感染豬只。(4)合理選用一些既有免疫增強功能，又有抗病毒、細菌等的中草藥制劑或其他藥物，以提高豬群抵抗力，防止豬群繼發(fā)感染。