實(shí)驗(yàn)動(dòng)物糞便中金黃色葡萄球菌和沙門菌檢驗(yàn)方法的比較

王秀麗，辛凌翔，李建，張一幟，李俊平，張媛

(中國(guó)獸醫(yī)藥品監(jiān)察所，北京 100081)

金黃色葡萄球菌為革蘭氏陽(yáng)性球菌，可寄生于牛、豬、兔、雞和人等。在實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中，家兔最為敏感，豚鼠、大鼠、小鼠也可感染發(fā)病[1]。沙門菌為革蘭氏陰性桿菌，可以引起多種動(dòng)物的腸道感染，因此沙門菌病又稱“副傷寒”或“腸道病”[2]。金黃色葡萄球菌和沙門菌檢驗(yàn)是實(shí)驗(yàn)動(dòng)物糞便微生物檢驗(yàn)、化妝品微生物檢驗(yàn)、食品微生物檢驗(yàn)中的重要檢驗(yàn)參數(shù)，對(duì)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物和人類健康均具有十分重要的公共衛(wèi)生學(xué)意義。兩種菌的傳統(tǒng)檢驗(yàn)主要靠細(xì)菌的形態(tài)、培養(yǎng)特性、生化特性、血清學(xué)特性等，方法繁瑣、耗時(shí)較長(zhǎng)，且受檢驗(yàn)人員能力和經(jīng)驗(yàn)等因素的影響。隨著分子生物學(xué)技術(shù)研究的深入和發(fā)展，PCR指紋圖譜、核酸雜交、16S rRNA序列分析、脈沖場(chǎng)凝膠電泳等技術(shù)也逐漸在細(xì)菌鑒定中應(yīng)用。本研究結(jié)合現(xiàn)代化的生化鑒定儀器及分子生物學(xué)方法，比較了不同方法鑒定結(jié)果的準(zhǔn)確性，并制定了本實(shí)驗(yàn)室微生物鑒定程序。

1 材料與方法

1.1 樣品 含金黃色葡萄球菌和沙門菌的糞便盲樣，編號(hào)為0041、0065、0110、0179、0194，由中國(guó)食品藥品檢定研究院提供。

1.2 培養(yǎng)基及試劑 SS瓊脂平板、Baird-Parker平板、馬丁瓊脂血平板、凍干兔血漿、革蘭氏染色試劑盒均購(gòu)自青島海博生物技術(shù)有限公司；馬丁肉湯、普通肉湯購(gòu)自北京中海生物科技有限公司；裂解血細(xì)胞全血由中國(guó)獸醫(yī)藥品監(jiān)察所細(xì)菌制品檢測(cè)室制備；健康牛血清購(gòu)自gibco公司；27F和1492R引物合成及PCR產(chǎn)物測(cè)序由華大基因完成；PCR 2×buffer mix購(gòu)自TaKaRa；ATB ID32E腸桿菌科和其他革蘭氏陰性桿菌鑒定試紙條、Staph葡萄球菌和微球菌鑒定試紙條購(gòu)自生物梅里埃法國(guó)股份有限公司。

1.3 細(xì)菌分離純化及形態(tài)檢查 將糞便樣品分別用生理鹽水溶解后，用接種環(huán)挑取少量菌液劃線接種含0.4% 裂解血細(xì)胞全血和10% 血清的馬丁瓊脂平板，37 ℃培養(yǎng)24 h，觀察是否純粹生長(zhǎng)，如果生長(zhǎng)出形態(tài)不同的菌落，分別挑取單菌落劃線接種上述馬丁瓊脂平板，對(duì)純化的菌落分別革蘭氏染色，觀察細(xì)菌形態(tài)，同時(shí)將溶解后的糞便樣品接種含10% 血清的馬丁肉湯、普通肉湯，37 ℃培養(yǎng)18 h，觀察在液體培養(yǎng)基中的生長(zhǎng)特性。

1.4 國(guó)標(biāo)法 參考GB/T14926.14-2001金黃色葡萄球菌檢測(cè)方法[3]，將樣品接種于高鹽甘露醇培養(yǎng)基，37 ℃培養(yǎng)18～24 h，挑取1 mm左右、黃色且周邊培養(yǎng)基由紅變黃的菌落接種血瓊脂平板，37 ℃培養(yǎng)18～24 h，形成白色或者金黃色不透明、表面光滑、周圍有β容血環(huán)的菌落，且甘露醇發(fā)酵試驗(yàn)和血漿凝固酶試驗(yàn)陽(yáng)性的，即可判定為金黃色葡萄球菌。參考GB/T14926.1-2001沙門菌檢測(cè)法[4]，將樣品接種于SS培養(yǎng)基，挑取可疑菌落接種KI、H2S、靛基質(zhì)、尿素，賴氨酸脫羧培養(yǎng)基，37 ℃培養(yǎng)18～24 h，再結(jié)合革蘭氏染色及血凝試驗(yàn)綜合判定。

1.5 生化試紙條鑒定法 按照1.3項(xiàng)的方法純化出樣品中含有的細(xì)菌并進(jìn)行細(xì)菌形態(tài)檢查，用ATB ID32E生化鑒定試紙條對(duì)革蘭氏陰性桿菌進(jìn)行生化鑒定，用Staph生化鑒定試紙條對(duì)革蘭氏陽(yáng)性菌進(jìn)行生化鑒定。

1.6 16S rRNA序列分析法 將按照1.3項(xiàng)純化的菌落用細(xì)菌16S rRNA的通用引物27F和1492R擴(kuò)增，PCR反應(yīng)程序?yàn)?8 ℃ 1 min，98 ℃ 10 s，56 ℃10 s，72 ℃ 2 min，30個(gè)循環(huán)后72 ℃ 10 min，將擴(kuò)增片段測(cè)序，在GenBank中比對(duì)，確定細(xì)菌類別。

1.7 鑒別檢驗(yàn) 根據(jù)金黃色葡萄球菌有耐高鹽及在BP平板上的特殊的菌落形態(tài)，將樣品接種于含7.5% NaCl的肉湯培養(yǎng)基，37 ℃ 170 r/min振蕩培養(yǎng)24 h，同時(shí)將樣品接種于BP瓊脂平板，37 ℃培養(yǎng)24 h，可以篩選金黃色葡萄球菌[5]。

2 結(jié)果與分析

2.1 細(xì)菌分離純化及形態(tài)檢查 結(jié)果見表1。經(jīng)檢定，編號(hào)為0110的樣品和0179的樣品中均有2種不同形態(tài)的細(xì)生長(zhǎng)，編號(hào)為0041、0065、0194的樣品均純粹生長(zhǎng)，為一種細(xì)菌，0065樣品在加入10%血清的馬丁肉湯生長(zhǎng)后沉淀到試管底部，上層培養(yǎng)基澄清，在普通肉湯中均勻混濁生長(zhǎng)。

表1 樣品中細(xì)菌分離純化及細(xì)菌形態(tài)檢查結(jié)果

2.2 生化鑒定 表2結(jié)果顯示，0041、0065、0110-1、0110-2、0179-1、0179-2、0194樣品的鑒定結(jié)論均為好或極好，結(jié)果可信。

2.3 16S rRNA序列分析 將分離純化的細(xì)菌分別擴(kuò)增16S rRNA序列，均擴(kuò)增出大小約1500 bp的條帶，經(jīng)測(cè)序比對(duì)，樣品中含有的細(xì)菌類別見表3。

表2 生化鑒定結(jié)果

2.4 國(guó)標(biāo)法 金黃色葡萄球菌的檢測(cè)根據(jù)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)的方案鑒定結(jié)果見表4。沙門菌的檢測(cè)根據(jù)國(guó)標(biāo)的方法所有的樣品在SS培養(yǎng)基上生長(zhǎng)均未長(zhǎng)出無色半透明的菌落，因此未進(jìn)行下去。

表3 16S rRNA序列比對(duì)結(jié)果

表4 金黃色葡萄球菌的檢測(cè)結(jié)果

2.5 鑒別檢驗(yàn) 5份樣品在7.5% NaCl肉湯培養(yǎng)基中37 ℃ 170 r/min培養(yǎng)16 h后無菌生長(zhǎng)，延長(zhǎng)培養(yǎng)至24 h，菌液均勻混濁，挑取菌液劃線接種高鹽甘露醇培養(yǎng)基，0041和0110樣品生長(zhǎng)出黃色圓形菌落，0065、0194和0179樣品均生長(zhǎng)出黃色水滴狀的菌落，經(jīng)鑒定，黃色水滴狀菌落為地衣芽孢桿菌，說明樣品中的金黃色葡萄球菌在高鹽肉湯培養(yǎng)基中不生長(zhǎng)。將樣品按照1.3項(xiàng)純化后經(jīng)革蘭氏染色陽(yáng)性球菌接種Baird-Parker平板，結(jié)果顯示0065和0110樣品中的灰白色菌落和0179樣品中的革蘭氏陽(yáng)性球菌為圓形、光滑、凸起、濕潤(rùn)、灰色或黑色、周圍有渾濁帶，在其外層有一透明帶，符合大部分金黃色葡萄球菌的特征。0110樣品中黃色菌落接種Baird-Parker培養(yǎng)基后菌落形態(tài)為黑色光滑菌落，周邊無不透明圈，結(jié)果見表5。

表5 鑒別檢驗(yàn)結(jié)果

3.6 檢驗(yàn)結(jié)果報(bào)告 根據(jù)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)檢測(cè)，用生化檢定試紙條檢測(cè)和16S rRNA序列分析法檢測(cè)樣品中金黃色葡萄球菌和沙門菌的結(jié)果見表6。國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)的方法無法將0194樣品中的沙門菌檢測(cè)出，也無法將0110樣品中的金黃色葡萄球菌檢測(cè)出。

表6 3種檢測(cè)方法檢驗(yàn)結(jié)果比較

3 討論與結(jié)論

中國(guó)食品藥品檢定研究院組織的能力驗(yàn)證項(xiàng)目——實(shí)驗(yàn)動(dòng)物糞便中金黃色葡萄球菌和沙門菌的檢驗(yàn)，不限定方法，提供的作業(yè)指導(dǎo)書為實(shí)驗(yàn)動(dòng)物糞便中微生物檢測(cè)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)(2001年)。本檢驗(yàn)參考國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)存在以下問題：沙門菌和在SS培養(yǎng)基上生長(zhǎng)的形態(tài)為粉紅色菌落，與國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)描述的無色半透明菌落不一致；0110樣品中的金黃色葡萄球菌不凝固兔血漿。根據(jù)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)判定不能準(zhǔn)確檢出樣品中的細(xì)菌。文獻(xiàn)報(bào)道的可用于金黃色葡萄球菌鑒別檢驗(yàn)的培養(yǎng)特性，如耐高鹽、血漿凝固酶陽(yáng)性或在Baird-Parker平板上生長(zhǎng)特性，是大部分而不是全部金黃色葡萄球菌具有的特性，不含血漿凝固酶的金黃色葡萄球菌血漿凝固酶試驗(yàn)陰性，不分解脂肪的金黃色葡萄球菌在Baird-Parker平板上的生長(zhǎng)形態(tài)為圓形、光滑、凸起、濕潤(rùn)、黑色、周圍有渾濁帶，在其外層有一透明帶[1，5]。

隨著科學(xué)技術(shù)的不斷發(fā)展，新的微生物鑒定技術(shù)也不斷出現(xiàn)，尤其分子生物學(xué)的方法的不斷發(fā)展，其快速、準(zhǔn)確的優(yōu)勢(shì)不斷得到認(rèn)可，如化妝品出入境檢疫的行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)中已應(yīng)用PCR方法[6]。另外生化鑒定結(jié)合儀器及數(shù)據(jù)庫(kù)的應(yīng)用，也能為細(xì)菌的鑒定提供科學(xué)有效的方法[7]。本研究的數(shù)據(jù)可以為化妝品中微生物檢驗(yàn)、食品中微生物和實(shí)驗(yàn)動(dòng)物清潔度控制的國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)和行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)的修訂提供參考數(shù)據(jù)。

供樣單位制備樣品的糞便為SPF大鼠的糞便，糞便未經(jīng)滅菌處理，在糞便中添加沙門菌、金黃色葡萄球菌、木糖葡萄球菌及摩根菌等制備而成。樣品0110中未添加金黃色葡萄球菌，而本實(shí)驗(yàn)室檢出的金黃色葡萄球菌可能為大鼠糞便中本身攜帶的金黃色葡萄球菌，因此其細(xì)菌特性與添加的金黃色葡萄球菌的特性不一致，本結(jié)果與供樣單位對(duì)留存樣品再測(cè)結(jié)果一致。

本試驗(yàn)總結(jié)出的檢驗(yàn)方法如下：首先將樣品溶解后接種營(yíng)養(yǎng)成分比較豐富的馬丁瓊脂平板(含0.1%裂解血和10%健康動(dòng)物血清)，將樣品中含有的菌盡量全部培養(yǎng)起來，觀察菌落形態(tài)，判定樣品中的細(xì)菌是否純粹，如果有一種以上不同形態(tài)的菌，分別挑取不同形態(tài)的菌劃線接種平板，純化培養(yǎng)后對(duì)細(xì)菌分別進(jìn)行鑒定。先對(duì)純化的細(xì)菌進(jìn)行革蘭氏染色，觀察細(xì)菌形態(tài)，如果為革蘭氏陰性桿菌則用ATB ID32E試紙條進(jìn)行生化鑒定，如果為革蘭氏陽(yáng)性球菌，則選擇Staph試紙條進(jìn)行生化鑒定，或者對(duì)純化出的菌用27F和1492R引物對(duì)擴(kuò)增細(xì)菌的16S rRNA，擴(kuò)增出的序列與GenBank中的序列比對(duì)，即可得知細(xì)菌的屬種。該檢驗(yàn)方法較簡(jiǎn)單快速準(zhǔn)確可行。