一種治療奶牛陰道炎癥微生態(tài)制劑的臨床藥效學(xué)研究

張林沖，賀鳳英，程 超,3*

(1.金宇保靈生物藥品有限公司，呼和浩特 010030；2.內(nèi)蒙古雙奇藥業(yè)股份有限公司，呼和浩特 010010；3.內(nèi)蒙古集寧師范學(xué)院，內(nèi)蒙古集寧 012000)

奶牛生殖道炎癥是奶牛養(yǎng)殖業(yè)最常見(jiàn)的疾病之一，可引起奶牛繁殖障礙等疾病，給畜牧業(yè)造成極大經(jīng)濟(jì)損失。隨著診療技術(shù)的發(fā)展，人們逐漸發(fā)現(xiàn)奶牛生殖道炎癥多數(shù)是由奶牛陰道炎癥繼發(fā)感染而引起的。目前，治療奶牛陰道炎癥多數(shù)使用中藥及抗生素，但由此也導(dǎo)致了細(xì)菌耐藥性及殘留等問(wèn)題。因此，尋找中藥及抗生素以外的途徑治療奶牛陰道炎癥已成為人們關(guān)注的熱點(diǎn)。

微生態(tài)制劑是利用其所治療部位正常的益生菌成員，尤其是此部位的優(yōu)勢(shì)菌株制成的活菌微生物制劑，不僅具有抑菌功能，還具有增強(qiáng)機(jī)體免疫力等益生功能，且不易引起細(xì)菌耐藥性，對(duì)人畜無(wú)毒副作用，因此益生乳酸菌制成的微生態(tài)制劑已被廣泛應(yīng)用于臨床實(shí)踐，在維持或調(diào)整機(jī)體微生態(tài)平衡、防治疾病方面發(fā)揮了重要作用，但是利用微生態(tài)制劑治療牛體生殖道炎癥的報(bào)道則較少。有研究表明，乳酸菌菌株接種于奶牛炎性子宮，可減少奶牛陰道膿性分泌物[1]，降低子宮感染的發(fā)生率，激發(fā)奶牛子宮內(nèi)膜的細(xì)胞防御機(jī)制，調(diào)節(jié)局部和全身免疫反應(yīng)，提高繁殖性能[2]。

本研究以患有陰道炎癥的奶牛作為試驗(yàn)對(duì)象，將健康奶牛陰道內(nèi)分離篩選出的具有抑菌特性的優(yōu)勢(shì)菌株約氏乳桿菌SQ0048菌株所制備成的微生態(tài)制劑應(yīng)用于患牛陰道內(nèi)，觀察檢測(cè)此微生態(tài)制劑對(duì)臨床型奶牛陰道炎癥的影響，評(píng)價(jià)療效，以便為其在臨床上的合理應(yīng)用提供試驗(yàn)依據(jù)。

1 材 料

1.1 試驗(yàn)動(dòng)物 選擇經(jīng)獸醫(yī)診斷的無(wú)抗菌藥物用藥史的患陰道炎癥的成年荷斯坦奶牛25頭，體重均為400～600 kg。

1.2 試驗(yàn)場(chǎng)所 具有一定規(guī)模性且管理規(guī)范的內(nèi)蒙古呼和浩特市托克托縣青創(chuàng)牧場(chǎng)；內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)業(yè)部動(dòng)物疫病臨床診斷與治療重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室。

1.3 菌株及藥品 約氏乳桿菌SQ0048菌株，由內(nèi)蒙古雙奇藥業(yè)股份有限公司分離、鑒定并保存，已獲專利，專利證書(shū)公告號(hào)：CN103070890B。約氏乳桿菌SQ0048微生態(tài)制劑低劑量(批號(hào)20150520)、中劑量(批號(hào)20150301)、高劑量(批號(hào)20150408)均由內(nèi)蒙古雙奇藥業(yè)股份有限公司制備。清宮促孕液(批號(hào)20150707)購(gòu)自杭州新元亨動(dòng)物藥業(yè)有限公司奶牛研究所。

1.4 主要試劑 MilliQ 水、甲醛、TEMED、Tris堿、電泳Marker(10000 bp、2000 bp)均購(gòu)自大連寶生物有限公司；尿素、甲酰胺、丙烯酰胺、雙丙烯酰胺、過(guò)硫酸銨、溴酚藍(lán)、二甲苯青、冰乙酸、EDTA、無(wú)水乙醇、甲醛均購(gòu)自上海聯(lián)碩寶為生物科技有限公司；DNA試劑盒和瓊脂糖凝膠試劑盒購(gòu)自O(shè)MEGA E.Z.N.A公司；ELISA試劑盒(批號(hào)20150427)購(gòu)自上海酶聯(lián)生物科技有限公司。

2 方 法

2.1 試驗(yàn)分組 將25頭患牛(月齡為0～70月齡之間)隨機(jī)分為5組，即陰性對(duì)照組、陽(yáng)性對(duì)照組、高劑量試驗(yàn)組、中劑量試驗(yàn)組及低劑量試驗(yàn)組，每組5頭(表1)。

表1 臨床療效觀察試驗(yàn)分組

2.2 給藥方案 患牛陰道灌注給藥。約氏乳桿菌SQ0048微生態(tài)制劑高、中、低劑量試驗(yàn)組每天陰道給藥均為5 g/袋制劑，將1袋制劑用40 mL的生理鹽水充分溶解，使用輸精槍直接灌注于奶牛陰道內(nèi)，1次/d，連續(xù)灌注9 d。陽(yáng)性對(duì)照組灌注清宮促孕液250 mL，1次/d，連續(xù)灌注9 d；陰性對(duì)照組灌注生理鹽水250 mL，1次/d，連續(xù)灌注9 d。

2.3 臨床癥狀治療效果研究 給藥前及給藥后第3、5、7、9天和停藥后第45天，觀察并記錄各組受試奶牛的臨床癥狀(精神、食欲、不良反應(yīng)、陰道及子宮的狀態(tài))、檢測(cè)陰道分泌物狀態(tài)(色澤、氣味)，給藥后2個(gè)月檢測(cè)發(fā)情率，給藥后3個(gè)月檢測(cè)受胎率。

判定標(biāo)準(zhǔn)：(1)剔除標(biāo)準(zhǔn)：患有重度、急性陰道炎癥的奶牛；(2)納入標(biāo)準(zhǔn)(入選標(biāo)準(zhǔn))：患有慢性、輕中度陰道炎癥的奶牛；(3)剝脫標(biāo)準(zhǔn)：患有重度膿性陰道炎癥的奶牛，或同時(shí)患有其他炎癥病癥的奶牛；(4)診斷標(biāo)準(zhǔn)：見(jiàn)表2；(5)治愈標(biāo)準(zhǔn)：牛體可常呈站立姿勢(shì)，眼觀外陰無(wú)紅腫，內(nèi)陰無(wú)膿性分泌物粘液流出或流出粘液為無(wú)色透明狀且無(wú)氣味；肛探陰道、子宮不腫脹、松弛，恢復(fù)正常狀態(tài)。

表2 臨床診斷標(biāo)準(zhǔn)

2.4 實(shí)驗(yàn)室細(xì)菌學(xué)治療效果研究 檢測(cè)給藥前及給藥后45 d陰道分泌物樣本微生物種屬的變化。首先使用消毒棉簽在患牛陰道穹窿后部、距宮頸2～3.5 cm 處取樣，然后將樣本立即置于無(wú)菌離心管中，冰盒冷藏。實(shí)驗(yàn)時(shí)將裝有樣本的離心管內(nèi)加入3 mL滅菌生理鹽水，漩渦震蕩洗脫，12000 r/min 離心10 min，棄掉上清液，將沉淀提取DNA，并進(jìn)行聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)。PCR引物序列為：357f：GCCGCCCGCCGCGCGCGGCGGGCGGGGCGG GGGCACGGGGGGCCTACGGGAGGCAGCAG；517r：ATTACCGCGGCTGCTGG進(jìn)行。PCR 反應(yīng)體系為(25 μL)：ddH2O 7.5 μL，2×Ultra-pfu- PCR Master Mix 12.5 μL，上游引物(10 pmol/L) 1.0 μL，下游引物(10 pmol/L)1.0 μL，Template DNA 3.0 μL。PCR 反應(yīng)條件為：95 ℃預(yù)變性10 min；94 ℃變性30 s，65 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min 共計(jì)10個(gè)循環(huán)；94 ℃變性30 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min 共計(jì)10個(gè)循環(huán)；94 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸 1 min 共計(jì)10個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸5 min。而后將PCR產(chǎn)物進(jìn)行DGGE電泳，實(shí)驗(yàn)操作按照武志華等[3]的研究進(jìn)行。將DGGE電泳的顯著性條帶切膠回收，再次進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR引物為：357f：CCTACGGGAGGCAGCAG；517r：ATTACCGCGGCTGCTGG，反應(yīng)條件同上。將獲得的顯著性條帶PCR產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序，測(cè)序結(jié)果置于GenBank 數(shù)據(jù)庫(kù)中的BLAST軟件比對(duì)。

2.5 炎性介質(zhì)、炎性因子治療效果研究 使用無(wú)菌采血針采集清晨未飼喂的患牛血液4 mL，傾斜放置2 h，而后8000 r/min 離心4 min，取上清液置于新離心管內(nèi)，利用ELISA方法[4]檢測(cè)給藥前以及給藥后60 d血清樣本的炎性因子及炎性介質(zhì)分泌量的變化。

3 結(jié)果與分析

試驗(yàn)期間，各組試驗(yàn)?zāi)膛＞闯霈F(xiàn)與受試藥物相關(guān)的不良反應(yīng)。

3.1 臨床癥狀治療結(jié)果 給藥后，約氏乳桿菌SQ0048微生態(tài)制劑高、中、低劑量試驗(yàn)組與陽(yáng)性對(duì)照組的臨床癥狀治愈率、發(fā)情率及受胎率均高于陰性對(duì)照組，高劑量試驗(yàn)組、中劑量試驗(yàn)組的臨床癥狀治愈率、受胎率均高于陽(yáng)性對(duì)照組，高劑量試驗(yàn)組的發(fā)情率高于陽(yáng)性對(duì)照組。結(jié)果見(jiàn)表3。

表3 臨床癥狀治療結(jié)果

給約氏乳桿菌SQ0048微生態(tài)制劑前后患牛情況變化結(jié)果見(jiàn)圖1。結(jié)果顯示：患牛陰道炎癥治療前，外陰紅腫，明顯流有白色粘液，帶有腥臭味，患畜喜躺臥，給約氏乳桿菌SQ0048微生態(tài)制劑后，外陰恢復(fù)，無(wú)粘液流出，患畜可站立。

圖1 給藥前后患牛樣本

3.2 實(shí)驗(yàn)室細(xì)菌學(xué)治療效果 結(jié)果見(jiàn)表4。陰性對(duì)照組在給藥前后，微生物菌群種屬變化差異不顯著，銅綠假單胞菌(Pseudomonasaeruginosa)、念珠狀鏈球菌(Streptococcusmoniliformis)菌體數(shù)量開(kāi)始增加，同時(shí)出現(xiàn)了化膿隱秘桿菌(Trueperellapyogenes)、微單胞菌(Sporanaerobactersp)，提示本研究中生理鹽水對(duì)菌群種屬無(wú)改變。陽(yáng)性對(duì)照組在給藥前后，化膿隱秘桿菌(Trueperellapyogenes)、精子放線菌(Actinobacillusseminis)、嗜水汽單孢菌(Aeromonashydrophila)依舊存在，但是其他菌體如，銅綠假單胞菌及鏈球菌(Streptobacillussp)數(shù)量變少或消失，提示清宮促孕液可能能夠殺滅銅綠假單胞菌及鏈球菌，但是對(duì)化膿隱秘桿菌、嗜水汽單孢菌無(wú)作用。低劑量試驗(yàn)組給藥后，炎性陰道內(nèi)微生物菌體種類主要由銅綠假單胞菌、精子放線桿菌、利氏卟啉單胞菌(Porphyromonaslevii)改變?yōu)榧s氏乳桿菌SQ0048微生態(tài)制劑主要菌株L.johnsonii及谷氨酸棒狀桿菌(Corynebacteriumglutamicum)、鮑氏不動(dòng)桿菌(Acinetobacterbaumannii)、Amycolatopsishalophila，其中L.johnsonii、谷氨酸棒狀桿菌菌體數(shù)量占有優(yōu)勢(shì)。中劑量試驗(yàn)組給藥前后，微生物菌群主要種屬與低劑量給藥組幾乎相同，但是鮑氏不動(dòng)桿菌(Acinetobacterbaumannii)以及Amycolatopsishalophila消失，而約氏乳桿菌SQ0048微生態(tài)制劑主要菌株L.johnsonii、谷氨酸棒狀桿菌、嗜水汽單孢菌則占有主要優(yōu)勢(shì)。高劑量試驗(yàn)組同中劑量組給藥結(jié)果幾乎相同，提示以約氏乳桿菌SQ0048微生態(tài)制劑菌株制備的微生態(tài)制劑可以減少或殺滅陰道內(nèi)的利氏卟啉單胞菌、銅綠假單胞菌、化膿隱秘桿菌及鏈球菌等，增加L.johnsonii及谷氨酸棒狀桿菌的數(shù)量，改變陰道微生態(tài)環(huán)境，維持陰道的微生態(tài)平衡。

表4 給藥前后菌體種屬結(jié)果

3.3 給藥前后炎性介質(zhì)、炎性因子治療效果 結(jié)果見(jiàn)圖2。陰性對(duì)照組患牛血清中IL-1β、TNF-α及IFN-α水平在給藥前后無(wú)顯著性差異(P>0.05)，血清中IL-6水平在給藥后較給藥前極顯著性升高(P<0.01)，血清中IL-10水平在給藥后較給藥前極顯著性降低(P<0.01)，提示患牛炎癥可能并未得到任何緩解；陽(yáng)性對(duì)照組患牛血清中IL-1β、IL-6、TNF-α水平在給藥后較給藥前顯著性降低(P<0.05)，血清中IL-10水平在給藥后較給藥前極顯著性升高(P<0.01)，提示患牛的炎癥可能在逐漸減輕；約氏乳桿菌SQ0048微生態(tài)制劑高、中、低劑量試驗(yàn)組中患牛血清中IL-1β、IFN-α、TNF-α水平在給藥后較給藥前均顯著性降低或極顯著性降低(P<0.05或P<0.01)，患牛血清中IL-6水平在低劑量試驗(yàn)組及中劑量試驗(yàn)組給藥后較給藥前無(wú)顯著性差異，在高劑量試驗(yàn)組，患牛血清中IL-6水平在給藥后較給藥前差異顯著性降低(P<0.05)，患牛血清中IL-10水平在給藥后較給藥前均極顯著性升高(P<0.01)，提示患牛的炎癥可能在逐漸減輕，且高劑量試驗(yàn)組抑制炎癥效果要較中、低劑量試驗(yàn)組效果明顯。

圖2 炎性因子及炎性介質(zhì)結(jié)果

4 討論與結(jié)論

奶牛在飼養(yǎng)過(guò)程中，由于環(huán)境、飼喂、產(chǎn)后護(hù)理、自身疾病等原因?qū)е履膛ｊ幍栏腥緲O為普遍，不僅影響了奶牛自身生長(zhǎng)發(fā)育，還引起其他如子宮內(nèi)膜炎、乳腺炎等疾病，嚴(yán)重的能引起奶牛不孕癥或流產(chǎn)等。目前有效治療奶牛陰道感染多使用中藥或抗生素療法，由此而導(dǎo)致的奶牛牛肉及牛奶獸藥殘留問(wèn)題長(zhǎng)期難以得到解決[5]。乳酸菌作為益生菌成員，其活菌及其代謝產(chǎn)物不僅具有抑菌功能，還能夠增強(qiáng)機(jī)體免疫力，且不易引起細(xì)菌耐藥性，對(duì)人畜無(wú)毒副作用[6]。一些現(xiàn)代研究已證實(shí)乳酸菌能夠抑制奶牛生殖道炎癥，減少奶牛子宮疾病的發(fā)生。

本實(shí)驗(yàn)將健康奶牛陰道內(nèi)分離篩選出的具有抑菌特性的優(yōu)勢(shì)乳酸菌約氏乳桿菌SQ0048制成的微生態(tài)制劑應(yīng)用于患有陰道炎的奶牛，研究顯示對(duì)奶牛陰道炎癥臨床癥狀的緩解具有一定的效果，且可提高受胎率及發(fā)情率。

實(shí)驗(yàn)室細(xì)菌學(xué)治療效果研究顯示，陽(yáng)性對(duì)照組及約氏乳桿菌SQ0048微生態(tài)制劑高、中、低劑量試驗(yàn)組均可殺滅或減少炎性陰道內(nèi)主要存在的菌群，諸如：嗜水汽單孢菌胞菌、鏈球菌、弗氏志賀菌、銅綠假單胞菌以及利氏卟啉單胞菌等。嗜水汽單孢菌是弧菌科氣單胞菌屬，此菌為條件致病菌，可以產(chǎn)生毒性很強(qiáng)的外毒素，當(dāng)環(huán)境急劇變化的時(shí)候，常會(huì)混合感染其他疾病，使病情加重[7]。鏈球菌是化膿性球菌的另一類常見(jiàn)細(xì)菌，引起化膿性炎癥。弗氏志賀菌是細(xì)菌性痢疾的主要病原菌之一，常會(huì)引起炎癥反應(yīng)。銅綠假單胞菌又稱綠膿桿菌，此菌亦為條件致病菌，易引起傷口感染，導(dǎo)致菌血癥或敗血癥[8]。結(jié)果表明清宮促孕液與微生態(tài)制劑對(duì)炎癥奶牛陰道內(nèi)主要菌群均具有一定的抑制作用。但是給藥后，陽(yáng)性對(duì)照組陰道內(nèi)，化膿隱秘桿菌、精子放線菌、嗜水汽單孢菌依舊存在，而中、高劑量試驗(yàn)組微生物菌群主要改變?yōu)楣劝彼岚魻顥U菌、嗜水汽單孢菌以及此微生態(tài)制劑的主要菌株L.johnsonii。谷氨酸棒狀桿菌是兼性好氧菌，非致病性菌屬。試驗(yàn)證實(shí)中、高劑量試驗(yàn)組對(duì)奶牛炎性陰道主要菌群具有一定的抑制和殺滅作用。

炎性介質(zhì)、炎性因子治療效果研究顯示，低、中、高劑量試驗(yàn)組中患牛血清中促炎性因子IL-1β、IFN-α、TNF-α水平在給藥后較給藥前極顯著性降低，高劑量試驗(yàn)組患牛血清中促炎性因子IL-6水平在給藥后較給藥前差異極顯著性降低，血清中抑炎性因子IL-10水平在給藥后較給藥前極顯著性升高。IL-1β是炎性反應(yīng)重要的細(xì)胞因子之一，在機(jī)體正常的生理?xiàng)l件下是處于不表達(dá)或弱表達(dá)狀態(tài)，但在機(jī)體病理?xiàng)l件下，其表達(dá)量會(huì)增加，誘導(dǎo)炎癥反應(yīng)的發(fā)生[9]。IL-6同樣是炎性反應(yīng)重要的細(xì)胞因子之一，當(dāng)機(jī)體感染炎癥時(shí)，病變黏膜中的IL-6 mRNA的表達(dá)量以及蛋白表達(dá)量均明顯升高，與炎癥分級(jí)正相關(guān)，治療后IL-6濃度下降[10]。IL-10作為最重要的抑炎細(xì)胞因子，其表達(dá)量增加可以抑制促炎反應(yīng)和限制炎癥引起的組織破壞[11]。IL-10可以抑制單核巨噬細(xì)胞產(chǎn)生的IL-1β、IL-6、TNF、巨噬細(xì)胞集落刺激因子(M-CSF)、粒細(xì)胞集落刺激因子(G-CSF)、血小板活化因子(PAF)等因子的產(chǎn)生[12]。TNF-α是炎癥、免疫反應(yīng)過(guò)程中重要的細(xì)胞因子，當(dāng)表達(dá)量增加時(shí)，可導(dǎo)致機(jī)體免疫調(diào)節(jié)的紊亂，促進(jìn)炎癥的發(fā)展，表達(dá)量降低時(shí)則可以抑制炎癥的發(fā)展。IFN-γ同樣是炎癥、免疫反應(yīng)過(guò)程中重要的細(xì)胞因子，具有抗病毒、抗腫瘤的作用，還具有獨(dú)特的免疫調(diào)節(jié)功能，當(dāng)表達(dá)量增加時(shí)，可導(dǎo)致炎癥的發(fā)展，表達(dá)量降低時(shí)則可以抑制炎癥的發(fā)展。很多文獻(xiàn)均證實(shí)乳酸菌可以調(diào)控炎性細(xì)胞因子的表達(dá)。Lin M H等研究顯示，B.pseudocatenulatumCECT7765可以抑制炎性細(xì)胞因子TNF-α和IL-6的產(chǎn)生[12]。由Lbs2乳酸菌菌株在免疫生物處理中降低了結(jié)腸組織中TNF-α、IL-12和IL-17的水平，同時(shí)增加了IL-10和TGF-β，顯著改善小腸結(jié)腸炎[13]。同樣，植物乳桿菌N14[14]和德氏乳桿菌TUA4408L[21]也證實(shí)了通過(guò)TLR2可調(diào)節(jié)細(xì)胞炎性因子的變化，降低IL-1β、IFN-γ表達(dá)，德氏乳桿菌TUA4408L作用免疫細(xì)胞，阻斷抗TLR2抗體，降低豬腸上皮細(xì)胞中IL-8水平[15]。試驗(yàn)證實(shí)，以約氏乳桿菌SQ0048菌株制備的微生態(tài)制劑具有抑制促炎因子以及提高抑炎因子表達(dá)量的分泌作用。

綜上所述，以約氏乳桿菌SQ0048制備的微生態(tài)制劑運(yùn)用于臨床型陰道炎患牛，可緩解臨床癥狀，改變陰道微生物菌群，改善陰道微生態(tài)環(huán)境，具有抑制炎癥的生物學(xué)功能，這為制備治療奶牛陰道炎癥的微生態(tài)制劑奠定良好試驗(yàn)依據(jù)和理論基礎(chǔ)，對(duì)于臨床上減少抗菌藥物副作用，避免獸藥殘留對(duì)人體健康和公共衛(wèi)生的危害性影響，具有非常重要的現(xiàn)實(shí)意義和社會(huì)效益。