復(fù)方中草藥與鼠李糖乳桿菌共發(fā)酵產(chǎn)物對雞球蟲病的治療效果研究

黃海斌，石昊林，楊文濤，姜延龍，王建忠，石春衛(wèi)，康元環(huán)，曹欣，王春鳳，楊桂連

(吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，吉林省動物微生態(tài)制劑工程研究中心，長春 130118)

球蟲病(coccidiosis)是雞主要的寄生蟲病，能夠造成雛雞死亡、吸收不良、飼料利用率低和生長遲緩[1]。目前，藥物和活疫苗是控制球蟲病的主要措施，但是，由于長期使用藥物和疫苗費用高昂，需要研發(fā)更有效和更安全地控制雞球蟲病的策略[2]。中藥具有無耐藥性、成本低廉等優(yōu)點，已經(jīng)在多種原蟲感染中發(fā)揮出較好的治療作用，如利什曼原蟲、阿米巴原蟲、錐蟲和隱孢子蟲等。益生菌發(fā)酵中藥一方面可以使中藥釋放出更多的有效成分，降低藥物中原有的毒副作用，提高中藥的適口性；另一方面益生菌也可以通過調(diào)節(jié)腸道環(huán)境、分泌活性分子、調(diào)節(jié)宿主免疫[3]等方式發(fā)揮抗寄生蟲作用。本實驗將具有抗球蟲作用的復(fù)方中藥與鼠李糖乳桿菌(Lactobacillusrhamnosus,L.rhamnosus)共發(fā)酵，并評價發(fā)酵產(chǎn)物的抗球蟲效果，旨在應(yīng)用乳桿菌促進中藥釋放有效成分，提高中藥抗球蟲效果，為雞球蟲病提供新的治療策略。

1 材料和方法

1.1 菌株、蟲株 鼠李糖乳桿菌(Lactobacillusrhamnosus)ATCC53103，由吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科學(xué)技術(shù)學(xué)院動物微生態(tài)實驗室保存，柔嫩艾美耳球蟲(E.tenella)孢子化卵囊由吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科學(xué)技術(shù)學(xué)院動物寄生蟲實驗室保存。

1.2 復(fù)方中藥液的制備 本實驗的中藥方劑為：青蒿(20%)、常山(20%)、白頭翁(15%)、仙鶴草(15%)、槐花(10%)、黃芩(10%)、甘草(10%)。取復(fù)方中藥500 g，加入5倍體積蒸餾水進行煎煮40 min，取出藥液后再加入5倍體積蒸餾水煎煮40 min反復(fù)3次，將3次所得藥液過濾后放入80 ℃烘干箱內(nèi)，將藥物濃縮成1.00 g/mL藥液，即每mL相當(dāng)于生藥1 g，藥液滅菌后放入4 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 制備復(fù)方中藥與L.rhamnosus共發(fā)酵產(chǎn)物 250 mL容量瓶加入100 mL復(fù)方中藥液、4 mLL.rhamnosus菌液(5×108CFU/mL)轉(zhuǎn)速為80 r/min、37 ℃條件下培養(yǎng)12 h，獲得共發(fā)酵產(chǎn)物。

1.4 實驗動物分組及處理 將30只1日齡雛雞隨機分成6組，每組5只。雛雞于13日齡經(jīng)口接種5×104個E.tenella孢子化卵囊。之后，每日觀察雛雞狀態(tài)，當(dāng)雛雞出現(xiàn)精神不振、腹瀉血便時按表1中處理方法進行治療，每天給藥一次，連續(xù)治療5 d，之后處死雛雞檢測各項指標。

表1 實驗處理與分組

1.5 體重 分別記錄接種球蟲卵囊時雛雞體重作為初重，試驗結(jié)束時雛雞體重作為末重，二者相差體重數(shù)值與組內(nèi)存活雛雞數(shù)量比值為平均增重。

1.6 盲腸病變計分 試驗計算盲腸病變記分方法采用Reid和Johnson計分法，該方法有5個等級的盲腸病變，其病變程度逐漸加深，分別用0～4分來對應(yīng)，0分：肉眼觀察盲腸病理變化不明顯；1分：盲腸中內(nèi)容物無血色出現(xiàn)，腸壁并沒有增厚但可見少量出血點；2分：盲腸中內(nèi)容物帶有血跡且腸壁出現(xiàn)增厚現(xiàn)象；3分：盲腸中內(nèi)容物帶有明顯血跡，腸壁水腫增厚，腸道嚴重臌氣；4分：可見盲腸芯，腸道腫脹嚴重，糞便為血紅色呈結(jié)塊狀。

1.7 糞便內(nèi)卵囊數(shù)(OPG計數(shù)) 試驗使用的是麥克馬斯特的方法來進行糞便中卵囊值的計算。取各組雛雞糞便2 g，用58 mL飽和食鹽水混勻，用麥克馬斯特計數(shù)板在顯微鏡下記錄卵囊數(shù)量。每克糞便卵囊數(shù)(OPG)=顯微鏡下記錄卵囊數(shù)量×100。

1.8 抗球蟲指數(shù)(ACI) ACI是評價各類物質(zhì)抵抗艾美耳球蟲能力的一項重要指標，ACI=(相對增重率+存活率)-(卵囊值+病變值)。相對增重率=各個試驗組雛雞增重/空白對照組雛雞增重×100%；存活率=各組雛雞的存活數(shù)/各組雛雞總數(shù)×100%；病變值=雛雞盲腸病變計分×10；卵囊值計算方法: 雛雞卵囊比數(shù)(%)=空白對照組雛雞OPG/各個試驗組雛雞OPG×100%，卵囊值評價標準見表2。

ACI評價標準：(1)若ACI<120時，說明達不到抗球蟲的效果；(2)若120≤ACI<160，說明能夠達到中等抗球蟲效果；(3)若160≤ACI<180，說明能夠達到良好抗球蟲效果；(4)若ACI>180，說明達到優(yōu)秀的抗球蟲效果。

表2 卵囊值計算方法

1.9 病理組織學(xué)變化 處死雛雞，分離盲腸，經(jīng)10%甲醛固定、HE染色后，用顯微鏡觀察各組雛雞盲腸病理組織學(xué)變化。

1.10 試驗數(shù)據(jù)分析 將實驗所得數(shù)據(jù)進行記錄后，用GraphPrism5.0和SPSS 11.5軟件分析處理。

2 結(jié)果與分析

2.1 體重變化 由表3可知，雛雞13日齡攻蟲后第五天臨床癥狀明顯，連續(xù)用藥5 d后檢測抗球蟲各項指標。體重變化結(jié)果顯示，地克珠利組雛雞平均增重顯著高于各處理組(P<0.05或P<0.01)。發(fā)酵產(chǎn)物組雛雞與攻蟲組相比平均增重顯著升高(P<0.05)，但與復(fù)方中藥組和L.rhamnosus相比差異不顯著。

表3 接種球蟲后各組雛雞的體重變化

2.2 盲腸病變計分 由表4和圖1可知，處死雛雞后分離盲腸，觀察病變程度并計算出病變值。結(jié)果顯示，攻蟲組盲腸腫脹，有血液凝塊和栓塞的現(xiàn)象，發(fā)酵產(chǎn)物組、復(fù)方中藥組、雛雞盲腸壁出現(xiàn)少量出血點，盲腸壁增厚，與攻蟲組相比差異顯著(P<0.05)。

表4 盲腸病變記分

(A: 發(fā)酵產(chǎn)物組；B: 復(fù)方中藥組；C: L. rhamnosus組；D: 攻蟲組；E: 地克珠利組；F: 空白對照組)

2.3 GPG結(jié)果 各組雛雞OPG結(jié)果如表5所示。地克珠利組卵囊值最少，發(fā)酵產(chǎn)物組卵囊比數(shù)明顯低于復(fù)方中藥組和L.rhamnosus組。

表5 OPG計數(shù)

2.4 抗球蟲指數(shù)(ACI) 由表6可知，計算各組抗球蟲指數(shù)表明，發(fā)酵產(chǎn)物組的ACI高于復(fù)方中藥組和L.rhamnosus組，其ACI可以達到中等抗球蟲水平。

2.5 盲腸病理組織切片的觀察 HE染色結(jié)果顯示，攻蟲組雛雞盲腸腺體消失，黏膜下層水腫，腸絨毛消失，腸腔內(nèi)充滿血栓；地克珠利治療組雛雞盲腸腺體界限清晰，絨毛完整；復(fù)方中藥組和L.rhamnosus組雛雞盲腸絨毛輕微斷裂，腸腺組織結(jié)構(gòu)破壞明顯；發(fā)酵中藥組雛雞盲腺體清晰且絨毛相對完整。說明L.rhamnosus與復(fù)方中藥的共發(fā)酵產(chǎn)物能降低球蟲引起的盲腸病理變化(圖2)。

表6 抗球蟲指數(shù)

3 討論與結(jié)論

禽球蟲病對禽類生產(chǎn)的經(jīng)濟影響最大，全世界每年控制球蟲成本估計約為8億美元，這些成本包括藥物、疫苗、動物死亡、飼料消耗等[4]。按照中獸醫(yī)理論，雞球蟲病屬于外感蟲邪而引起的一類疾病，因蟲邪會引起耗血傷津，體內(nèi)濕熱困脾，故雞球蟲病都會引起雞的食欲不振，腹瀉便血，口渴喜飲水，精神萎靡等特點[5]。治療球蟲病的方劑都以驅(qū)蟲、清熱燥濕為主，補益氣血、涼血止血為輔[6]。本實驗的中藥復(fù)方選用具有驅(qū)蟲作用的常山和清熱燥濕的黃芩、白頭翁為主藥；輔以清熱解毒的青蒿，止血的仙鶴草、槐花；佐以補益氣血的甘草。研究顯示，以常山為君藥的復(fù)方中藥對雞球蟲病有一定的治療作用。梁劍平等用常山提取物對E.tenella感染的雛雞進行治療，結(jié)果顯示中藥常山能減輕盲腸病變，提高雛雞增重率[7]。常山在球蟲治療中廣泛應(yīng)用，其活性成分常山堿、常山酮已經(jīng)用于抗球蟲、抗瘧疾的研究中[8]。本研究中復(fù)方中藥與L.rhamnosus共發(fā)酵產(chǎn)物對雞球蟲治療效果優(yōu)于復(fù)方中藥，說明中藥發(fā)酵能夠促進中藥有效成分的釋放，提高復(fù)方中藥的抗球蟲效果。

益生菌對抗腸道病原的方式包括競爭性排斥和拮抗作用維持正常的腸道菌群；通過增加消化酶的活性和減少細菌酶的活性以及氨的產(chǎn)生來改變代謝；提高采食量和消化率；中和腸毒素并激活免疫系統(tǒng)[9]。通過拮抗作用、免疫調(diào)節(jié)作用和改變腸上皮組織通透性對抗病原，研究顯示益生菌對多種腸道寄生蟲有抑制作用，包括：艾美耳球蟲(Eimeria)、賈第蟲(Giardia)、隱孢子蟲(Cryptosporidium)、旋毛蟲(Trichinella)、蛔蟲(Ascaris)等[3]。并且在飼料中添加益生菌可改善肉雞的生長性能和飼料轉(zhuǎn)化率[10]。乳酸桿菌對堆型艾美球蟲(Eimeriaacervulina)引起的球蟲病具有治療作用，能減少雛雞糞便中卵囊數(shù)量[11]。研究顯示，L.rhamnosus也可以對抗腸道病原，如輪狀病毒的感染[12]。本研究中觀察到L.rhamnosus能雛雞提高增值率，減少OPG，減輕盲腸病變。

益生菌發(fā)酵中藥可利用其微生物改變中藥化學(xué)成分，從而提高藥效、降低藥物毒副作用。秦波等以當(dāng)歸、苦參、馬鞭草、常山作為主藥，組成抗球蟲復(fù)方中藥，并分別與L.rhamnosus、植物乳桿菌(Lactobacillusplantarum)、戊糖片球菌(Pediococcuspentosaceus)等進行發(fā)酵處理，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，經(jīng)乳酸菌發(fā)酵后的復(fù)方中藥發(fā)酵液不僅能夠提高抗球蟲效果，還可以提高雛雞生長性能，增強機體的免疫水平[13]。陳雷等以馬鞭草、黃柏、郁金作為主藥組成抗球蟲中藥復(fù)方，并與乳酸菌進行固體發(fā)酵，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，復(fù)方中藥發(fā)酵產(chǎn)物對球蟲病具有較好的治療作用[14]。本研究選擇中藥復(fù)方以常山、仙鶴草、白頭翁、青蒿為主要，復(fù)方中藥與L.rhamnosus共發(fā)酵產(chǎn)物對E.tenella引起的球蟲病顯示出良好的治療效果，雛雞盲腸病理變化明顯降低，ACI達到130.59。益生菌與中藥協(xié)同發(fā)酵綜合了二者的優(yōu)勢，對疾病的治療效果明顯增強，其在雞球蟲病的治療方面擁有廣闊前景。