牛奶中氟喹諾酮類藥物殘留同步快速檢測的酶聯(lián)免疫吸附法研究

李燕君，譚梅，岳秀英，陸強，吳曉嵐，呂曉華*

(1.四川大學(xué)華西公共衛(wèi)生學(xué)院/四川大學(xué)華西第四醫(yī)院，四川 成都 610041；2.四川省獸藥監(jiān)察所，四川 成都 610041)

氟喹諾酮類藥物(fluoroquinolones，F(xiàn)Qs)是目前廣泛應(yīng)用于畜牧業(yè)的第三代喹諾酮類藥物，由于耐藥性致病菌的產(chǎn)生、繼發(fā)的不良反應(yīng)及潛在致癌作用，F(xiàn)Qs殘留問題受到各國的高度關(guān)注[1-3]。本文探索一種快速同步檢測牛奶中多種FQs殘留的酶聯(lián)免疫吸附法(enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA)，為基層現(xiàn)場監(jiān)測牛奶中FQs殘留提供參考。

1 材料與方法

1.1 樣品 牛奶樣品，購于超市。

1.2 主要儀器 Thermo Multiskan Go酶標(biāo)儀(配備450 nm濾光片)(Thermo)，CPA225D電子天平(賽多利斯)，X-200漩渦混合儀(Labnet)，Eppendorf 5810R冷凍離心機(Eppendorf)，單道和多道微量移液器(Eppendorf)。

1.3 標(biāo)準(zhǔn)品和主要試劑 氟喹諾酮類藥物殘留酶聯(lián)免疫檢測試劑盒(北京勤邦生物技術(shù)有限公司)，試劑盒中提供0、0.1、0.3、0.9、2.7、8.1 μg/L環(huán)丙沙星、恩諾沙星、諾氟沙星、培氟沙星、氧氟沙星和洛美沙星藥物系列標(biāo)準(zhǔn)溶液，試驗用水符合GB/T 6682-2008規(guī)定。

1.4 方法

1.4.1 樣品前處理 準(zhǔn)確量取25 μL牛奶于2 mL離心管中，加入稀釋后復(fù)溶工作液475 μL，混合，用渦旋儀渦動1 min，取50 μL用于分析。

1.4.2 檢測方法 所有操作均在20℃～25℃下進(jìn)行。

使用前將試劑盒置于室溫(20 ℃～25 ℃)平衡30 min以上，注意每種液體試劑使用前搖勻，取出需要數(shù)量的酶標(biāo)板微孔條插入框架中，將不用的微孔條放入自封袋，保存于2 ℃～8 ℃，將樣品和標(biāo)準(zhǔn)品對應(yīng)微孔按序編號，每個樣品和標(biāo)準(zhǔn)品做兩個平行實驗；加入50 μL標(biāo)準(zhǔn)溶液或試樣溶液到微孔底部，每孔再加入50 μL抗體工作液和酶標(biāo)二抗?jié)饪s液的混合液，輕輕振蕩混勻，用蓋板膜封板，25 ℃避光環(huán)境中反應(yīng)30 min；倒出孔中液體，將酶標(biāo)板倒置在吸水紙上拍打，去除孔中液體，每孔加250 μL洗滌液，10 s后倒出孔中液體，用吸水紙拍干，如此重復(fù)操作共洗板5次；加入50 μL底物溶液A和50 μL底物溶液B到微孔中，輕輕振蕩混勻25℃環(huán)境避光顯色15 min；加入50 μL終止液到微孔中，輕輕振蕩混勻，設(shè)定酶標(biāo)儀于450 nm處，測定每孔吸光度值(OD值)。

1.4.3 50%抑制濃度 50%抑制濃度可評價檢測方法的靈敏度[4]。分別測定10次標(biāo)準(zhǔn)曲線的50%抑制濃度。標(biāo)準(zhǔn)曲線中10次0濃度的標(biāo)準(zhǔn)液50%抑制處所對應(yīng)的藥物濃度值，即為50%抑制濃度。

1.4.5 加標(biāo)回收試驗 在牛奶樣品加入FQs系列標(biāo)準(zhǔn)溶液，分別配制5.0、25.0和50.0μg/L 三個添加濃度，ELISA法測定樣品中FQs含量。每批(日內(nèi))每一濃度重復(fù)測定5次，共做3個批次(日間)。計算各質(zhì)量濃度的批內(nèi)和批間變異系數(shù)(CV)。

2 結(jié)果與分析

2.1 ELISA法的50%抑制濃度和最低檢測限 如表1所示，ELISA法的50%抑制濃度的范圍在0.254～0.361μg/L。ELISA法的最低檢測限為1.48μg/L。

表1 ELISA法的50%抑制濃度

2.2 ELISA法的加標(biāo)回收率 如表2所示，在牛奶中添加5μg/L環(huán)丙沙星、恩諾沙星、諾氟沙星、培氟沙星、氧氟沙星和洛美沙星藥物時，回收率為87.20%～115.92%；添加25 μg/L 環(huán)丙沙星、恩諾沙星、諾氟沙星、培氟沙星、氧氟沙星和洛美沙星藥物時，回收率為84.58%～112.91%；添加50 μg/L環(huán)丙沙星、恩諾沙星、諾氟沙星、培氟沙星、氧氟沙星和洛美沙星藥物時，回收率為87.10%～113.28%。

2.3 ELISA法的加標(biāo)試驗的批內(nèi)和批間變異系數(shù) 如表2所示，在環(huán)丙沙星、恩諾沙星、諾氟沙星、培氟沙星、氧氟沙星和洛美沙星藥物添加濃度為5、25、50 μg/L時，批內(nèi)變異系數(shù)均小于15.0%，批間變異系數(shù)均小于16.0%。

表2 ELISA法的加標(biāo)回收試驗結(jié)果

續(xù)表

3 討論與結(jié)論

FQs是一類重要的獸用抗菌藥，對金黃色葡萄球菌等多種細(xì)菌有很強的抗菌活性，常被用作治療奶牛乳房炎等疾病[4]。研究表明，F(xiàn)Qs殘留可通過食物鏈進(jìn)入人體，對人體多系統(tǒng)造成損傷，并導(dǎo)致耐藥性致病菌的產(chǎn)生[5]。FQs在禽畜體內(nèi)具有良好的藥代動力學(xué)特征，可穿過血乳屏障進(jìn)入乳腺，在泌乳動物乳汁中呈聚集現(xiàn)象[6]。我國農(nóng)業(yè)部雖已規(guī)定了牛/羊奶中恩諾沙星的最大殘留限量(Maximum residue limits, MRLs)為100 μg/kg，達(dá)氟沙星的MRLs為30 μg/kg[7]，但由于奶牛泌乳期超量、盲目或不按休藥期規(guī)定等濫用FQs，牛奶中FQs殘留超標(biāo)問題依舊嚴(yán)重。在基層工作中，經(jīng)常面臨現(xiàn)場對大量樣品的檢測，因此，探索FQs多殘留的快速檢測方法十分必要。

目前國內(nèi)外常用的獸藥殘留檢測技術(shù)有確證法和篩檢法[8]。確證法主要包括高效液相色譜法和高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法等，因其檢測結(jié)果穩(wěn)定、準(zhǔn)確度高、重現(xiàn)性好，廣泛應(yīng)用于動物性食品的獸藥殘留分析中[9-13]。但確證法儀器昂貴，前處理復(fù)雜、檢測時間長、操作繁瑣，使得其無法滿足大樣本量的快速檢測。篩選法中膠體金試紙條快速檢測法雖檢測時間短，但由于檢測限高、靈敏度差、假陽(陰)性率偏高，難以保證結(jié)果的準(zhǔn)確可靠性[13]；而ELISA法靈敏度高、特異性強、分析成本低、操作簡便快捷，試劑盒檢測時間僅約1.5 h，且樣本儀器化程度低、前處理簡單，尤其適合于現(xiàn)場大批量樣品的快速檢測，極易在基層推廣[14]。目前已有用于豬肉、牛肉、雞蛋、牛奶等中FQs殘留檢測的報道[15-18]，然而已有的ELISA法僅對某一種或一類FQs藥物進(jìn)行殘留檢測，且靈敏度、準(zhǔn)確度有待提高，因此有必要進(jìn)一步探索大批量快速檢測牛奶中多種FQs殘留的ELISA法。

本文建立了一種同時測定牛奶中環(huán)丙沙星、恩諾沙星、諾氟沙星、培氟沙星、氧氟沙星和洛美沙星等六種FQs殘留的ELISA法，試驗結(jié)果表明，本文所建立的ELISA法的最低檢測限為1.48 μg/L，50%抑制濃度的范圍在0.254～0.361 μg/L，在環(huán)丙沙星、恩諾沙星、諾氟沙星、培氟沙星、氧氟沙星和洛美沙星藥物添加濃度為5、25、50 μg/L時的回收率為84.58%～115.92%，批內(nèi)變異系數(shù)均小于15.0%，批間變異系數(shù)均小于16.0%，該方法的精密度(變異系數(shù))、回收率和最低檢測限等均符合獸藥殘留試驗技術(shù)規(guī)范的要求[19]，且回收率和最低檢測限與高效液相色譜法[20]、高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法[21]接近，優(yōu)于現(xiàn)常用的高效液相色譜熒光檢測法[22-23]，具有較高的靈敏度、準(zhǔn)確度，極易在基層工作中推廣普及，適合大批量樣本的快速檢測。

綜上，氟喹諾酮類藥物殘留同步快速檢測的酶聯(lián)免疫吸附法符合獸藥殘留試驗技術(shù)規(guī)范的要求，簡便快捷，靈敏度、準(zhǔn)確度和精密度高，適用于牛奶中FQs殘留的快速檢測。