苦參功勞顆粒中鹽酸小檗堿含量測(cè)定研究

楊會(huì)鮮，姚路路，周冰，張聰，周德剛

(洛陽惠中獸藥有限公司，洛陽 471000)

苦參功勞顆粒為國(guó)家三類新獸藥，由十大功勞、苦參、木香組成,具有清熱燥濕、止痢、行氣健脾之功效，主治濕熱瀉痢，雞大腸桿菌病。

十大功勞為本方的君藥，屬小檗科十大功勞植物。研究報(bào)道十大功勞葉含小檗堿、掌葉防己堿、藥根堿、四氫藥根堿和木蘭堿等生物堿，具有抗菌、抗病毒、抗炎、抗腫瘤以及殺蟲之功效[1-5]。目前研究最多的是十大功勞的抗菌作用。Cernakova等[6]發(fā)現(xiàn)從十大功勞中分離得到的小檗堿對(duì)大腸桿菌、枯草桿菌、金黃色葡萄球菌等17種細(xì)菌也具有抑制作用。

鹽酸小檗堿為十大功勞的特征性有效成分，十大功勞為本方的君藥，故選擇鹽酸小檗堿作為本品質(zhì)量控制的指標(biāo)成分。本文對(duì)苦參功勞顆粒中鹽酸小檗堿含量測(cè)定方法進(jìn)行了研究，建立了苦參功勞顆粒中鹽酸小檗堿含量的測(cè)定方法，用于苦參功勞顆粒質(zhì)量控制。

1 儀器與試藥

1.1 儀器與試劑 Waters e2695高效液相色譜儀，配2489型紫外檢測(cè)器，美國(guó)Waters公司；KQ-500超聲波清洗器，昆山市超聲儀器有限公司，AB135-S型電子分析天平，瑞士梅特勒托利多公司；乙腈、甲醇、磷酸，HPLC級(jí)，磷酸二氫鉀為分析純；水為超純水。

1.2 試藥 鹽酸小檗堿對(duì)照品(中國(guó)獸醫(yī)藥品監(jiān)察所，批號(hào)：Z0221206，含量：94.5%)、苦參功勞顆粒(洛陽惠中獸藥有限公司，批號(hào)：20140401，20140402，20140403，規(guī)格：每1 g相當(dāng)于原生藥3 g)。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件與系統(tǒng)適用性 色譜柱：Agilent Zorbax SB-C18(250 mm× 4.6 mm，5 μm)；流動(dòng)相：乙腈-0.05 mol/L磷酸二氫鉀緩沖液(用磷酸調(diào)pH值至3.0)(30∶70)；柱溫：30 ℃；檢測(cè)波長(zhǎng)：265 nm；進(jìn)樣量：10 μL。理論板數(shù)按鹽酸小檗堿峰計(jì)算應(yīng)不低于5000。

2.2 溶液的制備

2.2.1 對(duì)照品溶液的制備 取鹽酸小檗堿對(duì)照品適量，精密稱定，加乙腈-水(3∶7)制成每1 mL含0.02 mg的溶液，即得。

2.2.2 供試品溶液 取本品研細(xì)后的細(xì)粉約0.5 g，精密稱定，置50 mL量瓶中，加乙腈-水(3∶7)35 mL，超聲處理(功率150 W，頻率25 kHz)10分鐘，放冷，加乙腈-水(3∶7)定容至刻度，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得。

2.2.3 陰性對(duì)照溶液的制備 按處方制備缺十大功勞的陰性對(duì)照樣品，按“2.2.2”項(xiàng)下方法制成陰性對(duì)照溶液。

2.3 專屬性試驗(yàn) 分別取2.2項(xiàng)下對(duì)照品溶液、供試品溶液及陰性對(duì)照溶液各10 μL注入液相色譜儀，記錄色譜圖(圖1)。從圖中可見，供試品與對(duì)照品色譜中，鹽酸小檗堿峰保留時(shí)間一致，陰性對(duì)照在鹽酸小檗堿相應(yīng)保留時(shí)間處無干擾峰，含量測(cè)定方法專屬性良好。

1. 鹽酸小檗堿對(duì)照品 2. 供試品 3. 陰性對(duì)照

2.4 線性試驗(yàn) 精密稱取鹽酸小檗堿對(duì)照品適量，加乙腈-水(3：7)制成196.6 μg·mL-1的對(duì)照品溶液，依次稀釋成濃度為78.6、39.3、19.7、9.8、4.9 μg·mL-1的對(duì)照品溶液，精密吸取10 μL注入高效液相色譜儀，記錄色譜圖峰面積，以峰面積Y為縱坐標(biāo)，鹽酸小檗堿濃度X為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線?；貧w方程為：Y=41037X-1794.7(r=1)。表明鹽酸小檗堿在4.9 μg·mL-1～78.6 μg·mL-1的范圍內(nèi)，峰面積與濃度線性關(guān)系良好。結(jié)果見表1和圖2。

表1 線性關(guān)系試驗(yàn)結(jié)果

圖2 鹽酸小檗堿含量測(cè)定標(biāo)準(zhǔn)曲線

2.5 精密度試驗(yàn) 取專屬性考察項(xiàng)下對(duì)照品溶液，按上述色譜條件精密吸取10 μL注入液相色譜儀，連續(xù)進(jìn)樣6針，記錄色譜圖峰面積，結(jié)果RSD=0.4%，表明儀器精密度良好。結(jié)果見表2。

表2 進(jìn)樣精密度試驗(yàn)結(jié)果

2.6 重復(fù)性試驗(yàn) 取苦參功勞顆粒(批號(hào)20140401)，按照“2.2.2”項(xiàng)制備供試品溶液，分別制備6份，精密吸取10 μL注入液相色譜儀，記錄色譜峰面積，結(jié)果RSD為0.3%，表明本方法重復(fù)性良好。結(jié)果見表3。

表3 重復(fù)性試驗(yàn)結(jié)果

2.7 溶液穩(wěn)定性試驗(yàn) 取苦參功勞顆粒(批號(hào)20140401)，按照“2.2.2”項(xiàng)制備供試品溶液，分別于0、2、4、8、12、24 h測(cè)定峰面積，結(jié)果RSD為1.1%，表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定，見表4。

表4 穩(wěn)定性試驗(yàn)結(jié)果

2.8 加樣回收率試驗(yàn) 取已知含量的苦參功勞顆粒(批號(hào) 20140401)6份，每份約0.25 g，精密稱定，置50 mL量瓶中，各精密加入0.1966 mg/mL的對(duì)照品溶液3 mL，按照“2.2.2”項(xiàng)制備供試品溶液，按擬定的含量測(cè)定方法，精密吸取10 μL注入液相色譜儀，記錄色譜圖，測(cè)定樣品含量并計(jì)算回收率，結(jié)果見表5，加樣回收率在101.38%～103.74%之間，平均值為102.7%，RSD為0.8%，表明方法準(zhǔn)確度良好。

表5 回收率試驗(yàn)結(jié)果

2.9 耐用性試驗(yàn) 取苦參功勞顆粒(批號(hào)：20140401)，按照“2.2.2”項(xiàng)制備供試品溶液，當(dāng)柱溫、流速發(fā)生微小變化以及使用不同型號(hào)的色譜柱，分別測(cè)定樣品的峰面積，精密吸取10 μL注入液相色譜儀，記錄色譜圖，結(jié)果見表6。結(jié)果表明，當(dāng)柱溫、流速發(fā)生微小變化以及使用其他型號(hào)的色譜柱時(shí)，對(duì)含量測(cè)定結(jié)果基本無影響，表明方法耐用性良好。

表6 耐用性試驗(yàn)結(jié)果

2.10 三批樣品含量測(cè)定 取苦參功勞顆粒樣品(20140401，20140402，20140403)，按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，分別精密吸取10 μL注入液相色譜儀，記錄色譜圖，按外標(biāo)法以峰面積計(jì)算苦參功勞顆粒中鹽酸小檗堿的含量，三批樣品測(cè)定結(jié)果見表7。

表7 樣品含量測(cè)定結(jié)果

3 討論與結(jié)論

3.1 苦參功勞顆粒含量測(cè)定方法選擇 《中國(guó)獸藥典》2010年版二部十大功勞標(biāo)準(zhǔn)中未規(guī)定鹽酸小檗堿含量測(cè)定，文獻(xiàn)有不同產(chǎn)地十大功勞含量測(cè)定方法報(bào)道[7-9]，但并未有苦參功勞顆粒中十大功勞所含鹽酸小檗堿含量測(cè)定方法。參考《中國(guó)獸藥典》2010年版功勞木藥材中鹽酸小檗堿和鹽酸巴馬汀含量測(cè)定方法，建立了苦參功勞顆粒中鹽酸小檗堿含量測(cè)定。

3.2 色譜條件的考察 參照《中國(guó)獸藥典》2010年版二部功勞木藥材中鹽酸小檗堿和鹽酸巴馬汀含量測(cè)定方法，確定流動(dòng)相為乙腈-0.05 mol/L磷酸二氫鉀緩沖液。通過不同流動(dòng)相比例、柱溫、流速、不同色譜柱及pH值的耐用性考察，從各因素保留時(shí)間和分離度可以看出，柱溫、pH值對(duì)鹽酸小檗堿的色譜行為影響較小，流動(dòng)相比例、流速對(duì)鹽酸小檗堿的保留時(shí)間影響較大，色譜柱型號(hào)變化對(duì)鹽酸小檗堿的色譜行為影響較大，但分離度均符合要求，且對(duì)含量測(cè)定結(jié)果無顯著影響，說明方法耐用性良好。

3.3 結(jié)論 通過專屬性、線性、精密度、重復(fù)性、穩(wěn)定性、加樣回收率、耐用性的方法驗(yàn)證，結(jié)果表明苦參功勞顆粒中鹽酸小檗堿含量測(cè)定以乙腈-0.05 mol/L磷酸二氫鉀緩沖液(用磷酸調(diào)pH值至3.0)(30∶70)為流動(dòng)相，檢測(cè)波長(zhǎng)為265 nm，流速為1.0 mL/min，柱溫為30 ℃，色譜柱Agilent Zorbax SB-C18(250 mm× 4.6 mm，5 μm)的色譜條件，專屬性強(qiáng)、準(zhǔn)確度高、耐用性好，操作簡(jiǎn)單，可用于苦參功勞顆粒中鹽酸小檗堿的含量控制。