HPLC-PDA法測(cè)定氟苯尼考注射液、柴胡注射液中非法添加培氟沙星、洛美沙星

楊星，龔旭昊，馬秋冉，董玲玲，趙富華，于曉輝

(中國(guó)獸醫(yī)藥品監(jiān)察所，北京 100081)

柴胡注射液臨床上主要用于治療感冒發(fā)熱，具有解熱、抗炎、抗病毒、抗驚厥、保肝等藥理作用[1]。氟苯尼考是獸醫(yī)專用的氯霉素類廣譜抗生素，氟苯尼考注射液主要用于治療豬、雞敏感菌所致的感染[2]。有些不法廠家為使獸藥達(dá)到迅速起效的目的，在抗病毒藥物和抗菌藥中非法添加其他種類的抗生素，從而提高銷量來(lái)獲取更大利潤(rùn)。2015年9月1日，農(nóng)業(yè)部發(fā)布第2292號(hào)公告[3]，決定在食品動(dòng)物中停止使用洛美沙星、培氟沙星、氧氟沙星、諾氟沙星4種獸藥，撤銷相關(guān)獸藥產(chǎn)品批準(zhǔn)文號(hào)?，F(xiàn)有農(nóng)業(yè)部公告中非法添加檢查方法檢查的氟喹諾酮類藥物均為氧氟沙星、諾氟沙星、環(huán)丙沙星與恩諾沙星，并未涉及洛美沙星和培氟沙星?？紤]到培氟沙星、洛美沙星存在被非法添加的可能，從而給動(dòng)物源性食品的安全埋下隱患，因此，需要建立一種簡(jiǎn)便的方法以檢查獸藥中非法添加的培氟沙星和洛美沙星，為嚴(yán)查違法使用培氟沙星和洛美沙星提供技術(shù)支撐。本試驗(yàn)參考已建立的相關(guān)檢測(cè)方法[4-8]，采用高效液相色譜法與二極管陣列檢測(cè)器，建立了氟苯尼考注射液、柴胡注射液中非法添加培氟沙星、洛美沙星的HPLC-PDA檢測(cè)方法。

1 儀器與試藥

1.1 儀器與試劑 高效液相色譜儀-二極管陣列檢測(cè)器(Waters e2695 2998，Empower2色譜工作站軟件)；分析天平(梅特勒XS 205，十萬(wàn)分之一)；甲醇、乙腈、三乙胺為色譜純，水(超純水)，磷酸為分析純。

1.2 試藥 甲磺酸培氟沙星對(duì)照品(含量：99.6%，批號(hào)：H0171209，中國(guó)獸醫(yī)藥品監(jiān)察所)；鹽酸洛美沙星對(duì)照品(含量：98.6%，批號(hào)：H0121505，中國(guó)獸醫(yī)藥品監(jiān)察所)；空白制劑：氟苯尼考注射液空白樣品(批號(hào)：20161210，規(guī)格：10%)、柴胡注射液空白樣品(批號(hào)：20170501，規(guī)格：10 ml相當(dāng)于原生藥10 g)，經(jīng)檢測(cè)均不含培氟沙星、洛美沙星；供試品：氟苯尼考注射液陽(yáng)性樣品(自制，含1.25%的培氟沙星、洛美沙星)。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件 用十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑；以磷酸溶液(取磷酸3.0 mL加水至1000 mL，用三乙胺調(diào)節(jié)pH值至3.0±0.1，加乙腈53 mL，搖勻)為流動(dòng)相A，乙腈為流動(dòng)相B，甲醇為流動(dòng)相C，按A∶B∶C為85.5∶7.0∶7.5進(jìn)行洗脫；流速1.0 mL/min；進(jìn)樣量：10 μL；柱溫：30℃；采用二極管陣列檢測(cè)器，采集波長(zhǎng)范圍為200 nm～400 nm，分辨率為1.2 nm；記錄277 nm波長(zhǎng)處的色譜圖，同時(shí)記錄光譜圖。

2.2 溶液配制

2.2.1 制劑空白溶液 取空白制劑1.0 mL，置50 mL量瓶中，加2%磷酸溶液-乙腈(1∶1)稀釋至刻度，搖勻；取2.0 mL，置10 mL量瓶中，加流動(dòng)相A稀釋至刻度，搖勻。

2.2.2 供試品溶液 精密量取供試品1 mL，置50 mL量瓶中，加2%磷酸溶液-乙腈(1∶1)稀釋至刻度，搖勻；精密量取2 mL，置10 mL量瓶中，加流動(dòng)相A稀釋至刻度，搖勻。

2.2.3 培氟沙星、洛美沙星對(duì)照品儲(chǔ)備液 取甲磺酸培氟沙星對(duì)照品、鹽酸洛美沙星對(duì)照品各約12.5 mg，精密稱定，置50 mL量瓶中，加2%磷酸溶液-乙腈(1∶1)使溶解并稀釋至刻度，搖勻。

2.2.4 培氟沙星、洛美沙星對(duì)照品溶液 精密量取培氟沙星、洛美沙星對(duì)照品儲(chǔ)備液2 mL，置10 mL量瓶中，加流動(dòng)相A稀釋至刻度，搖勻。

2.2.5 檢測(cè)限溶液(0.5、1.0、2.0 g/L) 取空白制劑1.0 mL，置50 mL量瓶中，分別精密加入培氟沙星、洛美沙星對(duì)照品儲(chǔ)備液2、4、8 mL，加2%磷酸溶液-乙腈(1∶1)稀釋至刻度，搖勻；精密量取2 mL，置10 mL量瓶中，加流動(dòng)相A稀釋至刻度，搖勻。

2.2.6 回收率試驗(yàn)溶液 取空白制劑1.0 mL，置50 mL量瓶中，精密加入甲磺酸培氟沙星對(duì)照品、鹽酸洛美沙星對(duì)照品各約12.5 mg，加2%磷酸溶液-乙腈(1∶1)使溶解并稀釋至刻度，搖勻；精密量取2 mL，置10 mL量瓶中，加流動(dòng)相A稀釋至刻度，搖勻。

2.2.7 建立光譜數(shù)據(jù)庫(kù)的溶液 以培氟沙星、洛美沙星對(duì)照品溶液作為建立光譜數(shù)據(jù)庫(kù)的溶液。

2.3 方法學(xué)考察

2.3.1 專屬性 HT通過(guò)制劑空白試驗(yàn)和本底添加試驗(yàn)排除各制劑中主要成分與輔料對(duì)被測(cè)物的干擾。分別精密量取2.2.1項(xiàng)下制劑空白溶液、2.2.4項(xiàng)下培氟沙星、洛美沙星對(duì)照品溶液、2.2.6項(xiàng)下回收率試驗(yàn)溶液各10 μL，照2.1項(xiàng)下色譜條件，注入高效液相色譜儀，記錄色譜圖與光譜圖。結(jié)果顯示，培氟沙星、洛美沙星對(duì)照品的保留時(shí)間分別約為7.9、10.0 min，氟苯尼考注射液的主成分的保留時(shí)間約為19.7 min，柴胡注射液的主成分無(wú)紫外吸收，其輔料也不在培氟沙星、洛美沙星出峰處出峰(圖1～圖3)。此外，回收率試驗(yàn)溶液中培氟沙星、洛美沙星峰的純度角度均小于純度閾值(表1、表2)，均為單一物質(zhì)峰，表明該色譜條件下2種制劑本底均對(duì)培氟沙星、洛美沙星的測(cè)定無(wú)干擾。

圖1 氟苯尼考注射液空白溶液光譜色譜圖

圖2 柴胡注射液空白溶液光譜色譜圖

圖3 培氟沙星、洛美沙星對(duì)照品光譜色譜圖

表1 培氟沙星峰純度及光譜相似度檢查結(jié)果表

表2 洛美沙星峰純度及光譜相似度檢查結(jié)果表

2.3.2 檢測(cè)限 通過(guò)制劑空白添加被測(cè)物對(duì)照品來(lái)考察方法的檢測(cè)限。照2.2.5項(xiàng)下配制各制劑的檢測(cè)限溶液(0.5、1.0、2.0 g/L)，精密量取10 μL進(jìn)行測(cè)定。綜合考慮色譜圖峰型、峰面積，以光譜圖失真的最大濃度作為方法的檢測(cè)限。結(jié)果顯示，2種制劑檢查培氟沙星、洛美沙星的檢測(cè)限均為1.0 g/L。

2.3.3 準(zhǔn)確度 通過(guò)制劑空白添加被測(cè)物對(duì)照品做回收率試驗(yàn)來(lái)考察方法的準(zhǔn)確度。照2.2.6項(xiàng)下平行配制6份各制劑的回收率試驗(yàn)溶液，精密量取10 μL進(jìn)行測(cè)定。結(jié)果顯示，培氟沙星在氟苯尼考注射液、柴胡注射液中的平均回收率分別為101.4%(RSD=0.2%)、100.0%(RSD=0.4%)，洛美沙星在氟苯尼考注射液、柴胡注射液中的平均回收率分別為101.2%(RSD=0.1%)、99.8%(RSD=0.5%)。

2.3.4 耐用性 以各制劑的回收率試驗(yàn)溶液作為耐用性試驗(yàn)溶液，從柱溫、流速、色譜柱、磷酸溶液pH值、流動(dòng)相比例共五個(gè)方面考察培氟沙星、洛美沙星檢查方法的耐用性。調(diào)節(jié)柱溫分別為25、30、35 ℃，結(jié)果顯示：隨柱溫升高，培氟沙星、洛美沙星保留時(shí)間提前，分離度均符合要求；改變流速分別為0.9、1.0、1.1 mL/min，結(jié)果顯示：隨流速增大，培氟沙星、洛美沙星保留時(shí)間提前，分離度均符合要求；選擇三款不同品牌色譜柱，Waters Atlantis T3 C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)、資生堂MGⅢ C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)和Waters Xbridge C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)，結(jié)果顯示：三款色譜柱培氟沙星、洛美沙星的保留時(shí)間不同，培氟沙星、洛美沙星峰與其他峰分離度均符合要求，理論板數(shù)均高于10000，拖尾因子為1.1～1.2；調(diào)節(jié)磷酸溶液pH值為2.9、3.0和3.1，結(jié)果顯示：隨磷酸溶液pH值的改變，培氟沙星和洛美沙星的保留時(shí)間基本不變，且三種pH值下分離度均符合要求；調(diào)節(jié)流動(dòng)相磷酸溶液-乙腈-甲醇的比例分別為(86∶6.5∶7.5)、(85.5∶7.0∶7.5)、(85∶7.5∶7.5)，結(jié)果顯示：隨乙腈比例升高，培氟沙星、洛美沙星保留時(shí)間提前，分離度均符合要求。以上結(jié)果表明，本方法耐用性較好，能滿足培氟沙星、洛美沙星的檢查要求。

2.4 樣品測(cè)定 取氟苯尼考注射液陽(yáng)性樣品，照2.2.2項(xiàng)下配制供試品溶液，培氟沙星、洛美沙星對(duì)照品溶液的濃度調(diào)整為峰面積與供試品溶液相當(dāng)。分別精密量取10 μL，照2.1項(xiàng)下色譜條件，注入高效液相色譜儀，記錄色譜圖與光譜圖。結(jié)果顯示，供試品溶液在與培氟沙星、洛美沙星對(duì)照品保留時(shí)間一致處出峰；兩個(gè)色譜峰的純度角度均小于純度閾值，為單一物質(zhì)峰；將其光譜分別與培氟沙星、洛美沙星對(duì)照品的光譜匹配，匹配角度均小于匹配閾值，說(shuō)明其與培氟沙星、洛美沙星對(duì)照品的光譜相似，且兩者最大吸收波長(zhǎng)均一致。以上結(jié)果表明樣品中檢出培氟沙星、洛美沙星(表3)。

表3 氟苯尼考注射液陽(yáng)性樣品檢查結(jié)果表

3 討論

3.1 流動(dòng)相系統(tǒng)與溶媒的選擇 參考中華人民共和國(guó)農(nóng)業(yè)部公告第2448號(hào)中“肥豬散、健胃散、銀翹散等中藥散劑中非法添加氟喹諾酮類藥物(物質(zhì))檢查方法”的流動(dòng)相系統(tǒng)與溶媒，選擇與其相同的流動(dòng)相系統(tǒng)與溶媒。該公告方法檢查氧氟沙星、諾氟沙星、環(huán)丙沙星、恩諾沙星4種非法添加物，本方法檢查培氟沙星、洛美沙星2種非法添加物，由于兩種方法的色譜條件與溶液配制方法一致，其優(yōu)勢(shì)是采用一種檢查方法，即可檢測(cè)以上6種氟喹諾酮類藥物中的任意一種，最多同時(shí)檢測(cè)5種。不足之處是極端情況下當(dāng)以上6種氟喹諾酮類藥物同時(shí)非法添加時(shí)，無(wú)法保證氧氟沙星、諾氟沙星與培氟沙星3個(gè)色譜峰之間的分離度均大于1.5，峰純度角度小于純度閾值，這也是下一步的改進(jìn)方向。

3.2 檢測(cè)波長(zhǎng)的選擇 采用二極管陣列檢測(cè)器，在200 nm～400 nm波長(zhǎng)范圍內(nèi)進(jìn)行紫外吸收?qǐng)D譜掃描。培氟沙星在207、277、315 nm波長(zhǎng)處有最大吸收，洛美沙星在211、288、320 nm波長(zhǎng)處有最大吸收，兩者分別在277、288 nm波長(zhǎng)處的吸收度較高，任選一個(gè)均可，本文選擇277 nm作為檢測(cè)波長(zhǎng)。

3.3 保留時(shí)間、峰純度檢查與光譜相似度檢查 保留時(shí)間是否一致是判斷兩個(gè)色譜峰是否為同一化合物的初步依據(jù)，而峰純度檢查可以判斷色譜峰是否為單一物質(zhì)峰，光譜相似度檢查可以排除保留時(shí)間一致，但紫外光譜不同的化合物的干擾。在對(duì)2種制劑的回收率試驗(yàn)溶液和檢測(cè)限溶液的各項(xiàng)檢測(cè)中，與培氟沙星、洛美沙星對(duì)照品溶液主峰保留時(shí)間一致處均出峰，且這兩全色譜峰的純度角度均小于純度閾值，匹配角度均小于匹配閾值。表明在該液相條件下，可在2種制劑中檢出培氟沙星、洛美沙星，方法可行。

3.4 其他獸藥制劑非法添加檢查 除氟苯尼考注射液、柴胡注射液外，其他獸藥制劑亦可能非法添加培氟沙星或洛美沙星，在實(shí)際檢驗(yàn)工作中，一方面應(yīng)進(jìn)行空白試驗(yàn)和檢測(cè)限測(cè)定，另一方面要注意非法添加物以外的成分是否對(duì)測(cè)定有干擾，選擇合適的色譜柱和調(diào)節(jié)流動(dòng)相比例，使非法添加物與其他色譜峰完全分離的同時(shí)，縮短運(yùn)行時(shí)間，減少試劑損耗，從而減少對(duì)環(huán)境的污染，如本次試驗(yàn)時(shí)，將Waters Atlantis T3色譜柱更換為Waters Xbridge色譜柱，氟苯尼考的出峰時(shí)間可由37.1 min縮短至19.7 min，而培氟沙星、洛美沙星與相鄰色譜峰分離度仍符合要求。

4 結(jié) 論

本方法建立了HPLC-PDA法檢測(cè)氟苯尼考注射液和柴胡注射液中非法添加培氟沙星、洛美沙星的檢查方法，綜合保留時(shí)間、最大吸收波長(zhǎng)、峰純度檢查和光譜相似度檢查四方面的信息，實(shí)現(xiàn)了獸藥中非法添加物的準(zhǔn)確識(shí)別。該方法操作簡(jiǎn)便、快速、靈敏度高，為打擊獸藥制劑中非法添加培氟沙星、洛美沙星的制假行為提供了有力的技術(shù)支持。