桑椹花青素-3-葡萄糖苷對癲癇模型小鼠的保護作用及海馬BDNF/TrkB通路的影響

王芳 侯自立 韓冰 解國圣 張艷玲

中圖分類號 R285

文獻標志碼A

文章編號 1001-0408（ 2020）03-0335-05

DOI 10.6039/j.issn.1001-0408.2020.03.16

摘要 目的：研究桑椹花青素-3-葡萄糖苷對癲癇模型小鼠的保護作用及海馬腦源性神經營養(yǎng)因子（BDNF）/酪氨酸激酶受體B（TrkB）通路的影響。方法：將120只C57BL/6小鼠隨機分為正常組、模型組、單藥（桑椹花青素-3-葡萄糖苷）和激動劑聯(lián)用組（桑椹花青素-3-葡萄糖苷+TrkB激動劑LM22B-10），每組30只。單藥組和激動劑聯(lián)用組小鼠每天灌胃600μg/kg桑椹花青素-3-葡萄糖苷1次、連續(xù)給藥6周，激動劑聯(lián)用組小鼠在給藥第6周時每天側腦室注入LM22B-10（5mg/kg）l次;正常組和模型組小鼠灌胃等體積生理鹽水。末次給藥后，除正常組外，其余各組小鼠均采用氯化鋰一匹羅卡品建立癲癇模型。造模成功后，各組分別取10只小鼠記錄其癲癇自發(fā)性再發(fā)作的潛伏期、發(fā)作頻率及持續(xù)時間，每天觀察6h，連續(xù)觀察4周;并于造模第14、28、36天記錄其腦電圖，統(tǒng)計1h內腦電波異常發(fā)生次數(shù)。于造模后第6天，各組分別取10只小鼠檢測其血清鈣離子水平，并取各組剩余10只小鼠檢測其海馬組織中BDNF mRNA及蛋白表達。結果：與正常組比較，模型組小鼠癲癇自發(fā)性再發(fā)作的潛伏期、發(fā)作頻率、持續(xù)時間及造模第14、28、36天腦電波異常發(fā)生次數(shù)均顯著增加（P<0.05），血清鈣離子水平及海馬BDNF mRNA、蛋白相對表達量均顯著升高（P<0.05）。與模型組比較，單藥組小鼠癲癇自發(fā)性再發(fā)作行為的潛伏期、發(fā)作頻率、持續(xù)時間及造模第28、36天腦電波異常發(fā)生次數(shù)均顯著減少（P<0.05），血清鈣離子水平及海馬BDNF mRNA、蛋白相對表達量均顯著降低（P<0.05）;與單藥組比較，激動劑聯(lián)用組小鼠癲癇自發(fā)性再發(fā)作的潛伏期、發(fā)作頻率、持續(xù)時間及造模第28、36天腦電波異常發(fā)生次數(shù)均顯著增加（P<0.05），血清鈣離子水平及海馬BDNF mRNA、蛋白相對表達量均顯著升高（P<0.05）。結論：桑椹花青素-3一葡萄糖苷對癲癇模型心鼠具有一定的保護作用，其機制可能與抑制海馬BDNF/TrkB通路的激活有關。

關鍵詞 桑椹花青素-3-葡萄糖苷;癲癇;腦源性神經營養(yǎng)因子;酪氨酸激酶受體B;機制;小鼠

癲癇為兒科常見病，是由于腦神經元反復異常放電所致，臨床上多表現(xiàn)為驚厥、陣攣或窒息發(fā)作，對患兒的生活質量造成了較大影響，嚴重者可危及生命[1-2]。目前，癲癇主要通過藥物進行治療，常用的藥物有丙戊酸鈉、奧卡西平等[3]。雖然目前臨床可使用的抗癲癇藥物較多，但其治療效果卻不盡如人意，且藥物治療引起的副作用給患兒及其家屬帶來了不少困擾[4]。癲癇的發(fā)病機制較復雜，尚未完全闡明。據報道，腦源性神經營養(yǎng)因子（Brain derived neurotrophic factor，BDNF）/酪氨酸激酶受體B（Tyrosine kinase B.TrkB）通路與癲癇的發(fā)病具有一定的相關性[5]。

花青素是自然界中一類廣泛存在于植物中的水溶性天然色素，目前用于提取花青素的主要原料有藍莓、桑椹、玉米等[6]。桑椹為桑科植物桑樹（Morus alba Linn.）的成熟果穗，具有抗氧化、降血糖、抗衰老等多種生物活性，是常見的藥食同源的作物之一，從桑椹中提取的花青素具有含量高、性質較穩(wěn)定、受光照和溫度影響較小等優(yōu)點，其主要成分為花青素-3-葡萄糖苷[7]。研究發(fā)現(xiàn)，花青素對癲癇模型小鼠細胞凋亡具有抑制作用[6];花青素-3-葡萄糖苷也具有抗氧化、清除自由基、抗炎和抗腫瘤等作用[8]。作為花青素中主要成分，關于其是否具有抗癲癇作用以及其作用機制的報道較少。鑒于此，本研究以桑椹花青素中主要成分花青素-3-葡萄糖苷為研究對象，考察其對癲癇模型小鼠的保護作用，并基于BDNF/TrkB通路考察其作用機制，為該化合物的開發(fā)利用提供實驗參考。

l 材料

1.1 儀器

LC1200型高效液相色譜儀（美國Agilent公司）;J2-21M型高速低溫離心機、Mc pr0 384型實時熒光定量-聚合酶鏈式反應（PCR）儀（德國Eppendorf公司）;GE AI600型超靈敏多功能生物分子成像儀（美國Amer-sham Imager公司）;B-H-300A型動物行為學研究試驗儀（北京北廣精儀儀器有限公司）。

1.2 藥品與試劑

桑椹購自河北農沃綠農業(yè)科技有限公司（批號：180213），由四川農業(yè)大學園藝學院賴云松副研究員鑒定為?？浦参锷洌∕.alba Linn.）的成熟果穗;TrkB激動劑LM22B-10（美國Selleck公司，貨號：6037，純度：98.81%）;氯化鋰（上海晶抗生物工程有限公司，貨號：7447-41-8）;氫溴酸東莨菪堿注射液（上海禾豐制藥有限公司，批號：H31021519，規(guī)格：0.3g/mL）;鹽酸匹羅卡品（貨號：CAT 54-71-7，規(guī)格：200g）、甲基百里香酚藍（MTB）比色法試劑盒（貨號：CAT 1945-77-3）均購自美國Sigma公司;兔源BDNF抗體（貨號：ab108389）、鼠源甘油醛-3-磷酸脫氫酶（GAPDH）抗體（貨號：ab22555）、辣根過氧化物酶（HRP）標記的山羊抗小鼠免疫球蛋白G（IgG）二抗（貨號：ab97051）、HRP標記的山羊抗兔IgG二抗（貨號：ab6789）均購自英國Abcam公司;RNA提取試劑盒（美國Invitrogen公司，批號：15589218）;引物均由北京擎科生物有限公司合成;其余試劑均為分析純，水為蒸餾水。

1.3 動物

C57BL/6小鼠120只，雄性，體質量25～30g，由河北醫(yī)科大學動物中心提供，實驗動物使用許可證號：SYXK（冀）2014-0198。小鼠飼養(yǎng)環(huán)境通風良好，光照周期為12h，環(huán)境溫度為25℃，濕度為50%，飼養(yǎng)期間自由攝食、飲水。

2 方法

2.1 桑椹花青素-3-葡萄糖苷的提取

按文獻方法[9]提取桑椹花青素-3-葡萄糖苷。將30g桑椹冷凍干燥后粉碎（30～80目），以0.1%鹽酸一乙醇（40：60，V/V）為提取溶劑、固液比1：20（g/mL）、浸提溫度50℃、浸提時間1.5h浸提2次，合并2次提取液，真空抽濾并濃縮得到粗浸膏（得率為11%）。使用AgilentLC 1200型高效液相色譜儀精制純化花青素-3-葡萄糖苷，制備色譜柱為YMC Hydrosphere C¹⁸（150mm×4.6mm，5μm），純化條件為0.04%三氟乙酸（A）-乙腈（B）（95：5，V/V），純化時間為0.5h，流速為1mL/min，檢測波長為254nm。最終制備得到純度>99.5%的花青素-3-葡萄糖苷樣品。用生理鹽水將花青素-3-葡萄糖苷制成一定濃度的貯備液，高壓滅菌后于-20℃冰箱中保存，備用。

2.2 分組、造模與給藥

小鼠適應性飼養(yǎng)1周后隨機分為正常組、模型組、單藥組（桑椹花青素-3-葡萄糖苷）和激動劑聯(lián)用組（桑椹花青素-3-葡萄糖苷+LM22B-10），每組30只。單藥組和激動劑聯(lián)用組小鼠均于造模前灌胃600μg/kg桑椹花青素-3-葡萄糖苷，每日給藥1次，連續(xù)給藥6周;在此基礎上激動劑聯(lián)用組小鼠于造模前1周開始給予LM22B-10，側腦室注入，每次5mg/kg，每日給藥1次，連續(xù)給藥1周[6]。同時，正常組、模型組小鼠灌胃等體積生理鹽水。給藥結束后，除正常組外，其余各組小鼠均復制癲癇模型：小鼠先腹腔注射新鮮配制的氯化鋰溶液（180mg/kg），24 h后腹腔注射東莨菪堿（1mg/kg），15min后再腹腔注射鹽酸匹羅卡品（30mgkg）[8]。根據Racine分級進行癲癇發(fā)作評定[9]，30min后未H{現(xiàn)癲癇發(fā)作的小鼠重復腹腔注射鹽酸匹羅卡品（10mg/kg），直至誘導癲癇發(fā)作。

2.3 小鼠癲癇行為分析及腦電圖監(jiān)測

造模結束后，各組分別取10只小鼠，通過動物行為學研究試驗儀觀察并記錄其癲癇自發(fā)性再發(fā)作行為。自造模成功后，每天觀察6h（上午9：00 - 12：00，下午2：00-5：00），連續(xù)觀察4周，記錄癲癇自發(fā)性再發(fā)作的潛伏期（h）、平均發(fā)作頻率（次/d）和發(fā)作持續(xù)時間（s）。同時自造模成功后第14、28、36天對各組小鼠進行腦電圖檢查，每次檢測th，記錄單位時間內異常腦電波發(fā)生次數(shù)。腦電圖診斷標準參照馮應琨的《臨床腦電圖學》及周昌貴的《臨床腦電圖手冊》，以腦電圖出現(xiàn)彌漫性異常、局灶性異常、陣發(fā)性節(jié)律波及異常波發(fā)放和高峰矢律等為異常腦電圖。

2.4 小鼠血清鈣離子水平檢測

于造模成功后第6天，各組隨機取10只小鼠尾靜脈取血，分離血清，按MTB試劑盒說明書檢測小鼠血清中鈣離子水平。

2.5 小鼠海馬組織中BDNF mRNA表達檢測

采用實時熒光定量-PCR法進行檢測。既往文獻研究結果表明，BDNF蛋門表達在造模成功后6～7天達到高峰[6]。因此，本研究在造模成功后的第6天，各組隨機取10只小鼠處死并取出海馬組織，按RNA提取試劑盒說明書對小鼠海馬組織中的mRNA進行提取，驗證其純度后反轉錄合成cDNA，以合成的cDNA為模板進行PCR擴增。BDNF上游引物序列為5'-AGTGTGT-CATAGAGCTTCCTGTTTCATCTCCCAGT-3'，下游引物序列為5'-TGGAACCAGGCCCCAGGGAATCTT-TCAGCTGCATT-3'，擴增片段長度為533 bp;GAPDH上游引物序列為5'-GGGAGCCAAAAGGGTCAT-3'，下游引物序列為5'-GAGTCCTTCCACGATACCAA-3'，擴增片段長度為452bp。反應體系總體積為25μL。BDNF反應條件：94℃預變性3min;94℃變性30s，56℃退火30s，72℃延伸30 s，30個循環(huán);72℃再延伸5min。GAPDH反應條件中的退火條件為58℃反應1min，其余條件均與BDNF相同。以GAPDH為內參，采用2_-△△ct法計算目的基因的相對表達量。

2.6 小鼠海馬組織中BDNF蛋白表達檢測

采用Western blotting法進行檢測。取“2.5”項下小鼠海馬組織，加入蛋門裂解液80mL，冰浴上超聲勻漿（40kHz、10s/次，連續(xù)5～6次，每次間隙30s），然后以13000r/min離心15min，取上清，進行二喹啉甲酸（BCA）蛋門定量。取蛋白進行十二烷基硫酸鈉一聚丙烯酰胺（SDS-PAGE）凝膠電泳，再轉移至硝酸纖維素膜（PVDF膜），以脫脂牛奶封閉2h后，加入BDNF、GAP-DH-抗（1：1 000），40C孵育過夜;以TBST緩沖液洗膜4次，每次20min，再加入相應二抗（1：2000），室溫孵育2h：以TBST緩沖液漂洗3次，每次10min。漂洗結束后加入化學發(fā)光液，采用超靈敏多功能生物分子成像儀采集BDNF和GAPDH條帶并拍照，圖片采用Gel-Pro Ana-lyzer 4.5軟件進行灰度值分析，以目的蛋白條帶灰度值與內參GAPDH條帶灰度值的比值表示目的蛋門的相對表達量。

2.7 統(tǒng)計學方法

采用SPSS 19.0統(tǒng)計學軟件進行統(tǒng)計分析。計量資料以 ±s表示，組間比較采用單因素方差分析和t檢驗。P<0.05表示差異有統(tǒng)計學意義。

3 結果

3.1 各組小鼠癲癇自發(fā)性再發(fā)作的發(fā)生情況

經造模后，模型組小鼠發(fā)生癲癇。與模型組比較，單藥組小鼠癲癇自發(fā)性再發(fā)作的潛伏期顯著延長，發(fā)作頻率顯著降低（P<0.05），發(fā)作持續(xù)時間顯著縮短（P<0.05），這提示桑椹花青素-3-葡萄糖苷對模型小鼠癲癇的發(fā)作具有一定的抑制作用。與單藥組比較，激動劑聯(lián)用組小鼠癲癇自發(fā)性再發(fā)作的潛伏期顯著縮短（P<0.05），發(fā)作頻率顯著升高（P<0.05），發(fā)作持續(xù)時間顯著延長（P<0.05）。各組小鼠癲癇自發(fā)性再發(fā)作的潛伏期、發(fā)作頻率和發(fā)作持續(xù)時間測定結果見表1。

3.2 各組小鼠腦電圖異常情況觀察結果

在造模成功后第14，28、36天，模型組小鼠異常腦電波發(fā)生次數(shù)均顯著升高（P<0.05）。與模型組比較，單藥組小鼠在造模成功后第28、36天時異常腦電波發(fā)生次數(shù)顯著降低（P<0.05）。與單藥組比較，激動劑聯(lián)用組小鼠在造模成功后第28、36天時異常腦電波發(fā)生次數(shù)顯著升高（P<0.05）。各組小鼠在造模成功不同時間后的腦電圖異常腦電波發(fā)生次數(shù)測定結果見表2。

3.3 各組小鼠血清中鈣離子水平測定結果

與正常組比較，模型組小鼠血清中鈣離子水平顯著降低（P<0.05）。與模型組比較，單藥組小鼠血清中鈣離子水平顯著升高（P<0.05）。與單藥組比較，激動劑聯(lián)用組小鼠血清中鈣離子水平顯著降低（P<0.05）。各組小鼠血清中鈣離子水平測定結果見表3。

3.4 各組小鼠海馬組織中BDNF mRNA及蛋白表達水平測定結果

與正常組比較，模型組小鼠海馬組織組織中BDNFmRNA及蛋白的相對表達量均顯著升高（P<0.05）。與模型組比較，單藥組小鼠海馬組織中BDNF mRNA及蛋白的相對表達量均顯著降低（P<0.05）。與單藥組比較，激動劑聯(lián)用組小鼠海馬組織中BDNF mRNA及蛋門的相對表達量顯著升高（P<0.05）。各組小鼠海馬組織中BDNF mRNA的相對表達量測定結果見圖1，BDNF蛋門表達電泳圖及相對表達量測定結果見圖2。

4 討論

BDNF/TrkB通路是中樞神經系統(tǒng)的重要信號通路。酪氨酸蛋門激酶受體（Trk）是BDNF的高親和力受體，包括TrkA、TrkB、TrkC等亞型，其中TrkB與BDNF結合形成的BDNF/TrkB通路涉及到如神經元存活、軸突生長、細胞遷移、調節(jié)神經興奮性與抑制性的平衡等功能[10]。當BDNF與TrkB結合時，TrkB受體內在的酪氨酸磷酸化，進而觸發(fā)一系列級聯(lián)信號轉導，包括絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）信號通路、磷酸肌醇3一激酶（PI3K）信號通路和磷脂酶C-y（PLC-y）信號通路[11]。BDNF/TrkB信號通路的激活還可引起海馬興奮環(huán)路的建立、激活Ⅳ-甲基-D-天冬氨酸受體，導致細胞內鈣離子內流，增強興奮性突觸后電位，降低癲癇發(fā)作的閾值[12]。癲癇發(fā)作后BDNF表達水平也隨之上調，使興奮性突觸后電流再次增加，進一步加重鈣離子超載，引起神經元死亡和癲癇反復發(fā)作[13]。上述研究均提示，BDNF/TrkB信號通路是治療癲癇的潛在靶標之一，可以通過阻斷BDNF/TrkB通路的激活，從而達到抑制癲癇發(fā)作的目的。

癲癇是常見的中樞神經系統(tǒng)疾病，約20%～25%的患者最終演變?yōu)殡y治性癲癇[14]。多數(shù)癲癇患者即使在間隙期，腦電圖依然會有異常。本研究結果顯示，模型組小鼠出現(xiàn)了癲癇癥狀及異常腦電波，并且其血清中鈣離子水平顯著降低、海馬組織中BDNF蛋門及mRNA水平均明顯升高。給予桑椹花青素-3-葡萄糖苷干預后，小鼠癲癇自發(fā)性再發(fā)作潛伏期延長、發(fā)作頻率降低、發(fā)作持續(xù)時間縮短，異常腦電波發(fā)生次數(shù)減少，血清中鈣離子水平回升，同時海馬組織中BDNF mRNA及蛋白相對表達量也顯著降低。其原因可能是桑椹花青素-3-葡萄糖苷能夠阻斷TrkB受體酪氨酸磷酸化，抑制細胞內鈣離子內流，降低興奮性突觸后電位，從而升高癲癇發(fā)作的閾值，達到抑制癲癇發(fā)作的目的。LM22B-10是典型的TrkB激動劑，能夠精確地誘導體內外TrkB、TrkC和細胞外信號調節(jié)激酶（ERK）等的活化，在針對信號通路TrkB的研究中使用較為普遍[15-16]。本研究在藥物治療基礎上加入TrkB激動劑LM22B-10，進一步探討B(tài)DNF/TrkB這條信號通路在本模型中是否發(fā)揮作用。結果顯示，加入激動劑LM22B-10后，可使小鼠血清中鈣離子水平再次降低，癲癇自發(fā)性再發(fā)作的潛伏期縮短、發(fā)作頻率升高、發(fā)作持續(xù)時間延長，并使海馬組織中BDNFmRNA及蛋門表達水平升高。

綜上所述，本研究證實了花青素-3-葡萄糖苷對癲癇模型小鼠具有一定的保護作用，其機制可能與抑制BDNF/TrkB通路的激活有關，但其更多的作用機制有待進一步研究證實。

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（收稿日期：2019-07-24修回日期：2019-12-30）

（編輯：林靜）