瓜蒂水提物和醇提物對(duì)食管癌TE-1、EC-1細(xì)胞的增殖、遷移、克隆形成的影響及機(jī)制研究

趙雯宇 司富春

中圖分類號(hào) R73 5.1;R965

文獻(xiàn)標(biāo)志碼A

文章編號(hào)1001-0408（2020）03-0314-07

DOI 10.6039/j.issn.1001-0408.2020.03.12

摘要 目的：研究瓜蒂水提物和醇提物對(duì)食管癌TE-1、EC-1細(xì)胞增殖、遷移、克隆形成的影響及作用機(jī)制。方法：體外培養(yǎng)TE-1、EC-1細(xì)胞，分別加入質(zhì)量濃度均為0、1.5625、3.125、6.25、12.5、25、50、100、200μg/mL的瓜蒂水提物或醇提物（以提取物粉末計(jì)）進(jìn)行培養(yǎng)，采用MTT法檢測細(xì)胞的生長抑制率并計(jì)算半數(shù)抑制濃度（IC⁵⁰）。將TE-1、EC-1細(xì)胞分為TE-1/EC-1空白組、TE-1/EC-1瓜蒂水提物組（藥液濃度均為ICso）、TE-1/EC-1瓜蒂醇提物組（藥液濃度均為ICso），采用實(shí)時(shí)無標(biāo)記細(xì)胞分析（RTCA）法檢測各組細(xì)胞的增殖與遷移，繪制細(xì)胞增殖、遷移曲線;采用顯微鏡觀察各組細(xì)胞形態(tài)學(xué)的變化;采用軟瓊脂克隆形成試驗(yàn)分析各組細(xì)胞克隆形成能力的變化，并計(jì)算細(xì)胞克隆形成率;采用流式細(xì)胞儀檢測各組細(xì)胞的細(xì)胞周期、凋亡率;采用Western blotting檢測各組細(xì)胞表皮生長因子受體（EGFR）、蛋白激酶C-a（PKC-a）的相對(duì)表達(dá)量。結(jié)果：瓜蒂水提物作用于TE-1、EC-1細(xì)胞的ICso分別為49.24、76.38μg/mL，瓜蒂醇提物作用于TE-1、EC-1細(xì)胞ICs。分別為9.08、14.53μg/mL;瓜蒂水提物和醇提物加藥后30h內(nèi)對(duì)細(xì)胞有增殖抑制作用;瓜蒂水提物和醇提物加藥后60 h內(nèi)對(duì)細(xì)胞有遷移抑制作用。與TE-1/EC-1空白組比較，各加藥組細(xì)胞數(shù)量明顯減少，細(xì)胞結(jié)構(gòu)松散，多數(shù)細(xì)胞輪廓消失、變圓等;細(xì)胞克隆形成率顯著下降（P<0.Ol）;G²期細(xì)胞百分率顯著升高（ P<0.01），G¹期、S期細(xì)胞百分率顯著降低（P<0.05）;早、晚期凋亡率均顯著增加（P<0.05）;EGFR、PKC-a蛋白相對(duì)表達(dá)量顯著降低（P<0.01）。與TE-1/EC-1瓜蒂水提物組比較，TE-1/EC-1瓜蒂醇提物組細(xì)胞克隆形成率顯著下降（P<0.05）;G²期細(xì)胞率顯著升高（P<0.05）;EGFR、PKC-a蛋白相對(duì)表達(dá)量顯著降低（P<0.01）;TE-1瓜蒂醇提物組早、晚期細(xì)胞凋亡率顯著降低（JP<0.05）;EC-1瓜蒂醇提物組早、晚期細(xì)胞凋亡率顯著升高（P<0.05）。結(jié)論：瓜蒂水提物和醇提物可影響TE-1、EC-1細(xì)胞增殖、遷移、克隆形成的能力，促進(jìn)細(xì)胞凋亡，其作用機(jī)制可能與下調(diào)EGFR、PKC-a蛋白有關(guān)。關(guān)鍵詞瓜蒂;食管癌;水提物;醇提物;細(xì)胞增殖;細(xì)胞遷移;克隆形成;作用機(jī)制

食管癌是全球十大癌癥之一，2018年新增病例572000例，死亡率居全球第6位，5年生存率低于20% [1-2]，其中亞洲是食管癌的高發(fā)區(qū)[3]。由于對(duì)食管癌發(fā)病機(jī)制的認(rèn)識(shí)有限，目前缺乏特異性的臨床診斷指標(biāo)，加之其早期癥狀不典型，故大部分患者確診時(shí)已處于中晚期，錯(cuò)失了手術(shù)機(jī)會(huì);而且臨床化療副作用較大，化療耐藥不斷出現(xiàn)，致使化療效果欠佳[4]。雖然近幾年出現(xiàn)了針對(duì)表皮生長因子受體（EGFR）、程序性細(xì)胞死亡蛋白1通路（PDl-PDL1）等的靶向治療方法[5-6]，但腫瘤的發(fā)生發(fā)展涉及多階段、多個(gè)基因及多條信號(hào)通路的異常，機(jī)制復(fù)雜，致使靶向藥物的研發(fā)和應(yīng)用也受到限制，大部分食管癌患者仍然不能得到有效的治療[7]。

為尋找抗腫瘤作用的有效新藥，本課題組前期以人食管癌細(xì)胞為模型，做了大量的中藥方劑篩選，發(fā)現(xiàn)《傷寒論》中瓜蒂散水提物能夠明顯抑制食管癌細(xì)胞增殖[8]。瓜蒂是葫蘆科植物甜瓜（Cucumis melo L）的果蒂，其性味苦寒有毒，歸足陽明胃經(jīng)，具有涌吐痰食、祛濕退黃的功效[9]。有研究發(fā)現(xiàn)，瓜蒂水提物、醇提物對(duì)人胃腺癌SGC-7901細(xì)胞、人肺癌NCI-H460細(xì)胞、人肝癌SMMC-7721細(xì)胞、人白血病K562細(xì)胞及小鼠成纖維細(xì)胞L929的增殖有明顯抑制作用[10]。其主要成分葫蘆素類成分，也具有強(qiáng)大的抗腫瘤作用，同時(shí)可以降壓、抑制心肌收縮力、減慢心律及抗炎[11-13]。

為了進(jìn)一步明確瓜蒂抗食管癌細(xì)胞的主要成分及機(jī)制，筆者研究瓜蒂水提物和醇提物對(duì)人食管癌TE-1、EC-1細(xì)胞的增殖、遷移、克隆形成、細(xì)胞周期、細(xì)胞凋亡的影響;同時(shí)考察其對(duì)細(xì)胞EGFR及其下游的中心分子蛋白激酶C-a（PKC-a）蛋白表達(dá)的影響，進(jìn)行初步的分子機(jī)制研究，以期為瓜蒂臨床應(yīng)用及新藥研發(fā)提供參考。

l 材料

1，1 儀器

xCElligence型實(shí)時(shí)無標(biāo)記細(xì)胞功能分析（RTCA）儀（美國ACEA生物公司）;ELx800型酶標(biāo)儀（美國Bio-Tek公司）;RE5299FACSCalibur型流式細(xì)胞儀（美國BD公司）;BPN-80CW型細(xì)胞培養(yǎng)箱（美國Kendro公司）;Ax-iovert20型倒置顯微鏡（德國Zeiss公司）。

1.2 藥品與試劑

瓜蒂藥材（批號(hào)：20103112）購自河南本草國藥館，經(jīng)河南中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院陳隨清教授鑒定為真品;RP-MI1640培養(yǎng)基（美國Gibco公司，批號(hào)：1877236）;胎牛血清（澳大利亞AusGenex公司，批號(hào)：FBSSA00518-2）;MTT（批號(hào)：511C023）、胰蛋白酶（批號(hào)：20326B）均購自美國Sigma公司;乙二胺四乙酸（EDTA，批號(hào)：0105-1KG）、二甲基亞砜（DMSO，批號(hào)：821D036）均購自美國Amresco公司;青霉素干粉（華北制藥股份有限公司，批號(hào)：H20013036，規(guī)格：80萬單位）;鏈霉素干粉（山東魯抗股份有限公司，批號(hào)：120913，規(guī)格：100萬單位）;流式細(xì)胞周期檢測試劑盒（江蘇凱基生物技術(shù)股份有限公司，批號(hào)：KGA511-KGA512）;流式細(xì)胞凋亡檢測試劑盒（杭州聯(lián)科生物技術(shù)股份有限公司，批號(hào)：AP101）;兔抗EGFR單克隆抗體（批號(hào)：GR320346-9）、兔抗PKC-a單克隆抗體（批號(hào)：GR316444-6）、兔抗人肌動(dòng)蛋白β（β-actin）單克隆抗體（批號(hào)：GR3176819-2）均購自英國Abcam公司;山羊抗兔免疫球蛋白G（IgG）二抗（北京康為世紀(jì)生物科技有限公司，批號(hào)：00051405）;水為超純水。

1.3 細(xì)胞

人食管癌細(xì)胞株TE-1、EC-1為河南中醫(yī)藥大學(xué)中醫(yī)方證信號(hào)傳導(dǎo)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室保存。

2 方法與結(jié)果

2.1 瓜蒂提取物的制備

2.1.1 瓜蒂水提物稱取瓜蒂藥材20g，加入350mL水浸泡1h，武火煮沸，文火煎煮約1h，放至室溫后過濾，55℃旋蒸至藥液濃稠，50℃真空干燥48h后刮取藥物粉末、稱質(zhì)量，得率為141.2mg/g;取適量瓜蒂水提物粉末用DMSO適量溶解，加水制成質(zhì)量濃度為300mg/mL的瓜蒂水提物母液（以提取物粉末計(jì)，下同），再用培養(yǎng)基稀釋成4mg/mL藥液，0.22μm濾頭過濾除菌，-20℃冰箱保存，備用。

2.1.2 瓜蒂醇提物取瓜蒂藥材100g于粉碎機(jī)中粉碎，按照1：7（m/V）加入95%乙醇700mL，混勻，避光浸泡7d，每日振蕩2次，5min/次;7d后過濾，55℃旋蒸至藥液濃稠，50℃真空干燥48h后刮取藥物粉末、稱質(zhì)量，得率為52.4mg/g;取適量瓜蒂醇提物粉末按“2.1.1”項(xiàng)下“DMSO溶解……備用”處理，即得。

2.2 細(xì)胞培養(yǎng)

將細(xì)胞置于37℃、5% CO²培養(yǎng)箱中，用含10%胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)液進(jìn)行培養(yǎng)。試驗(yàn)時(shí)，細(xì)胞用含EDTA胰蛋白酶進(jìn)行消化，接種于直徑10cm培養(yǎng)皿或96孔培養(yǎng)板中。

2.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 21.O軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)量資料以 ±s表示，多組間比較用單因素方差分析，兩組比較采用f檢驗(yàn)。以概率法[16]計(jì)算半數(shù)抑制濃度（IC⁵⁰）。P<0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2.4 MTT法檢測瓜蒂水提物和醇提物對(duì)兩種細(xì)胞生長的抑制作用

將TE-1、EC-1細(xì)胞以5×10₄個(gè)/mL的細(xì)胞濃度接種于96孔培養(yǎng)板，于37℃，5% C0²條件下貼壁培養(yǎng)24h后加入含有瓜蒂水提物和醇提物的含血清培養(yǎng)基，藥液濃度分別為O（空白組）、1.5625、3.125、6.25、12.5、25、50、100、200μg/mL（每個(gè)濃度平行3孔），繼續(xù)培養(yǎng)48h;去除培養(yǎng)上清，每孔加入0.5mg/mL MTT溶液100μL，繼續(xù)培養(yǎng)4h，棄MTT溶液，然后加入150μL DMSO。用酶標(biāo)儀于570、630nm波長處分別測定各孔吸光度（OD值），計(jì)算兩種細(xì)胞的生長抑制率（%），細(xì)胞生長抑制率=（1-加藥組平均OD值）/空白組平均OD值×100%。兩種細(xì)胞生長抑制率及IC。。測定結(jié)果見表1。

2，5 瓜蒂水提物和醇提物對(duì)兩種細(xì)胞增殖、遷移的影響

2.5.1 增殖試驗(yàn)在E-Plate View 16孔板中加入50μL無血清培養(yǎng)基，于RTCA DP監(jiān)測臺(tái)檢測基線后，在每孔中分別加入100μL TE-1細(xì)胞或EC-1細(xì)胞懸液（1Xl05個(gè)/mL），于超凈臺(tái)中室溫沉降30min后，放回RTCA DP監(jiān)測臺(tái)檢測各孔細(xì)胞指數(shù)。持續(xù)檢測24h后，將細(xì)胞分為TE-1空白組、TE-1瓜蒂水提物組、TE-1瓜蒂醇提物組、EC-1空白組、EC-1瓜蒂水提物組、EC-1瓜蒂醇提物組，每組4個(gè)復(fù)孔。各加藥組每孔加入5μL瓜蒂相應(yīng)的水提物或醇提物IC⁵⁰。濃度的藥液（空白組不加）后繼續(xù)檢測各組細(xì)胞指數(shù)變化，共檢測60h，記錄細(xì)胞增殖曲線。各組細(xì)胞的增殖曲線見圖1。

由圖1可知，與TE-1/EC-1空白組比較，瓜蒂水提物或醇提物均能明顯抑制TE-1細(xì)胞或EC-1細(xì)胞的增殖，且瓜蒂醇提物對(duì)細(xì)胞的抑制作用更明顯，兩種提取物在加藥后30h內(nèi)有增殖抑制作用。

2.5.2 遷移試驗(yàn)將細(xì)胞分為TE-1空白組、TE-1瓜蒂水提物組、TE-1瓜蒂醇提物組、EC-1空白組、EC-1瓜蒂水提物組、EC-1瓜蒂醇提物組，每組4個(gè)復(fù)孔。在CIM-Plate16下室空廣1組每孔中加入165μL含血清培養(yǎng)基，加藥組每孔加入165μL含有瓜蒂水提物或醇提物IC。o濃度的含血清培養(yǎng)基;CIM-Plate16上室中空門組和各加藥組分別加入30μL無血清培養(yǎng)基，將CIM-Plate16置于培養(yǎng)箱中平衡1h。在平衡期間制備兩種細(xì)胞懸液，調(diào)整細(xì)胞懸液濃度均為6xl0₅個(gè)/mL。CIM-Plate16平衡th后，于RTCA DP監(jiān)測臺(tái)上檢測基線，后在CIM-Plate16上室中加入100μL細(xì)胞懸液，室溫沉降30min后，將CIM-Plate16放回RTCA DP監(jiān)測臺(tái)繼續(xù)檢測各組細(xì)胞指數(shù)，共檢測48h，記錄細(xì)胞遷移曲線。各組細(xì)胞的遷移曲線見圖2。

由圖2可知，與TE-1/EC-1空白組比較，TE-1/EC-1各加藥組細(xì)胞遷移緩慢，抑制作用主要集中在加藥后60h內(nèi)，約60h后TE-1、EC-1細(xì)胞遷移進(jìn)入平臺(tái)期。

2.6 瓜蒂水提物和醇提物對(duì)兩種細(xì)胞形態(tài)學(xué)的影響

將TE-1、EC-1細(xì)胞于直徑10cm培養(yǎng)皿中培養(yǎng)24h后，分為TE-1空白組、TE-1瓜蒂水提物組、TE-1瓜蒂醇提物組、EC-1空白組、EC-1瓜蒂水提物組、EC-1瓜蒂醇提物組。各加藥組加入含有瓜蒂水提物或醇提物IC⁵⁰濃度的含血清培養(yǎng)基，空白組加入等體積的空白含血清培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)48h后采用倒置顯微鏡觀察各組細(xì)胞的形態(tài)。各組細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察結(jié)果見圖3。

由圖3可知，TE-1/EC-1空白組細(xì)胞輪廓清晰，形態(tài)規(guī)則;與TE-1/EC-1空白組比較，TE-1/EC-1各加藥組細(xì)胞數(shù)量明顯減少，細(xì)胞結(jié)構(gòu)松散，且可見少量細(xì)胞碎片，多數(shù)細(xì)胞細(xì)胞輪廓消失、變圓，甚至呈不規(guī)則形，細(xì)胞膜皺縮、發(fā)泡。

2.7 瓜蒂水提物和醇提物對(duì)兩種細(xì)胞克隆能力的影響

制備TE-1、EC-1單細(xì)胞懸液，調(diào)整細(xì)胞濃度為8x10₃個(gè)/mL。將細(xì)胞分為TE-1空白組、TE-1瓜蒂水提物組、TE-1瓜蒂醇提物組，EC-1空白組、EC-1瓜蒂水提物組、EC-1瓜蒂醇提物組，每組3個(gè)復(fù)孔，進(jìn)行軟瓊脂克隆形成試驗(yàn)。分別配制0.6%、1.2%的低熔點(diǎn)瓊脂糖溶液，80 0C水浴完全溶解后高壓滅菌，備用;將1.2%低熔點(diǎn)瓊脂溶液與2xRMPI 1640含血清培養(yǎng)基以1：1（V/V）制成0.6%底層瓊脂液，再以0.8mL/孔鋪滿24孔板（TE-1、EC-1細(xì)胞各1個(gè)），室溫靜置凝固;將0.6%低熔點(diǎn)瓊脂液與2xRMPI 1640含血清培養(yǎng)基以1：1（V/V）制成0.3%的上層瓊脂液，每孔加0.8mL上層瓊脂液和100μLTE-1細(xì)胞或EC-1單細(xì)胞懸液。各加藥組分別加入含有瓜蒂水提物或醇提物IC⁵⁰濃度藥液10μL（空白組不加），室溫靜置凝固，再于37℃、5%C0²的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2周。顯微鏡下肉眼觀察細(xì)胞克隆球并計(jì)數(shù)，計(jì)算細(xì)胞克隆數(shù)和克隆形成率，細(xì)胞克隆形成率=平均細(xì)胞克隆數(shù)/每孔接種細(xì)胞數(shù)×100%[8]。各組細(xì)胞的軟瓊脂克隆球觀察結(jié)果見圖4，細(xì)胞克隆形成率見表2。

由圖4可知，TE-1/EC-1空白組在不同的軟瓊脂層有多個(gè)圓形和類圓形細(xì)胞克隆形成，細(xì)胞輪廓清晰、結(jié)構(gòu)緊密、排列整齊、形態(tài)規(guī)則，TE-1/EC-1各加藥組細(xì)胞克隆數(shù)明顯減少、變小，且克隆球呈現(xiàn)不規(guī)則的多邊形、棍棒形，邊緣不光滑，結(jié)構(gòu)松散，皺縮變小，輪廓不清晰。

由表2可知，與TE-1/EC-1空白組比較，TE-1/EC-1瓜蒂各加藥組的細(xì)胞克隆形成率顯著降低（P<0.01）;與TE-1/EC-1瓜蒂水提物組比較，TE-1/EC-1瓜蒂醇提物組細(xì)胞克隆形成率顯著降低（P<0.05）。

2.8 瓜蒂水提物和醇提物對(duì)兩種細(xì)胞周期的影響

將TE-1、EC-1細(xì)胞以lXl0₅個(gè)/mL的濃度接種于直徑10cm的培養(yǎng)皿中，于37℃、5%C02條件下貼壁培養(yǎng)24h后，將細(xì)胞分為TE-1空白組、TE-1瓜蒂水提物組、TE-1瓜蒂醇提物組、EC-1空白組、EC-1瓜蒂水提物組、EC-1瓜蒂醇提物組，每組3個(gè)平行。各加藥組分別加入含有瓜蒂水提物或醇提物IC⁵⁰濃度的藥液，空白組加入RMPI 1640含血清培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)48h后，用15mL離心管收集細(xì)胞，2000 r/min離心3min或棄上清，1mLPBS重懸細(xì)胞，加入乙醇固定細(xì)胞（終體積分?jǐn)?shù)為70%），于4℃下過夜。棄掉乙醇，PBS洗去固定液，加入500μL PI/RNase A染色工作液，室溫避光孵育30min后，用400目篩網(wǎng)過濾細(xì)胞。用流式細(xì)胞儀分析各組細(xì)胞的周期，并用Modifit LT軟件分析不同細(xì)胞周期的百分率。各組細(xì)胞周期的檢測結(jié)果見表3。

與TE-1/EC-1空白組比較，TE-1/EC-1各加藥組G²期細(xì)胞百分率顯著升高（P<0.01），G¹期、S期細(xì)胞百分率顯著降低（P<0.05）;與TE-1/EC-1瓜蒂水提物組比較，TE-1/EC-1瓜蒂醇提物組G²期細(xì)胞百分率顯著升高（P<0.05）。

2.9 瓜蒂水提物和醇提物對(duì)兩種細(xì)胞凋亡的影響

按“2.8”項(xiàng)下方法“將TE-1、EC-1細(xì)胞以……培養(yǎng)48h后”操作，收集細(xì)胞，按Annexin V-FITC細(xì)胞凋亡檢測試劑盒操作說明處理細(xì)胞。用流式細(xì)胞儀檢測各組細(xì)胞的凋亡情況，并用CellQuest軟件分析細(xì)胞凋亡率。各組細(xì)胞凋亡率檢測結(jié)果見表4。

由表4可知，與TE-1/EC-1空白組比較，TE-1/EC-1各加藥組細(xì)胞的早、晚期凋亡率均顯著升高（P<0.05）;與TE-1瓜蒂水提物組比較，TE-1瓜蒂醇提物組早、晚期細(xì)胞凋亡率均顯著降低（P<0.05）;與EC-1瓜蒂水提物組比較，EC-1瓜蒂醇提物組早、晚期細(xì)胞凋亡率均顯著升高（P<0.05）。

2，10 瓜蒂水提物和醇提物對(duì)兩種細(xì)胞中EGFR、PKC-a，蛋白表達(dá)的影響

按“2.8”項(xiàng)下方法“將TE-1、EC-1細(xì)胞以……培養(yǎng)48h后”操作，收集細(xì)胞。采用Western blotting法檢測各組細(xì)胞中EGFR、PKC-a蛋白的表達(dá)情況。將所收集的各組細(xì)胞處理后上樣，進(jìn)行十二烷基磺酸鈉-聚丙烯酰胺（SDS-PAGE）凝膠電泳，轉(zhuǎn)膜，封閉，洗滌，加入EGFR、PKC-a-抗（1：2000）孵育，洗滌，加入二抗（1：1000）反應(yīng)，洗滌后，以ECL試劑盒進(jìn)行曝光、顯影、定影，洗片。采用Image圖像分析軟件對(duì)蛋白的相對(duì)表達(dá)量進(jìn)行分析，以目標(biāo)蛋白與內(nèi)參蛋白（β-actin）的灰度比值表示。各組細(xì)胞中EGFR、PKC-a蛋白表達(dá)的電泳圖見圖5，相對(duì)表達(dá)量的測定結(jié)果見表5。

由表5可知，與TE-1/EC-1空白組比較，TE-1/EC-1各加藥組EGFR、PKC-a蛋白相對(duì)表達(dá)量均顯著降低（P<0.01）;與TE-1/EC-1瓜蒂水提物組比較，TE-1/EC-1瓜蒂醇提物組EGFR、PKC-a蛋白相對(duì)表達(dá)量均顯著降低（P<0.01）。

3 討論

食管癌為常見的消化系統(tǒng)腫瘤，東南亞、東亞地區(qū)發(fā)病率最高，中國的食管癌發(fā)病率也在全球排名前5位[3]。目前植物源藥物如紫杉類、長春堿類、鬼臼素類等藥物的出現(xiàn)給腫瘤治療帶來了新的希望，且具有毒副作用小、不易耐藥等優(yōu)點(diǎn)[14]。近年來對(duì)瓜蒂的主要成分葫蘆素的研究較多，結(jié)果發(fā)現(xiàn)葫蘆素A、B、D、E均具有廣泛的抗腫瘤作用[15-19]，提示瓜蒂提取物可能具有良好的抗腫瘤活性?；诖?，筆者推測瓜蒂提取物也可能對(duì)食管癌具有抗腫瘤活性。

食管癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)移和侵襲是影響其預(yù)后的主要因素[20]。本試驗(yàn)結(jié)果證實(shí)了瓜蒂水提物和醇提物均能夠顯著抑制人食管癌TE-1、EC-1細(xì)胞的增殖，且存在一定的劑量、時(shí)間依賴關(guān)系;其也能夠顯著抑制兩種細(xì)胞遷移，藥物作用時(shí)間主要集中在加藥后60h內(nèi)。細(xì)胞克隆試驗(yàn)結(jié)果證實(shí)瓜蒂水提物和醇提物作用后細(xì)胞克隆球較相應(yīng)空白組明顯減小，數(shù)量明顯減少，提示瓜蒂兩種提取物均能有效降低食管癌細(xì)胞克隆形成能力。

細(xì)胞周期是細(xì)胞生命活動(dòng)的基本過程，細(xì)胞分裂增殖必須通過兩個(gè)關(guān)鍵的周期調(diào)控點(diǎn)，即G¹和G²期調(diào)控點(diǎn)。腫瘤細(xì)胞周期調(diào)控點(diǎn)失調(diào)、凋亡受到抑制，造成腫瘤細(xì)胞過度增殖，病情進(jìn)一步發(fā)展和惡化。幾乎所有的癌基因、抑癌基因的功能效應(yīng)均與細(xì)胞周期機(jī)制有關(guān)，腫瘤可歸屬于一類細(xì)胞周期疾病[21-22]。在本研究中發(fā)現(xiàn)，以瓜蒂水提物和醇提物作用后，兩種細(xì)胞分裂被明顯阻滯在G²期且細(xì)胞早期和晚期凋亡率明顯上升，其中晚期凋亡率高于早期凋亡率。對(duì)于不同細(xì)胞，瓜蒂提取物誘導(dǎo)凋亡的效果不同：在TE-1細(xì)胞中，瓜蒂水提物誘導(dǎo)凋亡的效果強(qiáng)于醇提物;而在EC-1細(xì)胞中，則是瓜蒂醇提物誘導(dǎo)凋亡效果強(qiáng)于水提物。流式細(xì)胞周期和凋亡試驗(yàn)結(jié)果提示瓜蒂水提物和醇提取物均可通過阻滯細(xì)胞周期、誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，以此來達(dá)到抑制兩種食管癌細(xì)胞的目的。

EGFR是原癌基因Cerb B-l的表達(dá)產(chǎn)物，是一種具有酪氨酸激酶活性的跨膜糖蛋白，與相應(yīng)配體結(jié)合后，其信號(hào)通路可調(diào)控細(xì)胞的增殖、凋亡、血管形成及侵襲轉(zhuǎn)移等生命活動(dòng)[23]。多種惡性腫瘤中均可檢測到EGFR的過度表達(dá)，研究發(fā)現(xiàn)EGFR在食管癌組織存在高表達(dá)[14]。EGFR高表達(dá)與腫瘤分化程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、TNM分期有關(guān)[24-25]。PKC是一類富含絲、蘇氨基酸的激酶[27]，PKC-a是其中重要的一種亞型，有促進(jìn)神經(jīng)遞質(zhì)的釋放、突觸塑形、細(xì)胞增生、基因表達(dá)等作用?；罨蟮腜KC-a可催化各種蛋白質(zhì)底物上的絲氨酸或蘇氨酸殘基，使其磷酸化，通過原癌基因絲蘇氨酸蛋門激酶/絲裂原活化蛋白激酶/激活蛋白1（raf-MAPK-APl）、B淋巴細(xì)胞瘤-2基因（bcl-2）、細(xì)胞周期蛋門依賴性激酶抑制蛋白（p27）、小G蛋白超家族激酶A（RhoA）等通路，發(fā)揮其調(diào)節(jié)細(xì)胞生長、分化、周期、遷移、凋亡、基因表達(dá)等多種功能[28-29]，是信號(hào)通路的中心分子之一。EGFR可通過活化PLC-yl從而激活下游PKC-a。本研究顯示，TE-1/EC-1空門組細(xì)胞中EGFR、PKC-a均高表達(dá)，而瓜蒂水提物和醇提物作用后均下調(diào)了EGFR、PKC-a的表達(dá)，提示瓜蒂兩種提取物可能通過部分阻斷EGFR信號(hào)通路發(fā)揮抑制食管癌細(xì)胞增殖與遷移、阻滯細(xì)胞周期、誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的作用。

綜上所述，瓜蒂水提物和醇提物能有效抑制人食管癌TE-1、EC-1細(xì)胞的增殖、遷移，降低細(xì)胞的克隆形成能力，阻滯細(xì)胞周期與誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，其機(jī)制可能與下調(diào)EGFR、PKC-a蛋白表達(dá)有關(guān)。在后續(xù)研究中，可對(duì)瓜蒂提取物中抗食管癌的主要成分、藥理作用及進(jìn)一步的分子機(jī)制進(jìn)行深入挖掘，以期為瓜蒂治療食管癌的臨床應(yīng)用提供參考。

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（收稿日期：2019-08-27修回日期：2019-10-24）

（編輯：唐曉蓮）