miRNA-16、miRNA-146a、miRNA-223在類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎患者外周血中檢測的臨床意義*

鐘麗紅，丘創(chuàng)華，彭紫元，佘吉佳

廣東省深圳市第二人民醫(yī)院：1.干部保健科；2.檢驗(yàn)科，廣東深圳 518000

類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎(RA)是一種常見的全身性自身免疫性疾病，主要特點(diǎn)為對稱性、慢性的滑膜關(guān)節(jié)炎和關(guān)節(jié)病變。目前，RA發(fā)病機(jī)制尚未明確，主要認(rèn)為是由外界環(huán)境因素(感染因素)與自身內(nèi)在因素(遺傳、內(nèi)分泌因素)導(dǎo)致自身免疫功能紊亂而引起的[1]。同時(shí)，RA缺乏有效的治療手段，只能緩解炎癥，延緩病情發(fā)展，所以早期的診斷和治療十分重要。2010版RA診斷標(biāo)準(zhǔn)雖然能夠診斷出更多不典型的RA，但由于存在血清學(xué)指標(biāo)不靈敏的對稱性關(guān)節(jié)炎、自限性關(guān)節(jié)炎和影像學(xué)表現(xiàn)不顯著的關(guān)節(jié)炎，誤診和漏診現(xiàn)象仍然存在。因此，尋找有診斷價(jià)值的新分子標(biāo)志物刻不容緩。

miRNA是一種內(nèi)源性非編碼RNA，長約22個(gè)核苷酸，是人體內(nèi)重要的調(diào)節(jié)器，能調(diào)節(jié)細(xì)胞周期、免疫功能及新陳代謝等生物過程。近年來，miRNA在人類疾病中的作用引起了廣泛的關(guān)注，已有研究表明，miRNA的異常提示自身性免疫疾病的發(fā)生，miRNA的表達(dá)能調(diào)控炎癥因子的分泌，研究者認(rèn)為他們可能參與RA新的調(diào)控機(jī)制[2]，但迄今尚無大量研究證實(shí)。miRNA幾乎存在于人體的所有體液中，如血清、血漿[3]，目前發(fā)現(xiàn)miRNA能夠在血液循環(huán)中穩(wěn)定存在，不會被核糖核酸酶(RNase)降解，并且可被計(jì)量。故miRNA很有潛力成為一種穩(wěn)定的、敏感的分子標(biāo)志物，可能對RA診斷有一定的價(jià)值。為了驗(yàn)證miRNA-16、miRNA-146a、miRNA-223在RA診斷中的作用，本研究通過實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測RA患者外周血中的miRNA-16、miRNA-146a和miRNA-223的相對表達(dá)量，觀察這3項(xiàng)指標(biāo)在RA患者和健康人群之間的差異性；并且與目前臨床上常規(guī)應(yīng)用的RA診斷指標(biāo)[28處關(guān)節(jié)疾病活動(dòng)度評估(DAS28)、類風(fēng)濕因子(RF)、C反應(yīng)蛋白(CRP)]進(jìn)行相關(guān)性分析，構(gòu)建受試者工作特征曲線(ROC曲線)，通過分析曲線下面積(AUC)進(jìn)而比較miRNA-16、miRNA-146a和miRNA-223單獨(dú)及三者聯(lián)合檢測診斷RA的靈敏度和特異度，為RA的發(fā)病機(jī)制研究和臨床診斷提供新的思路。

1 資料與方法

1.1一般資料 68例RA確診患者來自2017年4月至2018年10月深圳市第二人民醫(yī)院風(fēng)濕科門診以及住院患者，其中男17例、女51例，年齡28～65歲、中位年齡46.5歲。健康對照組為同期體檢健康志愿者20例，其中男7例、女13例，年齡25～64歲、中位年齡44.54歲。以上參與者均排除其他自身免疫性疾病和重要器官系統(tǒng)疾病，同時(shí)未使用過糖皮質(zhì)激素及其他免疫抑制劑藥物治療。

1.2主要材料與試劑 反轉(zhuǎn)錄試劑盒(丹麥，Exiqon公司)，實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀(美國，ABI公司)，全自動(dòng)生化分析儀(意大利，Vital Diagnosis公司)，微量核酸蛋白儀(美國，Thcmo Scictific公司)，低溫高速離心機(jī)(美國，Sigma公司)。

1.3方法

1.3.1實(shí)時(shí)熒光定量PCR測定miRNA-16、miRNA-146a、miRNA-223 mRNA表達(dá)水平 采集RA患者、健康志愿者的空腹靜脈血5 mL于EDTA抗凝管中，以3 000 r/min離心5 min后取血漿。根據(jù)試劑盒說明書，提取血漿總RNA，利用微量核酸蛋白儀測定RNA純度判斷是否符合實(shí)驗(yàn)要求，RNA經(jīng)過反轉(zhuǎn)錄取得cDNA，cDNA作為模板進(jìn)行熒光定量PCR檢測。以U6 小核RNA作為內(nèi)參,根據(jù)引物序列進(jìn)行設(shè)計(jì)。在實(shí)時(shí)熒光PCR儀進(jìn)行定量檢測。數(shù)據(jù)采用2-ΔΔCt法分析miRNA-16、miRNA-146a、miRNA-223表達(dá)相對值，ΔΔCt目的基因=ΔCt目的基因-ΔCtU6。U6 snRNA上游檢測引物為TTC GTG AAG CG TCC ATA TTT T ACA CTC；miRNA-146a上游檢測引物為 CAG CTG GGT GAG AAC TGA ATT CCA TGG GT；miRNA-223 上游檢測引物為ACA CTC CAG CTG GGT GTC AGT TTG TCA AAT；miRNA 16 上游檢測引物為ACA CTC CAG CTG GGT AGC AGC ACG TAA ATA TT。

1.3.2DAS評分 DAS28評分細(xì)則如下。(1)壓痛關(guān)節(jié)數(shù)：共檢查28 個(gè)關(guān)節(jié)，包括掌指關(guān)節(jié)、肩關(guān)節(jié)、膝關(guān)節(jié)、兩側(cè)近端指間關(guān)節(jié)、肘關(guān)節(jié)、腕關(guān)節(jié)，計(jì)算關(guān)節(jié)觸痛數(shù)；(2) 腫脹關(guān)節(jié)數(shù)：檢查上述28個(gè)關(guān)節(jié)是否出現(xiàn)腫脹，記錄腫脹關(guān)節(jié)數(shù)；(3)測定紅細(xì)胞沉降率(ESR)；(4)最近7 d患者健康狀況或患者對RA病情活動(dòng)的總體評價(jià):采用0～10 cm 標(biāo)尺，0表示病情無活動(dòng)，10表示病情極度活動(dòng)，中間部分表示 RA不同程度的病情活動(dòng)，數(shù)字越大表示病情活動(dòng)性越強(qiáng)。DAS28=(0.56×壓痛關(guān)節(jié)數(shù)+0.28×腫脹關(guān)節(jié)數(shù))×1/2+0.70×Ln(ESR)×1.08+1.06。

1.3.3RF、CRP的檢測 采用貝克曼2700全自動(dòng)生化分析儀，免疫速率散射比濁法測定RA患者RF、CRP的水平。

2 結(jié) 果

2.1RA患者及健康對照組miRNA-16、miRNA-146a、miRNA-223相對表達(dá)水平比較 RA組患者外周血中miRNA-16、miRNA-146a、miRNA-223的相對表達(dá)水平均顯著高于健康對照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表1。

表1 miRNA-16、miRNA-146a、miRNA-223在 RA組及健康對照組的相對表達(dá)水平

注：與健康對照組相比，#P<0.05。

2.2RA活動(dòng)組、緩解組及健康對照組之間miRNA-16、miRNA-146a、miRNA-223相對表達(dá)水平比較 根據(jù)DAS28評分，進(jìn)一步把RA組分為活動(dòng)組和緩解組，每組34例。結(jié)果顯示活動(dòng)組miRNA-16、miRNA-146a、miRNA-223相對表達(dá)水平高于緩解組和健康對照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。緩解組miRNA-16、miRNA-146a、miRNA-223相對表達(dá)水平與健康對照組相比，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見表2。

表2 RA活動(dòng)組、緩解組與健康對照組間miRNA-16、 miRNA-146a、miRNA-223的相對表達(dá)水平

注：與健康對照組相比，#P<0.05；與緩解組相比，*P<0.05。

注：1～4分別為miRNA-1、miRNA-146a、miRNA-223、三者聯(lián)合使用的ROC曲線。

圖1 miRNA-16、miRNA-146a、miRNA-223及三者聯(lián)合診斷RA的ROC曲線

2.3miRNA-16、miRNA-146a、miRNA-223的表達(dá)與 RA 患者RF、CRP及DAS28評分的相關(guān)性分析 經(jīng)檢測，RA患者的RF水平為(35.74±9.28)IU/mL，CRP水平為(11.58±2.49)mg/L，DAS28評分為(4.17±1.06)分。Pearson分析的發(fā)現(xiàn)，miRNA-16與CRP、DAS28存在正相關(guān)關(guān)系(r>0,P<0.05)。miRNA-146a與CRP、DAS28存在正相關(guān)關(guān)系(r>0,P<0.05)。miRNA-223與RF、CRP存在正相關(guān)關(guān)系(r>0,P<0.05)。見表3。

表3 miRNA-16、miRNA-146a、miRNA-223的表達(dá)與 RF、CRP及DAS28的相關(guān)性

2.4miRNA-16、miRNA-146a、miRNA-223的表達(dá)水平對RA的診斷效能 單獨(dú)使用miRNA-16、miRNA-146a、miRNA-223作為診斷RA的標(biāo)志物，得到AUC分別為0.63、0.75、0.89，靈敏度分別為68.70%、85.24%、87.63%，特異度分別為55.39%、63.57%、90.35%。三者聯(lián)合使用作為診斷RA的標(biāo)志物，得到AUC為0.91，靈敏度為89.34%，特異度為91.56%。見圖1。

3 討 論

目前，RA的診斷標(biāo)準(zhǔn)由美國風(fēng)濕病學(xué)會(ACR)1978年修訂，通常達(dá)到此標(biāo)準(zhǔn)的患者的疾病已經(jīng)發(fā)展到一定程度，甚至出現(xiàn)了不可逆的病理改變。后來，ACR聯(lián)合歐洲抗風(fēng)濕聯(lián)盟(EULAR)提出新的 RA分類標(biāo)準(zhǔn)和評分系統(tǒng)。新標(biāo)準(zhǔn)加入了新的血清學(xué)指標(biāo)，對及早診斷RA有一定幫助但并不納入診斷指標(biāo)。目前監(jiān)測RA的指標(biāo)主要為實(shí)驗(yàn)室指標(biāo)RF、CRP和臨床指標(biāo)DAS28。DAS28評分作為目前臨床最好的綜合指標(biāo)，主要用于監(jiān)測RA病情活動(dòng)度及評定藥物有效性，但評價(jià)方法復(fù)雜不便于廣泛應(yīng)用。RF是在RA相關(guān)抗原的刺激下由免疫細(xì)胞分泌的自身抗體，CRP是由于關(guān)節(jié)炎癥引起分泌異常的一種急性時(shí)相反應(yīng)蛋白。RF、CRP的檢測操作雖簡單，均在評定患者健康狀況、組織病變狀況等方面起重要作用，但其他自身免疫性疾病患者也存在RF分泌異常，而CRP僅存在于急性炎癥時(shí)期，故應(yīng)用RF、CRP、DAS28早期診斷RA存在一定的局限性。近年來，miRNA被認(rèn)為是免疫功能及炎性反應(yīng)發(fā)生過程的參與者[4]，miRNA-16、miRNA-146a、miRNA-223有希望成為RA早期診斷及預(yù)后評估的新型分子標(biāo)記物，然而目前尚無大量研究證實(shí)其實(shí)際的診斷價(jià)值。

miRNA在人體內(nèi)廣泛分布于外周血和組織細(xì)胞中，有研究表明，外周血中的miRNA能在室溫的條件下過夜，并且能經(jīng)受反復(fù)凍融、高溫等操作，在過酸、過堿的條件下也能穩(wěn)定存在，同時(shí)，組織和外周血中的miRNA具有相同的改變趨勢[5]，說明外周血中miRNA替代組織活檢成為新型生化指標(biāo)的可能。近年來，miRNA在RA的研究中所扮演的角色越來越重要。miRNA-16是一類在淋巴疾病中廣泛表達(dá)的miR-15/16簇，能通過負(fù)反饋環(huán)調(diào)節(jié)NF-κB信號通路進(jìn)而發(fā)揮抑制細(xì)胞凋亡的作用[6]。WANG等[7]應(yīng)用qRT-PCR法檢測到RA患者外周血中miRNA-16、miRNA-21、miRNA-451、miRNA-223表達(dá)水平顯著升高。CASTRO-SANTOS等[8]的研究表明，外周血中的miRNA-16水平能夠區(qū)分健康人、骨性關(guān)節(jié)炎(OA)患者及RA患者，且在RA患者的外周血中明顯上升。miRNA-146a是miRNA-146中的一種亞型。研究顯示miRNA-146a來源于CD4+T細(xì)胞，并在滑膜成纖維細(xì)胞、外周血單核細(xì)胞以及關(guān)節(jié)液中高表達(dá)。同時(shí)，miRNA-146a參與抑制 RA滑膜成纖維細(xì)胞的炎性反應(yīng)，主要通過下調(diào) IRAK-1的表達(dá)來抑制滑膜成纖維細(xì)胞的增殖和分泌 IL-8、IL-6等炎癥因子發(fā)揮作用[9]。劉琴等[10]采用qRT-PCR檢測活動(dòng)期RA患者和緩解期RA患者血清中miRNA-146a的表達(dá)水平，結(jié)果顯示活動(dòng)期RA患者血清miRNA-146a水平顯著高于緩解期RA患者及健康人(P<0.05)，認(rèn)為血清miRNA-146a水平可作為活動(dòng)期RA的診斷指標(biāo)。馮知濤等[11]檢測RA患者及健康人外周血單核細(xì)胞(PBMs)中miRNA-146a、miRNA-16的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)RA患者miRNA-146a、miRNA-16的表達(dá)顯著高于健康人，且miRNA-146a、miRNA-16表達(dá)與CRP、ESR和DAS28評分呈正相關(guān)關(guān)系。miRNA-223作為參與調(diào)節(jié)破骨細(xì)胞分化的潛在分子標(biāo)記物，提示miRNA-223可能與RA患者關(guān)節(jié)的不可逆性損傷有關(guān)。MURATA等[12]證實(shí)miRNA-223通過抑制胰島素樣生長因子-1(IGF-1)的分泌來干預(yù)炎癥相關(guān)因子IL-10的產(chǎn)生，由此可知 miRNA-223能調(diào)控炎癥相關(guān)因子的分泌從而參與 RA的免疫反應(yīng)過程。在治療時(shí)間較久的RA患者外周血中miRNA-223的水平與治療時(shí)間較短的RA患者相比，明顯下降[13]，說明miRNA-223能在一定程度上反映治療效果。

本試驗(yàn)結(jié)果與上述研究結(jié)果一致，RA患者外周血中的miRNA-16、miRNA-146a、miRNA-223的相對表達(dá)水平顯著高于健康對照組，提示miRNA-16、miRNA-146a、miRNA-223在RA患者外周血中異常高表達(dá)，這3項(xiàng)指標(biāo)有潛力應(yīng)用于輔助鑒別健康人群和RA患者。另外，本研究發(fā)現(xiàn)RA活動(dòng)組miRNA-16、miRNA-146a、miRNA-223的相對表達(dá)水平均顯著高于RA緩解組，miRNA-16、miRNA-146a、miRNA-223與RA常用診斷指標(biāo)RF、CRP，以及反映RA活動(dòng)度的DAS28評分存在一定的相關(guān)性，所以筆者推斷外周血miRNA-16、miRNA-146a、miRNA-223與RA的活動(dòng)度相關(guān)，可能參與疾病的發(fā)生、發(fā)展。為觀察這3項(xiàng)指標(biāo)作為RA診斷標(biāo)志物的靈敏度和特異度，本研究建立了miRNA-16、miRNA-146a、miRNA-223單獨(dú)檢測及聯(lián)合檢測的ROC曲線。結(jié)果顯示，單獨(dú)檢測這3項(xiàng)指標(biāo)作為RA標(biāo)志物時(shí),miRNA-223的AUC、靈敏度和特異度在三者中最高，而聯(lián)合使用三者作為RA標(biāo)志物時(shí)，AUC、靈敏度和特異度較單獨(dú)使用時(shí)高，說明miRNA-146a、miRNA-223、miRNA-16聯(lián)合檢測診斷RA的效能較好。

綜上所述，miRNA-146a、miRNA-223、miRNA-16有利于診斷RA，取樣方便、安全，可作為臨床輔助診斷方法。