急性弛緩性麻痹監(jiān)測系統(tǒng)實驗室檢測方法研究進(jìn)展*

彭靖堯，趙 華，黃 為，謝武娟，凌 華，張 敏 綜述，王 亞 審校

1.重慶市疾病預(yù)防控制中心,重慶 400042；2.重慶市江北區(qū)疾病預(yù)防控制中心，重慶 400020

急性弛緩性麻痹(AFP)是一大類復(fù)雜綜合征的統(tǒng)一名稱。廣義的理解下，AFP是對所有能引起肌張力減弱、肌力下降、腱反射消失疾病的統(tǒng)稱,按其病因又可以分為傳染性病例和非傳染性病例,并且絕大多數(shù)的病例是傳染性的[1]。全球AFP研究領(lǐng)域中對AFP的定義是一種狹義的定義，就是世界衛(wèi)生組織在倡導(dǎo)消滅脊髓灰質(zhì)炎建立AFP監(jiān)測系統(tǒng)中對AFP的定義[2]。盡管監(jiān)測系統(tǒng)中的定義不能涵蓋所有AFP，但它幾乎包含了所有的傳染性AFP病例，尤其是由脊髓灰質(zhì)炎病毒(PV)導(dǎo)致的AFP。在這個定義下進(jìn)行的AFP防控工作，已經(jīng)取得了可喜的成就。從1988年至今，全世界范圍內(nèi)，由PV引起的AFP已經(jīng)下降了99%[3]。PV引起的AFP在我國曾經(jīng)廣泛流行，是兒童致殘和死亡的重要因素[4]。我國的AFP防控工作成效顯著，在2000年就進(jìn)入了無脊髓灰質(zhì)炎狀態(tài)[5]。這不僅得益于脊髓灰質(zhì)炎減毒活疫苗(OPV)的廣泛使用，更與AFP監(jiān)測系統(tǒng)的高效工作密不可分。AFP監(jiān)測系統(tǒng)中，病原的實驗室檢測工作至關(guān)重要，監(jiān)測系統(tǒng)定義下的AFP的病原體主要是包括PV在內(nèi)的腸道病毒，本文針對AFP病原體的實驗室檢測方法進(jìn)行綜述。

1 AFP的病原體

全球范圍內(nèi)的AFP監(jiān)測研究顯示，能引起AFP的病原體主要是腸道病毒(EV)，包括PV和其他非脊髓灰質(zhì)炎腸道病毒(NPEV)[6-7]。腸道病毒屬小RNA科，是一個大家族，其基因組是單股正鏈RNA,含有VP1、VP2、VP3、VP4四個結(jié)構(gòu)蛋白編碼區(qū)域，分別編碼4種結(jié)構(gòu)蛋白，VP1、VP2、VP3位于其表面，決定著血清型，VP4區(qū)位于其內(nèi)部，其核苷酸序列相對保守。在早些年研究當(dāng)中，研究人員習(xí)慣將腸道病毒劃分為?？刹《?、柯薩奇病毒、PV以及新型腸道病毒。一直以來，PV在AFP研究領(lǐng)域中扮演重要的角色，在對PV的研究中，世界衛(wèi)生組織定義了脊髓灰質(zhì)炎野病毒(WPV)[8]、疫苗高變異脊髓灰質(zhì)炎病毒(VHMPV)、疫苗衍生脊髓灰質(zhì)炎病毒(VDPV)[9]。PV有3個型別，Ⅰ型、Ⅱ型、Ⅲ型，其血清型分型和基因分型結(jié)果高度一致[10]。隨著研究的不斷深入，近年來對腸道病毒的分類有了新的標(biāo)準(zhǔn)。基于腸道病毒VP1區(qū)，腸道病毒劃分為A、B、C、D 4組[11]，按照腸道病毒VP1區(qū)序列特點(diǎn)，腸道病毒的基因型多達(dá)100多種[12]。越來越多新型別的NPEV被證實能導(dǎo)致AFP,其中最多的是腸道病毒71型(EV71),其次是腸道病毒D68型(EVD68)[13]。近些年的研究發(fā)現(xiàn)，PV的減毒疫苗株可以與C組腸道病毒發(fā)生重組，PV衣殼蛋白被根除后，其基因組剩余部分可以在其他C組腸道病毒中無限期存活，這就為產(chǎn)生新的能引起AFP的腸道病毒提供了有力進(jìn)化條件[14]。

2 AFP病原體實驗室檢測方法

自1988年世界衛(wèi)生組織提出消滅脊髓灰質(zhì)炎計劃，倡導(dǎo)在全球范圍內(nèi)根除脊髓灰質(zhì)炎以來[15]，全球AFP監(jiān)測實驗室針對AFP病原體(PV和NPEV)開展了大量的監(jiān)測工作，各種關(guān)于AFP病原體的檢測方法大致可分為病毒分離、血清學(xué)鑒定方法、聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)、核苷酸序列測定及分析。

2.1PV和NPEV的病毒分離 病毒分離是病毒性疾病診斷的金標(biāo)準(zhǔn)，在AFP監(jiān)測工作中，病毒分離也是病原學(xué)監(jiān)測工作的基礎(chǔ)，病毒分離得到的高濃度和高純度的毒株可以應(yīng)用于其他相關(guān)的更深入的研究。我國于1991年開始開展AFP監(jiān)測工作，在開展AFP監(jiān)測工作之初，AFP監(jiān)測實驗室使用世界衛(wèi)生組織推薦的人喉表皮癌細(xì)胞(Hep-2)和人橫紋肌肉瘤細(xì)胞(RD)對AFP病例的糞便標(biāo)本進(jìn)行病毒分離。包括PV在內(nèi)的腸道病毒能在這兩種細(xì)胞上產(chǎn)生典型的細(xì)胞病變(CPE)，通過倒置顯微鏡直接觀察細(xì)胞形態(tài)就能完成腸道病毒的分離工作。使用RD和Hep-2細(xì)胞在進(jìn)行病毒分離時，這兩種細(xì)胞均能分離PV和NPEV，但缺乏對PV的特異性，1998年，世界衛(wèi)生組織推薦了一種新的轉(zhuǎn)人PV受體的小鼠細(xì)胞(L20B)來進(jìn)行PV的分離，同時仍采用RD細(xì)胞進(jìn)行腸道病毒的分離[16]。同一時期的相關(guān)研究均表明，使用L20B和RD細(xì)胞進(jìn)行PV和腸道病毒分離時，L20B細(xì)胞對PV有著極強(qiáng)的特異性和敏感性，對PV有著更準(zhǔn)確的分離效果，但是可能會影響NPEV的分離率[17]。在進(jìn)行病毒分離的實驗中，除了防止實驗操作過程中的污染，實驗過程中的質(zhì)量控制也尤為重要，細(xì)胞敏感性實驗和支原體檢測是AFP監(jiān)測實驗室病毒分離工作中常用的質(zhì)量控制手段[18-19]。在較長一段時間內(nèi),AFP監(jiān)測實驗室進(jìn)行病毒分離的實驗中，接種后的RD和L20B細(xì)胞都是連續(xù)觀察7 d，傳兩代，使用RD細(xì)胞和L20B細(xì)胞進(jìn)行病毒分離的實驗室檢測中，習(xí)慣于把L20B細(xì)胞分離陽性毒株叫作PV，L20B細(xì)胞陰性而RD細(xì)胞陽性分離毒株叫作NPEV。從2013年1月1日起，在世界衛(wèi)生組織推薦下，AFP監(jiān)測實驗室開始實施新的病毒分離流程，新病毒分離流程不但縮短了病毒分離時間，還使用了交叉轉(zhuǎn)種的方法(即RD細(xì)胞CPE陽性需轉(zhuǎn)種L20B細(xì)胞，L20B細(xì)胞CPE陽性需轉(zhuǎn)種RD細(xì)胞)，這種方法很大程度上提高了病毒分離物的純度和濃度[20]。新分離流程還更科學(xué)地為病毒分離物進(jìn)行了定義，經(jīng)新流程分離后最終L20B細(xì)胞CPE陽性后且轉(zhuǎn)種RD細(xì)胞CPE陽性稱為L20B陽性分離物，是否屬于PV需要進(jìn)一步鑒定。經(jīng)新流程最終只有RD細(xì)胞CPE陽性分離產(chǎn)物仍稱作NPEV。AFP監(jiān)測實驗室中病毒分離流程變更情況對比詳見表1。

表1 我國AFP監(jiān)測系統(tǒng)病毒分離流程對比

2.2AFP監(jiān)測中的血清學(xué)方法 在AFP監(jiān)測的實驗室工作中，血清學(xué)方法主要被應(yīng)用在早些年的研究中，并且早些年的AFP研究工作重心在PV上，對NPEV不太重視，較少有對NPEV的研究，因此AFP監(jiān)測實驗室的血清學(xué)方法主要針對PV設(shè)計。基于血清學(xué)方法，AFP監(jiān)測實驗室常開展的實驗有PV的血清型鑒定和定型實驗、PV IgM抗體測定、脊髓灰質(zhì)炎疫苗效價測定、人群脊髓灰質(zhì)炎抗體水平檢測實驗、交叉吸附血清ELISA實驗。PV的血清學(xué)鑒定和定型實驗是使用PV的3種特異性型別的抗血清Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ按照組合對病毒進(jìn)行中和實驗，其組合方式有:(1)Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型組合，(2)Ⅰ、Ⅱ型組合，(3)Ⅰ、Ⅲ型組合，(4)Ⅱ、Ⅲ型組合；然后根據(jù)中和實驗結(jié)果反推待鑒定病毒分離物是否屬于PV以及其型別。此方法操作煩瑣，且需要建立在病毒分離培養(yǎng)的方法上，目前已被分子生物學(xué)鑒定方法替代。PV IgM抗體測定是使用ELISA方法檢測AFP病例血清及腦脊液中的特異性IgM，此方法必須在明確患者近期沒有接種疫苗的情況下才適用，并且腦脊液的采集相對麻煩，在AFP監(jiān)測工作中，此實驗較少開展。脊髓灰質(zhì)炎疫苗效價測定實驗的主要目的是為了檢測和評價疫苗在運(yùn)輸和存儲過程中，疫苗效價是否受到影響，該實驗操作煩瑣，同時需要建立在細(xì)胞培養(yǎng)方法的基礎(chǔ)之上[21]。人群脊髓灰質(zhì)炎抗體水平檢測實驗不是AFP監(jiān)測實驗室的常規(guī)檢測，此實驗主要目的是評價免疫策略的有效性，以及了解人群的免疫水平，進(jìn)而針對性地制訂相關(guān)免疫策略[22]。交叉吸附血清ELISA實驗是荷蘭科學(xué)家發(fā)明的用于鑒定PV的方法，該方法可區(qū)分野毒株和疫苗株[23]，但隨著PCR方法的建立，該鑒定方法已經(jīng)很少被使用。

血清學(xué)方法也可以用于NPEV的分型，其原理與PV的分型方法類似，都是依靠病毒分離得到較高濃度和純度的毒株后，再使用相應(yīng)的中和抗體進(jìn)行分型。這種基于血清學(xué)分型的方法，可以將NPEV劃分為60多個血清型，但血清型分型方法必須依賴于病毒的分離，而相關(guān)研究顯示，這種鑒定方法實驗工作量巨大，存在交叉反應(yīng)且對某些變異毒株無法定型[24]。因此，在NPEV的鑒定研究中，血清學(xué)方法逐漸被分子生物學(xué)方法替代。

2.3AFP監(jiān)測中常用的分子生物學(xué)方法 隨著分子生物學(xué)技術(shù)的迅速發(fā)展，分子生物學(xué)檢測方法已經(jīng)被廣泛應(yīng)用到各個領(lǐng)域。AFP監(jiān)測領(lǐng)域使用到分子生物學(xué)方法的實驗有以下幾種:聚合酶鏈反應(yīng)-限制性片段長度多態(tài)性(PCR-RFLP)實驗、實時熒光聚合酶鏈反應(yīng)(rRT-PCR)鑒定實驗、商品化熒光定量PCR試劑檢測、病毒核苷酸序列的測定及分析，這些方法大多基于分子生物學(xué)的經(jīng)典方法——PCR上建立起來的。AFP監(jiān)測實驗室中早期采用PCR-RFLP方法對PV進(jìn)行鑒定，基于PCR和RFLP兩種方法，其原理是先通過PCR對目的片段的擴(kuò)增，然后使用限制性內(nèi)切酶對目的片段進(jìn)行酶切，然后通過電泳觀察限制性酶的圖譜來分析序列間的差異，進(jìn)而達(dá)到分型鑒定的目的[25]。PCR-RFLP方法進(jìn)行PV的鑒定時，由于其引物特異性問題，能擴(kuò)增NPEV，需要先用中和實驗對PV定型，而且此實驗中要使用到較多限制性內(nèi)切酶，操作步驟煩瑣，已經(jīng)被新的型內(nèi)鑒定方法所代替；rRT-PCR鑒定實驗是近年來AFP監(jiān)測實驗室廣泛開展的實驗，此實驗包括PV的型內(nèi)鑒定((ITD)和PV衍生株(VDPV)篩選[26-27]。AFP監(jiān)測系統(tǒng)中rRT-PCR鑒定實驗所使用的試劑盒是由美國疾病預(yù)防控制中心(CDC)研發(fā)的，其中的型內(nèi)鑒定 rRT-PCR實驗通過多對熒光探針標(biāo)記的特異性引物，除了能鑒定出PV、WPV和NPEV外，還能快速鑒定PV的型別，并初步判定出PV屬于疫苗相似(SL)株或非疫苗相似(NSL)株，VDPV rRT-PCR實驗可以將ITD實驗中判定的PV-SL核苷酸變異情況進(jìn)行初步篩查，快速鑒定其是否屬于VDPV。由美國CDC研發(fā)的rRT-PCR鑒定PV的方法，操作方便、快捷，特異性和敏感性高，重復(fù)性好，該方法通過了AFP實驗室網(wǎng)絡(luò)的評估，是世界衛(wèi)生組織推薦的方法。目前，美國CDC針對全球AFP相關(guān)腸道病毒的新特征，不斷優(yōu)化該方法中使用的引物和探針，該方法試劑已升級到5.1版本；近年來，針對PV和NPEV的商品化rRT-PCR檢測試劑盒越來越多。商品化的檢測試劑操作簡單，可同時實現(xiàn)PV和NPEV的檢測和分型，但商品化的檢測試劑缺乏可靠的評估和有效的質(zhì)量控制手段，不能用作AFP監(jiān)測實驗室的常規(guī)方法，只能作為輔助的鑒定手段。

病毒核苷酸序列的測定及分析，在現(xiàn)階段病毒學(xué)研究中占有越來越重要的地位，其方法學(xué)越來越成熟，使用也越來越廣泛。一直以來，AFP監(jiān)測實驗室中選用腸道病毒VP1區(qū)作為目的基因進(jìn)行相關(guān)研究，包括腸道病毒的檢測和鑒定分型等，該方法由OBERSTE等人在1999年建立[28]?；赩P1區(qū)的序列特點(diǎn)，AFP研究領(lǐng)域定義了VDPV(即Ⅰ型和Ⅲ型PV，其VP1編碼區(qū)域與Saibin株比較，變異率>1%且<15%。Ⅱ型PV，VP1編碼區(qū)域與Saibin株比較，變異率>0.6%且<15%)，在AFP監(jiān)測工作中，通過VP1區(qū)的序列分析，可以確定PV是否屬于VDPV，為AFP的防控工作提供科學(xué)依據(jù)。在NPEV的研究中，VP1區(qū)的序列特點(diǎn)被廣泛應(yīng)用于NPEV基因型別的劃分，越來越多引起AFP的NPEV被確定型別[1]，VP1區(qū)分型還有一個顯著的特點(diǎn)就是與血清中和實驗方法進(jìn)行分型的結(jié)果具有較好的一致性，因此VP1區(qū)分型方法可靠、準(zhǔn)確，是最常用的腸道病毒基因分型方法。雖然使用VP1區(qū)分型方案一直被視為腸道病毒分型的金標(biāo)準(zhǔn)，但相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)腸道病毒VP1區(qū)的變異程度最大，針對VP1區(qū)很難設(shè)計通用引物，因此，腸道病毒研究領(lǐng)域開始使用相對保守的VP4區(qū)進(jìn)行分型研究[29]。腸道病毒VP4區(qū)核苷酸序列全長僅207 bp，相對于VP1區(qū)設(shè)計引物更容易，實驗操作更方便、快捷，可以提高分型效率。在腸道病毒研究中，研究人員發(fā)現(xiàn)腸道病毒基因組存在重組現(xiàn)象[30-31]，因此，使用單一片段對腸道病毒進(jìn)行分型可能不準(zhǔn)確，要獲得更準(zhǔn)確的分型結(jié)果必須采用多片段分型方法相結(jié)合。隨著測序方法的不斷成熟，在腸道病毒研究中，研究人員為了確保分型的準(zhǔn)確，開展了越來越多的針對腸道病毒全基因組序列的研究[32-33]。隨著新一代基因測序技術(shù)的不斷普及，病毒的全基因組研究已經(jīng)變得更加簡單、易行[34]。

3 展 望

時至今日，在世界衛(wèi)生組織的極力倡導(dǎo)和全球AFP監(jiān)測網(wǎng)絡(luò)實驗室的共同努力下，AFP的防控工作已經(jīng)取得了長足的進(jìn)展，尤其是對PV引起的AFP的防控。在針對PV的防控工作中，全球范圍有效控制了WPV傳播，近年報道WPV的國家僅有阿富汗、尼日利亞和巴基斯坦[15]。目前，全球越來越多的國家完成了WPV的封存工作，Ⅱ型PV的封存工作也正在全球范圍內(nèi)按照世界衛(wèi)生組織全球行動計劃(GAPⅢ)的相關(guān)要求有序進(jìn)行[35]。盡管如此，AFP仍然是一項全球范圍內(nèi)的公共健康問題[36],在全球消滅脊髓灰質(zhì)炎的新階段，更及時、有效地發(fā)現(xiàn)和控制WPV以及VPDV，是世界衛(wèi)生組織對全球AFP監(jiān)測網(wǎng)絡(luò)實驗室的最新要求。與此同時，引起AFP的新的病原體不斷被發(fā)現(xiàn)、識別和研究。首先是NPEV，NPEV是除PV外，導(dǎo)致AFP的重要病原體，在脊髓灰質(zhì)炎即將被消滅的現(xiàn)階段扮演著重要角色。NPEV是一個大家族，型別繁多，缺乏有效的疫苗對其進(jìn)行防控，并且廣泛存在于自然環(huán)境中，這使得NPEV的防控成為難題和挑戰(zhàn)。此外，近些年的一些研究還發(fā)現(xiàn)，除腸道病毒外，其他病毒也能引起AFP[37]，這也對AFP監(jiān)測工作提出了更高要求。但是，有理由相信，隨著針對AFP的檢測方法多元化以及檢測技術(shù)的不斷提升，在AFP的監(jiān)測工作中，不僅能將PV研究得更透徹、更深入，也能將除PV以外的其他病原體進(jìn)行深入的研究，并將其有效地防控。

總之，目前AFP的防控工作取得可喜成績，AFP監(jiān)測實驗室的檢測工作功不可沒。作為AFP監(jiān)測實驗室，在肯定自己成績的同時，應(yīng)該看到面臨的問題和挑戰(zhàn)，不斷提升實驗室的檢測技術(shù)能力，更好地為疾病的防控提供病原學(xué)依據(jù)。