自噬相關(guān)基因ATG4A rs807185位點(diǎn)單核苷酸多態(tài)性與重慶地區(qū)人群肺癌的相關(guān)性研究*

陳 姝，賀 巧，胡 琴，陳維賢，胡 銳

1.重慶醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院檢驗(yàn)科，重慶 400010；2.重慶市中醫(yī)骨科醫(yī)院檢驗(yàn)科，重慶 400012

肺癌是中國癌癥人群死亡的主要原因，其致病因素包括重金屬中毒、吸煙、遺傳和其他環(huán)境因素。越來越多的證據(jù)表明，遺傳多態(tài)性與肺癌的易感性有關(guān)[1]。

細(xì)胞自噬是一個(gè)高度保守的過程，對(duì)維持細(xì)胞內(nèi)環(huán)境平衡至關(guān)重要，與人類許多疾病相關(guān)。自噬相關(guān)基因(ATGs)是調(diào)節(jié)自噬通路的基因，迄今已發(fā)現(xiàn)超過30種ATGs。ATG4基因編碼的蛋白酶在解偶聯(lián)復(fù)合物ATG8-PE和促進(jìn)自噬體成熟方面有著重要的作用[2]。據(jù)報(bào)道，ATG4A是乳腺癌細(xì)胞致瘤性所必需[3]，對(duì)卵巢癌的預(yù)后判斷也有重要意義[4]。然而，ATG4A在肺癌的作用仍不清楚。本文擬通過病例對(duì)照研究，探討ATG4A基因單核苷酸多態(tài)性(SNP)和肺癌風(fēng)險(xiǎn)的關(guān)系。

1 資料與方法

1.1一般資料 選擇2012年10月至2013年9月在重慶醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院就診的225例肺癌患者作為病例組，其中男180例，女45例；平均年齡(62.8±9.6)歲；36例患者接受過手術(shù)切除，189例患者接受過纖維支氣管鏡活檢，這些患者均按照臨床標(biāo)準(zhǔn)、放射學(xué)和組織病理學(xué)報(bào)告確診為肺癌；腺癌81例，鱗狀細(xì)胞癌89例，小細(xì)胞肺癌22例，其他非鱗狀細(xì)胞癌33例。對(duì)照組選擇重慶醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院體檢中心同時(shí)段內(nèi)的健康體檢者，共257例，其中男203例、女54例，平均年齡(61.7±8.5)歲，性別與年齡分布與病例組相仿，排除惡性腫瘤患者或有任何其他嚴(yán)重慢性疾病病史者。所有受試對(duì)象均自愿參與本研究，并簽署了知情同意書。本研究經(jīng)重慶醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.2方法

1.2.1DNA提取 每例受試者抽取2 mL靜脈血，采用乙二胺四乙酸二鉀(EDTA-K2)抗凝，離心后將上層血漿與下層中上部分血細(xì)胞分裝，-80 ℃冰箱保存。用天根血液基因組DNA提取試劑盒提取外周血基因組DNA，即蛋白酶K消化-飽和氯化鈉鹽析法。并采用紫外分光光度儀測量提取出的DNA濃度及260 nm處吸光度(A值)與A280比值，若DNA A260/A280比值在1.7～2.0則為標(biāo)本純度合格，低于1.8則考慮可能為蛋白污染，高于2.0可能存在RNA污染，不合格標(biāo)本須重新抽提DNA。合格標(biāo)本稀釋至工作濃度后存于-80 ℃冰箱備用。

1.2.2聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)-限制性片段長度多態(tài)性(PCR-RFLP) 采用PCR-RFLP進(jìn)行基因組分型[5]。PCR擴(kuò)增引物為5′-GAGCAGTGCTGTCCAGTAGAA-3′和5′-GGGGGAAATGATCTCTCTCTG-3′，擴(kuò)增產(chǎn)物為222 bp。該片段含有Alu Ⅰ酶切位點(diǎn)，取產(chǎn)物4 μL,采用限制性內(nèi)切酶AluⅠ(酶切序列為5′-AGCT-3′)針對(duì)rs807185位點(diǎn)進(jìn)行酶切，在A等位基因存在情況下，產(chǎn)物可被消化成88 bp和134 bp，而具有T等位基因的產(chǎn)物不能被消化。為進(jìn)一步確認(rèn)基因型，選擇對(duì)照組和病例組中不同基因型別的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物送至上海生工公司測序，分析測序結(jié)果并與酶切分型結(jié)果進(jìn)行比對(duì)，以確認(rèn)酶切分型結(jié)果準(zhǔn)確性。

2 結(jié) 果

2.1病例組和對(duì)照組的臨床特征 如表1所示，病例組男女比為80∶20，對(duì)照組男女比為79∶21，兩組之間在性別上差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.822)；納入研究的兩組研究對(duì)象均以年齡超過55歲的人群為主，約占80%，兩組之間年齡差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.169)。病例組中吸煙者的比例較對(duì)照組高，分別為70.2%和41.2%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001)。病例組中有腫瘤家族史的比例較對(duì)照組高，分別為13.3%和7.0%。

表1 病例組與對(duì)照組肺癌的臨床特征

注：a小細(xì)胞肺癌和Ⅰ～ⅢB期非鱗狀細(xì)胞癌；b小細(xì)胞肺癌和Ⅳ期非鱗狀細(xì)胞癌。

2.2ATG4A rs807185多態(tài)性與肺癌的相關(guān)性

2.2.1ATG4A rs807185位點(diǎn)的基因型分析及測序結(jié)果 純合突變基因型(AA)PCR產(chǎn)物可被切割為88 bp和134 bp兩個(gè)片段，野生基因型(TT)不能被切開，仍然為222 bp的一個(gè)片段，而雜合突變基因型(AT)則被部分切開，出現(xiàn)88、134 bp和222 bp 3個(gè)片段(圖1)。測序結(jié)果證實(shí)了PCR-RFLP分析結(jié)果的正確性。

2.2.2ATG4A基因多態(tài)性分析 對(duì)照組中突變等位基因A的頻率高于病例組中的頻率(37.7%vs.24.9%，P=0.006)，校正OR為1.989(95%CI：1.223～3.236)。與TT基因型相比，AA基因型攜帶者患肺癌的風(fēng)險(xiǎn)顯著降低(校正OR=0.317，95%CI：0.174～0.575，P<0.001)，而在AT基因型的攜帶者中未發(fā)現(xiàn)顯著關(guān)聯(lián)。此外，SNP位點(diǎn)rs807185 多態(tài)性在隱性模型(校正OR=0.315，95%CI：0.178～0.556，P<0.001)和加性模型(校正OR=1.612，95%CI：1.228～2.115，P=0.001)中均顯示與肺癌風(fēng)險(xiǎn)顯著相關(guān)。非條件Logistic回歸分析表明rs807185的等位基因與肺癌風(fēng)險(xiǎn)降低相關(guān)(校正OR=0.605，95%CI：0.456～0.803，P<0.001)。見表2。

注：A圖為PCR-RFLP產(chǎn)物分析，泳道1、5、6、7、9、10、14和15顯示TT基因型(222 bp)，泳道2、8、11、12和13顯示AA基因型(134 bp和88 bp)，泳道3和4顯示AT基因型(222、134、88 bp)。B圖中不同基因型的部分序列顯示在該色譜圖和等位基因上，rs807185標(biāo)有箭頭，每個(gè)波代表色譜圖中的一種核苷酸(A，T，G或C)，TT和AA具有一個(gè)波，然而，AT具有兩個(gè)波，其中一個(gè)(較高波)代表T，另一個(gè)代表A。

圖1采用PCR-RFLP和DNA測序?qū)NPrs807185進(jìn)行基因分型

表2 病例組和對(duì)照組中ATG4A內(nèi)含子SNP rs807185與肺癌風(fēng)險(xiǎn)的關(guān)聯(lián)

注：a校正后的非條件Logistic回歸模型，校正因素包括年齡、性別、吸煙史、飲酒狀況、腫瘤家族史以及肺癌組織病理學(xué)分型和轉(zhuǎn)移程度。

注：ATG4A SNP基因型與隱性模型不同亞組間肺癌風(fēng)險(xiǎn)的分層分析，不同亞組具有不同的校正后的年齡、性別、吸煙史、飲酒狀況、腫瘤家族史，肺癌的組織病理學(xué)分型和轉(zhuǎn)移程度。 *表示重要的OR。AC為腺癌；NSCLC為非鱗狀細(xì)胞癌；SCC為鱗狀細(xì)胞癌；SCLC為小細(xì)胞肺癌。

圖2分層組中rs807185的校正優(yōu)勢比(OR)森林圖

2.3分層分析 為了排除其他因素對(duì)結(jié)果的影響，本研究進(jìn)一步進(jìn)行了分層分析以評(píng)估rs807185的AA基因型對(duì)隱性模型中不同亞組肺癌風(fēng)險(xiǎn)的影響，結(jié)果如圖2。在分別調(diào)整年齡、性別、吸煙史、飲酒狀況、腫瘤家族史、肺癌組織病理學(xué)分類和轉(zhuǎn)移程度后，rs807185位點(diǎn)的AA基因型與不同亞組肺癌發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)的降低存在相關(guān)性，但在本研究的女性中沒有觀察到相關(guān)性。

3 討 論

目前，自噬機(jī)制在癌癥發(fā)生和發(fā)展中的作用尚未明確，部分研究者認(rèn)為在不同的腫瘤類型和微環(huán)境中可能有著不同的作用。有報(bào)道認(rèn)為在肺癌中自噬可能發(fā)揮抑制腫瘤的作用[6]。然而，一些研究仍支持自噬能夠提高癌細(xì)胞存活率的觀點(diǎn)[7]。自噬相關(guān)基因ATG4的表達(dá)增加與腫瘤發(fā)展和抑制以及癌癥治療抗性相關(guān)。因此，相關(guān)研究認(rèn)為這些蛋白質(zhì)可能在癌癥治療中發(fā)揮潛在或新靶點(diǎn)的作用[8]。至今，已經(jīng)在哺乳動(dòng)物中鑒定出4種自噬相關(guān)基因ATG4亞型(A～D)。ATG4B在結(jié)直腸癌細(xì)胞中的表達(dá)明顯增加，ATG4B的抑制可降低自噬活性，從而使癌細(xì)胞對(duì)治療劑敏感[9]。ATG4C與營養(yǎng)應(yīng)激條件下自噬的減少相關(guān)，并最終導(dǎo)致對(duì)纖維肉瘤的易感性增加[10]。ATG4C過表達(dá)可阻止由共濟(jì)失調(diào)-毛細(xì)血管擴(kuò)張癥突變基因(ATM)下調(diào)引起的乳腺癌干細(xì)胞微球體缺陷的發(fā)生[11]。ATG4D可作為結(jié)直腸癌發(fā)生中的癌抑制因子，有研究發(fā)現(xiàn)結(jié)直腸癌細(xì)胞中ATG4D的表達(dá)水平較癌旁組織明顯下調(diào)[12]。WOLF等[3]曾報(bào)道過乳腺癌與自噬調(diào)節(jié)因子ATG4A之間的相關(guān)性。但ATG4A在自噬和致瘤性中的具體作用仍有待研究。以往研究報(bào)道ATG4A自噬基因突變(rs5973822)與克羅恩病中的肉芽腫有關(guān)(OR=4.13，95%CI：0.97～17.63，P=0.03)，但在比利時(shí)和以色列患者的病例對(duì)照研究中卻未發(fā)現(xiàn)rs807185位點(diǎn)的差異[13]。ATG4A SNP的相互作用可能影響中國西南地區(qū)人群的HPV感染，由此ATG4A可能是宮頸癌的致病因子[14]。本研究結(jié)果表明，在AA基因型或A等位基因的攜帶者中，肺癌發(fā)展的風(fēng)險(xiǎn)顯著降低。rs807185位點(diǎn)位于Xq22.1染色體ATG4A基因的內(nèi)含子區(qū)上。有研究表明，內(nèi)含子多態(tài)性處于連鎖不平衡狀態(tài)，具有一些功能多態(tài)性或一些與癌癥或其他疾病風(fēng)險(xiǎn)相關(guān)的遺傳轉(zhuǎn)錄[15]。因此，自噬相關(guān)基因ATG4A rs807185位點(diǎn)的突變，等位基因A或AA基因型可能對(duì)某些功能多態(tài)性或與肺癌患病風(fēng)險(xiǎn)相關(guān)的一些遺傳轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生影響。rs807185位點(diǎn)突變體可能調(diào)節(jié)ATG4A的表達(dá)水平，也可能影響其他一些蛋白質(zhì)的表達(dá)與功能，并反過來影響自噬機(jī)制。究竟該位點(diǎn)如何發(fā)揮作用從而降低肺癌患病風(fēng)險(xiǎn)的具體機(jī)制尚不清楚，還需更多研究來闡明此現(xiàn)象。并且由于本研究是自噬相關(guān)基因ATG4A rs807185位點(diǎn)與肺癌易感性關(guān)聯(lián)的初步研究，雖然發(fā)現(xiàn)了此現(xiàn)象，但樣本量不夠大，因此其結(jié)果仍需進(jìn)一步擴(kuò)大樣本深入研究。

癌癥與基因多態(tài)性的相關(guān)性研究日益受到重視，并且自噬也成為近年來癌癥研究中的熱點(diǎn)。但是目前，自噬通路中的自噬相關(guān)基因ATG4A rs807185位點(diǎn)與癌癥易感性的相關(guān)研究仍較少。本文就自噬相關(guān)基因ATG4A rs807185位點(diǎn)SNP與重慶地區(qū)人群肺癌風(fēng)險(xiǎn)的相關(guān)性進(jìn)行研究，結(jié)果顯示，在重慶地區(qū)人群中，rs807185位點(diǎn)SNP與肺癌易感性降低存在相關(guān)性。因此筆者認(rèn)為rs807185位點(diǎn)突變可能是肺癌的保護(hù)因子，其具體機(jī)制有待進(jìn)一步研究。