兔血漿應(yīng)用于部分凝血活酶時間（PTT）試驗以評價醫(yī)療器械促凝活性的研究

楊文潤 莫曉彥 顏林 田勝慧 曹穗蘭 楊立峰 廣東省醫(yī)療器械質(zhì)量監(jiān)督檢驗所 （廣東 廣州 510080）

內(nèi)容提要：目的：探究兔血漿應(yīng)用于PTT試驗以評價醫(yī)療器械促凝活性的可行性。方法：以ASTM F2382-04標(biāo)準為研究基礎(chǔ)，選擇5種醫(yī)療器械或材料，在同一試驗條件下，分別使用人血漿和兔血漿進行PTT試驗。結(jié)果：對兩種血漿的PTT試驗結(jié)果進行促凝活性分級，除玻璃珠組的促凝血活性分級有差異外，其他4種醫(yī)療器械或材料的促凝活性分級均為：重度、中度、輕度、極輕。結(jié)論：兔血漿和人血漿的PTT試驗具有良好的一致性，當(dāng)人血漿來源不足時，兔血漿可作為一種比較理想的血漿來源應(yīng)用于PTT試驗以評價醫(yī)療器械的促凝活性。

一般與血液接觸的醫(yī)療器械都需要進行血液相容性評價，以保證其臨床使用的安全[1]。血液相容性評價的凝血試驗類分類中推薦評價PTT這個指標(biāo)[2,3]。由于受限于器械與血液相互作用的認識和其試驗的精確度，標(biāo)準中尚未提供PTT試驗的詳細方法[1,3]。針對這些情況，本研究對國內(nèi)外相關(guān)的標(biāo)準、文獻進行了大量研究。

PTT是指枸櫞酸鈉抗凝的血漿進行再鈣化試驗時加入部分凝血活酶后的凝固時間[1,4]。本研究的PTT試驗是基于活化部分凝血活酶時間（APTT）試驗的改良，PTT試驗中被測材料充當(dāng)激活劑[5]。ASTM F2382-04中表明其PTT試驗的測試方法涵蓋、允許評價心血管器械材料通過內(nèi)源性凝血途徑誘導(dǎo)凝血的能力，其測試方法也是醫(yī)療器械血液相容性評價的一部分[3,5]。

為了使實驗數(shù)據(jù)具有更好的臨床相關(guān)性，相關(guān)標(biāo)準均優(yōu)先推薦使用人血漿進行PTT試驗[1,3,5,6]。但目前我國人血漿主要供應(yīng)于臨床輸血使用，未經(jīng)批準的私自采血屬于違法行為，檢測機構(gòu)開展大批量的PTT試驗時，人血漿很難獲得長期、穩(wěn)定的供應(yīng)。其次，人血漿可能會攜帶艾滋、肝炎、流感等傳染性病毒，使用前必須經(jīng)過檢驗。再加上PTT試驗推薦使用的人血漿要求新鮮，要求使用不超過4h的血漿，所以在日常的檢驗工作中長期大量使用新鮮的人血漿變得極為困難[2,7]。

醫(yī)療器械進行血液相容性評價時也常用到家兔、綿羊、狗等實驗動物模型[1,3]。相關(guān)研究表明，家兔為醫(yī)療器械生物學(xué)評價中一種常用的動物模型，使用家兔動物模型進行評價醫(yī)療器械的血液相容性也較為成熟，因其血液與人的血液有一定的相近之處[4,7]。與人血漿相比，兔血漿更容易獲取，兔的品系、供應(yīng)也更加穩(wěn)定，健康狀況也相對容易控制?；谏鲜鲅芯亢拖嚓P(guān)文獻、標(biāo)準的理論，此次研究擬使用兔血漿和人血漿進行PTT試驗，對兔血漿能否用于PTT試驗作進一步探究[1,2,3,5,6,7]。

1.材料與方法

1.1 一般材料

血漿來源：人血漿由3名健康的志愿者提供；兔血漿采集于3只健康、成年普通級家兔（來源：廣東省廣州市白云區(qū)龍歸興科實驗動物養(yǎng)殖場，合格證號：SCXK（粵）2017-0042（44817200000186））。

試劑耗材：兔腦磷脂凍干粉（北京博爾西科技有限公司，用純水配制成兔腦磷脂懸液[3]）、一次性使用真空采血管（江蘇康健醫(yī)療用品有限公司，管體材質(zhì)為塑料）、3.8%檸檬酸鈉抗凝劑（上海源葉生物科技有限公司）、氯化鈣溶液（希森美康生物科技（無錫）有限公司）、鞣花酸（上海源葉生物科技有限公司）、玻璃珠（海門市俊元實驗器材）。

儀器設(shè)備：全自動血凝分析儀（日本希森美康生物科技有限公司，按ASTM F2382-04的要求設(shè)置增加PTT的檢測項目）、旋轉(zhuǎn)培養(yǎng)器（太倉市實驗設(shè)備廠）、去隔水式恒溫培養(yǎng)箱（上海森信實驗儀器有限公司）、高速冷凍離心機（Eppendorf公司）。

1.2 方法

1.2.1 材料制備

使用人血漿試驗設(shè)為A試驗，使用兔血漿試驗設(shè)為B試驗。A、B試驗各設(shè)6組，每組設(shè)3個平行管，相同條件制備，將制備好的樣品裝進一次性使用真空采血管中，具體如下。

組別1：鞣花酸，用純水配制成10mg/mL懸液，每管加入200μL。

組別2：玻璃珠，直徑約2mm，按5cm2/mL比例，每管加入10cm2。

組別3：導(dǎo)絲，制備成約2.0cm的小段，按0.2g/mL比例，每管加入0.4g。

組別4：顱內(nèi)支撐導(dǎo)管，制備成約2.0cm 的小段，按0.2g/mL比例，每管加入0.4g。

組別5：聚乙烯粒料：直徑約5mm，按5cm2/mL比例，每管加入10cm2。

組別6：陰性對照組，不添加任何材料。

1.2.2 血漿制備

新鮮抗凝混合人血漿：通過靜脈采血，按血液與抗凝劑9:1的比例加入3.8%檸檬酸鈉溶液抗凝，混勻；然后置于高速冷凍離心機中，在2000g條件下離心10min；然后分離出貧血小板血漿（PPP）[4]；最后將3名志愿者的血漿混勻，保存在冰浴中，備用。

新鮮抗凝混合兔血漿：通過心臟采血，同法制備兔血漿。

1.2.3 血漿與材料接觸

分別向A試驗的所有試管加入2.0mL人血漿，使材料全部被浸沒，B試驗同法加入兔血漿。將所有試管輕輕混勻后放進隔水式恒溫培養(yǎng)箱的旋轉(zhuǎn)培養(yǎng)器上，在（37±1）°C條件下，30r/min動態(tài)接觸60min。溫育結(jié)束后將各管中的血漿分離到新的試管中，分離后將所有試管置于冰浴中待測，最后用全自動血凝分析儀分別測定各管血漿的PTT值。

1.2.4 數(shù)據(jù)分析

根據(jù)ASTM F2382-04提供的依據(jù)，判斷器械或材料對血漿的內(nèi)源性凝血途徑是否有活化作用，需要通過試驗組中的NC值進行判定，結(jié)果評價標(biāo)準見表1。

表1.PTT結(jié)果評價標(biāo)準

NC值計算公式：NC(%)=h1/h0

式中：h1為各組的PTT平均值，h0為陰性對照組中的PTT平均值。

2.結(jié)果

通過計算得出各組試驗結(jié)果的平均值（x）、標(biāo)準差（s）、變異系數(shù)（CV）、NC值和促凝活性分級，詳見表2和表3。

3.討論

本研究的試驗方法主要參考標(biāo)準為ASTM F2382-04，同時也進行了改良。血漿在激活過程中，F(xiàn)XII因子的激活是在帶負電的表面上或者微生物的膜上發(fā)生的一種自激活反應(yīng)，如玻璃、鞣花酸、高嶺土、寅式鹽、硫化的右旋糖苷、磷脂等[9,10]。標(biāo)準推薦使用玻璃珠作為陽性材料，接觸表面積為4cm2/mL，加入血漿孵育15min[5]。有研究表明，玻璃珠按5cm2/mL的比例加入血漿孵育30min后，血漿的凝血時間和FⅫ的活化產(chǎn)物更為穩(wěn)定[8]。為使試驗結(jié)果重復(fù)性和穩(wěn)定性更好，結(jié)合醫(yī)療器械生物學(xué)評價的加嚴浸提原則，研究中各種材料與血漿的接觸比例增大為5cm2/mL，材料與血漿接觸時間從15min延長至60min，血漿均采用新鮮混合血漿以減少個體差異[11]。

表2.A試驗結(jié)果(人血漿)

表3.B試驗結(jié)果(兔血漿)

鞣花酸和玻璃珠可作為內(nèi)源性凝血途徑的激活劑，APPT試劑中常添加鞣花酸作為激活劑，所以本研究選擇鞣花酸和玻璃珠作為陽性對照材料[5,9,10]。分析表2、3的統(tǒng)計數(shù)據(jù)，兩種血漿試驗中鞣花酸組和玻璃珠組的NC值均符合標(biāo)準中陽性材料的要求（NC值要求小于50%），兩種血漿試驗中各組的變異系數(shù)（CV）均小于15%，且各管PTT值均在本組均值的±25%范圍內(nèi)[5,12]。所以人血漿和兔血漿進行的PTT試驗均符合ASTM F2382-04的標(biāo)準要求，試驗體系均成立。

分析表2、3的統(tǒng)計數(shù)據(jù)，根據(jù)ASTM F2382-04促凝活性的分級依據(jù)，對兩種血漿的試驗結(jié)果進行促凝活性分級，聚乙烯粒料、顱內(nèi)支撐導(dǎo)管、導(dǎo)絲、鞣花酸4種醫(yī)療器械或材料的促凝活性分級均為：重度、中度、輕度、極輕。雖然玻璃珠組的人血漿和兔血漿的促凝血活性分級有差異，其原因可能是由于部分凝血活酶對不同物種的凝血因子的敏感性存在差異，導(dǎo)致同一材料在同一試驗條件下使用不同物種的血漿，其PTT值可能有差異，即使是同一血漿測試不同批次同一物種來源的部分凝血活酶，其PTT值也會產(chǎn)生差異[13]。但玻璃珠組人血漿和兔血漿的NC值陽性材料劃分是具有一致性的，均小于50%，且其NC值在各組的階梯值位置也是具有一致性的?？梢姴煌牧蠈θ搜獫{和兔血漿的內(nèi)源性凝血途徑的激活作用有良好的一致性。

綜上所述，此次研究使用人血漿和兔血漿進行的PTT試驗，基于ASTM F2382-04標(biāo)準要求的同時也有所改進，其結(jié)果均符合ASTM F2382-04標(biāo)準的要求，試驗體系成立，試驗結(jié)果具有良好的一致性。局限于人血的來源和醫(yī)療器械產(chǎn)品的復(fù)雜性，此次研究的器械或材料和數(shù)據(jù)還不夠全面，如未在此次研究中找到對內(nèi)源性凝血途徑無激活作用的器械或材料。此次研究可為需要長期進行大量日常檢驗工作提供一個可行性選擇，即當(dāng)人血漿來源不足時，兔血漿可作為一種比較理想的血漿來源，應(yīng)用于PTT試驗以評價醫(yī)療器械的促凝活性。