自身免疫病病人外周血NK細胞檢測的意義

陳 琳,呂 程,孟天犁,姜國平,李慧穎,呂英春,江 濤,孔令環(huán)

(吉林省人民醫(yī)院 風濕免疫科，吉林 長春130021)

自身免疫病包括系統(tǒng)性紅斑狼瘡(systemic lupus erythematosus，SLE)、類風濕關(guān)節(jié)炎、風濕熱、多發(fā)性肌炎/皮肌炎等。是風濕性疾病中的一組疾病。其特點為臨床表現(xiàn)多種多樣，多器官受累，重要器官受累可危及生命。應用皮質(zhì)醇、類固醇和免疫抑制劑治療有效。病因未明，與遺傳、免疫、感染等因素有關(guān)。以SLE為例，大量研究[1]表明，多種因素通過影響細胞免疫功能紊亂而致病，SLE存在T、B細胞功能紊亂，但SLE患者外周血淋巴細胞亞群改變與疾病的活動性之間的關(guān)系尚有爭論，多數(shù)學者認為T淋巴細胞功能的紊亂引起B(yǎng)淋巴細胞的高度活化而產(chǎn)生多種自身抗體是本病發(fā)生和發(fā)展主要因素。

自然殺傷(natural killer，NK)細胞在機體正常的免疫、防御機制中起重要作用。本研究采用流式細胞術(shù)檢測外周血NK細胞數(shù)量及其胞膜活化性受體NKG2D(CD314)和抑制性受體NKG2A(CD159)以及穿孔素、顆粒酶-β的表達，探討NK細胞在自身免疫病發(fā)病機制中的作用。

1 資料與方法

1.1 研究對象

選取我院2018年1月-12月自身免疫病住院病人29例。其中女14例，男15例。年齡23-84歲。類風濕關(guān)節(jié)炎8例，強直性脊柱炎4例，銀屑病關(guān)節(jié)炎6例，炎癥性腸病關(guān)節(jié)炎1例，系統(tǒng)性紅斑狼瘡2例，風濕性多肌痛1例，結(jié)締組織病1例，ANCA相關(guān)性血管炎4例，干燥綜合征2例。對照組18例，均為健康體檢者，男10例，女8例，年齡31-53歲。

1.2 試劑、儀器和方法

1.2.1購買美國Beckman Coulter 公司單抗 鼠抗人CD159( (NKG2A)- PE、CD314(NKG2D)-FITC,CD3-ECD、CD16-PC5、CD56-PC5，顆粒酶granzymeβ-PE,穿孔素 perforin-FITC，及溶血劑、破膜劑。

1.2.2流式細胞儀為美國貝克曼公司的多參數(shù)EPICS XL型流式細胞儀，應用EXPO32ADCXL4 Color 軟件分析，在FSC-SSC散點圖上選定淋巴細胞群，結(jié)果以百分率表示。

1.2.3流式細胞術(shù)分析方法 采用微量全血直接免疫熒光技術(shù)標記NK細胞。檢測胞模蛋白： Falcom管加入抗體CD16- PC5、CD56- PC5、CD3-ECD各10 μl、NKG2A- PE 20 μl、NKG2D-FITC 5 μl用于標記NK細胞和NKG2A、NKG2D；再加100 μl外周血，充分混勻。孵育，加入溶血劑500 μl，混勻，室溫避光10 min，1 500 r/min離心5min,棄上清，加500 μl PBS，上機檢測。檢測胞質(zhì)蛋白：Falcom管加入抗體CD16- PC5、CD56- PC5、 CD3-ECD各10 μl，再加100 μl外周血，室溫避光孵育15 min,加入A液50 μl，避光15 min，加入PBS液1 ml洗1次，離心棄上清，加入50 μl B液，依次加入granzyme β- PE、 perforin-FITC單抗各5 μl，4℃避光孵育15 min，加PBS液1 ml洗滌2遍，加500 ul PBS，上機檢測。

1.3 統(tǒng)計學

2 結(jié)果

2.1 自身免疫病病人外周血NK細胞占淋巴細胞百分比

自身免疫病病人外周血NK(CD3-CD16+CD56+)細胞在治療前和治療后均低于正常對照組，但無明顯統(tǒng)計學差異；治療前外周血NK(CD3-CD16+CD56+)細胞在與治療后相比，無明顯統(tǒng)計學差異，見表1。

2.2 自身免疫病病人NK細胞膜活化性受體、抑制性受體表達

自身免疫病病人NK細胞膜活化性受體NKG2D(CD314)的表達在治療前和治療后均低于正常對照組(P≤0.001)；治療后NK細胞膜活化性受體NKG2D(CD314)的表達較治療前上升，但無明顯統(tǒng)計學差異，見表1。

自身免疫病病人NK細胞膜抑制性受體NKG2A(CD159)的表達在治療前和治療后與正常對照組相比，均無明顯統(tǒng)計學差異；治療前NK細胞膜抑制性受體NKG2A(CD159)的表達與治療后相比，無明顯統(tǒng)計學差異，見表1。

2.3 自身免疫病病人NK細胞穿孔素、顆粒酶-β的表達

自身免疫病病人NK細胞穿孔素的表達在治療前和治療后與正常對照組相比，均無明顯統(tǒng)計學差異；治療前NK細胞穿孔素的表達與治療后相比，無明顯統(tǒng)計學差異,見表1。

自身免疫病病人在治療前和治療后NK細胞顆粒酶-β的表達與正常對照組相比，均顯著減低(P<0.05)；但治療前NK細胞顆粒酶-β的表達與治療后相比，無明顯統(tǒng)計學差異，見表1。

表1 外周血NK細胞及其表面受體的表達

與對照組相比較；※P<0.05 治療后與治療前相比較，&P<0.05

3 討論

免疫功能失調(diào)是自身免疫性疾病發(fā)病機制的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。(CD3-CD16+CD56+)NK細胞是天然免疫系統(tǒng)的重要組成部分，在抗病毒感染免疫、腫瘤免疫、移植排斥反應及免疫調(diào)節(jié)中起十分重要的作用[2]。

NK細胞是來源于骨髓的一類淋巴細胞，因胞內(nèi)含有大量嗜天青顆粒，也被稱為大顆粒淋巴細胞(large granular lymphocyte，LGL)。NK細胞廣泛存在于骨髓、肝、子宮、脾、肺、次級淋巴組織(secondary lymphoid tissue，SLT)、黏膜相關(guān)淋巴組織(mucosa-associated lymphoid tissue，MALT)及胸腺，通常占人體外周血單個核細胞(peripheral blood mononuclear cell，PBMC )的5%-15%，僅次于T、B細胞之后[3]。作為天然免疫的重要組成部分，NK細胞是最早到達炎癥位點的細胞之一，起到免疫監(jiān)視作用，主要通過監(jiān)視細胞膜表面的MHC class I分子的含量來識別發(fā)生溶解改變或是受到病毒感染的自體細胞，當靶細胞膜表面低表達MHC class I分子時，NK細胞的抑制因子降低，NK細胞活化，釋放大量細胞毒性顆粒(如：顆粒酶，穿孔素)以及炎性細胞因子(如TNF、IFN-γ)，導致靶細胞死亡。同時在適應性免疫中，NK細胞也參與清除自身反應性T、B細胞[4]。

NK細胞為繼T細胞、B細胞的第3類淋巴細胞，在天然免疫和獲得性免疫中均發(fā)揮重要作用[5，6，7]。NK細胞表面受體對于NK細胞發(fā)揮自身功能活性起到重要作用，其中NKG2家族是近年來研究關(guān)注較多及研究較深入的一類受體，包括NKG2A、NKG2B、NKG2C、NKG2D、NKG2E、NKG2F和NKG2H 等[8]。根據(jù)功能可分為抑制性受體和活化性受體2大類。其中NKG2A是NKG2家族中唯一的抑制性受體，可以識別自身MHC class I，進而阻止NK細胞的活性[9]。人NKG2D是NK細胞表面的活化性受體，能與MHC class I鏈相關(guān)分子A和B結(jié)合，NKG2D受體通常不表達于正常細胞上，但是可以在腫瘤細胞或被感染的細胞中過表達。在正常情況下，NKG2A，NKG2的表達水平處于平衡狀態(tài)，共同調(diào)節(jié)NK細胞的活性。抑制性NK細胞受體的自身抗體和NKG2A的存在可以極度提升 NK 細胞功能導致體內(nèi)自身抗體水平增高最終刺激自身免疫反應[10，11]。關(guān)于RA患者外周血中NK細胞表面受體的表達水平，研究不一致。Vastert等[12]發(fā)現(xiàn)RA患者外周血中NKG2A表達水平低于健康人；另有研究表明RA患者NKG2A+NK細胞的表達水平升高，而NKG2D的表達降低[5]。本研究中，NKG2D的表達降低(P≤0.001)，NKG2A的表達較正常對照組雖然無明顯統(tǒng)計學差異，但表達高于正常組，可能與樣本量不足有關(guān)。NKG2D的表達降低，導致NK細胞活化功能受到抑制，不能有效發(fā)揮堆免疫效應細胞的殺傷作用，從而導致自身免疫病的發(fā)生。

NK細胞通過消除活化的免疫效應細胞執(zhí)行其免疫調(diào)節(jié)過程，關(guān)于此機制，Jacobs等[13]已有研究證實活化的NK細胞可以通過分泌穿孔素，顆粒酶-β等，參與細胞凋亡通路進一步消除機體活化的效應細胞，例如CD4+T細胞等。穿孔素又稱孔道形成蛋白，是NK細胞核細胞毒性T細胞特有的具有殺傷功能的蛋白質(zhì)。殺傷細胞與靶細胞接觸，殺傷細胞的胞漿顆粒即向兩個細胞接觸部位移動，然后被釋放“分泌”到細胞外。穿孔素存在于這種顆粒中，并在Ca2+存在下在靶細胞膜上形成穿膜孔道，導致靶細胞溶解[14]。本研究表明，自身免疫病病人NK細胞顆粒酶-β的表達與正常人相比，顯著降低。這與Vastert等[12]關(guān)于幼年特發(fā)性關(guān)節(jié)炎患者的研究結(jié)果一致。然而相反的是，Ashish 等的研究結(jié)果顯示，RA患者外周血中NK 細胞表達的顆粒酶-β水平是升高的。自身免疫病病人NK細胞穿孔素的表達與正常人相比，無明顯差異。因此，顆粒酶、穿孔素在風濕免疫病的作用機制需要進一步研究。

自身免疫病病人外周血NK細胞占淋巴細胞百分比、NK細胞膜活化性受體、抑制性受體表達、NK細胞穿孔素、顆粒酶-β的表達在治療前后無明顯差異，考慮免疫抑制劑對NK細胞影響較小。

綜上，外周血NK細胞的膜活化性受體NKG2D和顆粒酶-β表達減少可能與自身免疫病的發(fā)生、發(fā)展有關(guān)?？蛇M一步研究NK細胞在自身免疫病的發(fā)病和治療作用，尋找治療自身免疫病的新方法。