以大豆乳清水為原料提取純化大豆素的工藝研究

魯緒強(qiáng) ， 劉代成 ， 劉軍*，李成輝 ， 李敏 ， 尹成文

(1. 山東禹王生態(tài)食業(yè)有限公司，山東 禹城 251200;2.山東師范大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，山東 濟(jì)南 250014)

大豆異黃酮具有較為廣泛的生物活性，由大豆素及其苷、染料木素及其苷、黃豆黃素及其苷組成，具有抗癌(如乳腺癌、前列腺癌、結(jié)腸癌等)[1]、抗老年癡呆、抗衰老、提高機(jī)體免疫力[2-3]、抗輻射[4]、抗菌[5-6]等作用，其中苷質(zhì)量分?jǐn)?shù)占97%以上[7]。研究表明，苷在體內(nèi)微生物(乳酸菌、雙歧桿菌等)酶的作用下可水解成苷元(主要是染料木素和大豆素)，被小腸吸收[8]。大豆異黃酮各組分中能夠產(chǎn)生生理活性的是苷元 ，其醫(yī)療價(jià)值主要來源于苷元形式[9-10]。另外，染料木素和大豆素雖然都是大豆異黃酮苷元，但染料木素比大豆素更容易被腸道微生物降解，生物利用率低，因此大豆素在發(fā)揮生理活性中起主要作用[11]。

為制備有生理活性的大豆異黃酮苷元，并進(jìn)一步分離制備高純度的染料木素和大豆素，人們一直在不懈地探討新的技術(shù)方法。Nemitz等[10]用索氏抽提器對脫脂大豆進(jìn)行酸提(1.3 mol/L HCl，80 ℃，0～6 h)，制備的大豆異黃酮混合物中苷元占92%。Yoshiara等[12]利用發(fā)芽大豆的內(nèi)源β-葡萄糖苷酶將大豆異黃酮苷轉(zhuǎn)變成苷元后提取，大豆異黃酮混合物中苷元占98.7%。Wang等[13]利用外源β-葡萄糖苷酶將大豆異黃酮苷轉(zhuǎn)變成苷元后，采用高速逆流分配色譜儀制備了染料木素、大豆素和黃豆黃素，3種苷元純度均在95%以上。Cao等[14]采用離子液和乙酸乙酯進(jìn)行液-液萃取方法從大豆異黃酮的混合物中制備了染料木素，純度達(dá)到了95.3%。然而這些實(shí)驗(yàn)室方法存在著樣品處理繁瑣，設(shè)備或操作條件要求高，所用萃取試劑種類多、不易回收，試劑用量大且成本高、時(shí)間長、制樣少等問題，難以實(shí)現(xiàn)工業(yè)化制備高純度大豆異黃酮苷元單一產(chǎn)品。

低溫脫脂豆粕經(jīng)稀堿溶液提取后，可使大部分蛋白質(zhì)溶出，鹽酸調(diào)整浸提液酸堿度使蛋白質(zhì)在等電點(diǎn)析出，分離得到蛋白質(zhì)凝乳，排出的則為大豆乳清水。這種堿提酸沉工藝在生產(chǎn)大豆蛋白過程中排放了大量乳清水，其中有較多大豆異黃酮隨廢液排入環(huán)境，成為環(huán)境干擾因素影響動(dòng)植物生長。如果將其從中提取出來作為食品、保健品、藥品原料或檢測用標(biāo)準(zhǔn)品，就會變廢為寶，提高大豆乳清水的再利用率，取得良好的經(jīng)濟(jì)效益。本文以大豆乳清水為原料，提出了一套可工業(yè)化生產(chǎn)具有高活性、高純度大豆素產(chǎn)品的有效方法。

1 儀器與材料

1.1 實(shí)驗(yàn)儀器

HH-S型恒溫水浴鍋(江蘇省金壇市正基儀器有限公司)；CAMAG TLC scanner III型薄層掃描儀(winCATS1.4.4)軟件(瑞士CAMAG公司)；JY02G型凝膠成像儀(北京君意東方電泳設(shè)備有限公司)；EYELA-旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(EYELA株式會社)；10 cm×20 cm GF254硅膠板(青島海洋化工有限公司)。

1.2 實(shí)驗(yàn)材料

大豆乳清水(山東禹王生態(tài)食業(yè)有限公司)；氯仿、甲醇、乙酸、丙酮、乙酸乙酯、碳酸鈉(天津富宇精細(xì)化工有限公司)，分析純；黃豆黃苷、大豆苷、染料木苷、黃豆黃素、大豆素、染料木素(北京索萊寶科技有限公司)，色譜純。

2 方法與結(jié)果

2.1 方法

2.1.1 樣品溶液制備

20 L大豆乳清水經(jīng)自然沉降、分離沉淀后得4 L黃色液體。向該液體中加入碳酸鈉，使體系中碳酸鈉最終濃度為5%。攪拌溶解后靜置0.5～1 h，取上層黃色溶液，加入該液體體積1/2的乙酸乙酯。攪拌提取0.5～1 h，靜置分層，分離出上部乙酸乙酯層。旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除去乙酸乙酯得膏狀物130.2 mg。

將2 g ADS-21大孔樹脂放入98%乙醇中浸泡24 h，濕法裝柱(1 cm×5 cm)。4 BV去離子水沖洗掉乙醇后加入膏狀物，再用4 BV去離子水沖洗掉膏狀物中的水溶性物質(zhì)，4 BV 95%酒精沖洗黃色帶部分，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除去乙醇后得固體產(chǎn)品20 mg。HPD600，D4020，D4006，AB-8大孔樹脂均各取2 g，這4種大孔樹脂處理和分離方法同ADS-21。

2.1.2 大豆異黃酮成分的檢測

2.1.2.1 樣品溶液的配置

將大豆乳清水及自然沉降的下層液、加5% Na2CO3沉降后的上層液、加乙酸乙酯后的上層液各100 mL，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)成固體。將5種大孔樹脂各自分離得到的黃色液體旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)成固體。對9種固體物檢測苷時(shí)，各取2 mg分別溶于1 mL甲醇，檢測苷元時(shí)各取2 mg溶于1 mL乙酸乙酯。將所得產(chǎn)品固體溶解于乙酸乙酯，定容為1.35 mg/mL，作為樣品溶液備用。

2.1.2.2 標(biāo)準(zhǔn)品溶液的配置

用甲醇分別將黃豆黃苷、大豆苷、染料木苷、黃豆黃素、大豆苷元定容為1.58，1.18，1.09，0.32，1.38 mg/mL。用乙酸乙酯將染料木素定溶為1.04 mg/mL。

2.1.2.3 薄層層析掃描方法

苷(黃豆黃苷，大豆苷，染料木苷):將樣品液和標(biāo)準(zhǔn)液點(diǎn)于同一塊高效薄層硅膠板GF254(10 cm×20 cm)上，展開劑(V二氯甲烷:V甲醇:V乙酸=10:2:0.1)，預(yù)平衡20 min，將板放入展開缸，上行展開，展開距13 cm。

苷元(黃豆黃素，大豆苷元，染料木素):將樣品液和標(biāo)準(zhǔn)液點(diǎn)于同一塊高效薄層硅膠板GF254(10 cm×20 cm)上，展開劑(V二氯甲烷:V甲醇:V乙酸=93:7:0.5)，預(yù)平衡20 min，將板放入展開缸，上行展開，展開距13 cm。

苷和苷元檢測的掃描條件：掃描速度 80 nm/s，掃描間隔200 μm，照射燈D2燈，波長260 nm，掃描寬度6.00 mm×0.90 mm。

2.1.2.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備

精密吸取大豆異黃酮標(biāo)準(zhǔn)溶液，以梯度點(diǎn)樣量點(diǎn)于同一高效薄層硅膠板GF254(10 cm×20 cm)上，以2.1.2.3方法進(jìn)行展開、掃描。以大豆異黃酮標(biāo)準(zhǔn)品的質(zhì)量(μg)為橫坐標(biāo)(X)，峰面積積分值為縱坐標(biāo)(Y)，由薄層色譜儀管理軟件winCATS得到線性回歸方程。

2.1.2.5 精密度、重復(fù)性、穩(wěn)定性、回收率檢測方法

同李成輝等[15]方法。

2.2 結(jié)果與分析

2.2.1 大豆異黃酮分離結(jié)果

大豆異黃酮分離結(jié)果見表1，大豆乳清水經(jīng)過兩次沉降分層、乙酸乙酯提取，6種大豆異黃酮成分均逐漸降低。

表1 大豆乳清水分離得大豆異黃酮各組分的質(zhì)量

由表2可知，利用5種大孔樹脂吸附洗脫來純化大豆素，產(chǎn)品純度在89.70%～98.00%。雖然D4020、D4006、AB-8制備的大豆素較多，但純度相對較低。ADS-21雖然也含有雜質(zhì)，但其他大豆異黃酮成分未檢測到，只洗脫得到大豆素1種成分。在此原料條件和提取情況下，ADS-21 更適合大豆素的純化。

表2 不同型號大孔樹脂的純化效果

2.2.2 大豆素的薄層層析檢測結(jié)果

圖1表明大豆素標(biāo)準(zhǔn)品和樣品的比移值(Rf)均為0.34。圖2是大豆素標(biāo)準(zhǔn)品和樣品的薄層層析全波長掃描圖，標(biāo)準(zhǔn)品和樣品掃描峰的完全一致性說明由大豆乳清水所制備樣品與大豆素標(biāo)準(zhǔn)品是同一種物質(zhì)。

圖3為大豆素標(biāo)準(zhǔn)曲線，其方程為Y=9 647.440X-4 164.758，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為2.17%。經(jīng)檢測和計(jì)算，由大豆乳清水制備大豆素產(chǎn)品20 mg，純度為98.5%，其純度滿足常規(guī)標(biāo)準(zhǔn)品要求。薄層層析掃描測定大豆素方法的精密度為1.67%，重復(fù)性為1.83%，穩(wěn)定性為1.89，回收率為96.9%，以上結(jié)果表明了該檢測方法的準(zhǔn)確性、穩(wěn)定性、靈敏性和可靠性。

圖1 大豆素標(biāo)準(zhǔn)品和樣品薄層層析掃描峰圖Fig.1 TLCS peak of daidzein standard substance and sample

圖2 大豆素標(biāo)準(zhǔn)品和樣品全波長掃描峰圖Fig.2 Full wavelength scan peak of daidzein standard substance and sample

圖3 大豆素標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.3 Daidzein standard curve

3 討論

3.1 大豆素的提取方法

大豆異黃酮各個(gè)成分之間具有相似的結(jié)構(gòu)和性質(zhì)[7，16-17]，從結(jié)構(gòu)相近的類似物中分離高純度的目的物一直是一個(gè)具有挑戰(zhàn)性的難題，也是一項(xiàng)極其重要的高新技術(shù)[14]。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，5%碳酸鈉可使大豆乳清水沉淀分層，并明顯降低上清液的染料木素含量，而大豆素含量降低較少。這應(yīng)該與二者的結(jié)構(gòu)有關(guān)，染料木素在5位多一個(gè)酚羥基，其酸性強(qiáng)于大豆素[7]，堿性的碳酸鈉優(yōu)先與染料木素反應(yīng)。大豆異黃酮苷溶于水[7,16-17]，苷在乙酸乙酯中的溶解度很小，乙酸乙酯不溶于水，所以用乙酸乙酯提取5%碳酸鈉的分層液，大豆素、染料木素、黃豆黃素這些苷元易溶于乙酸乙酯，而苷仍留在碳酸鈉溶液中。所以乙酸乙酯提取去除了大部分苷，提取得苷元。乙酸乙酯易于和水分離，分離出的乙酸乙酯只需薄膜蒸發(fā)器即可達(dá)到循環(huán)使用的純度要求。整個(gè)大豆素制備工藝簡單，生產(chǎn)周期短，投資少，不需苛刻的生產(chǎn)條件，易于實(shí)現(xiàn)大規(guī)模生產(chǎn)，為以大豆乳清水為原料工業(yè)化生產(chǎn)高純度大豆素標(biāo)準(zhǔn)品、藥物和保健品提供了技術(shù)基礎(chǔ)。

3.2 大豆素的純化方法

之前的多項(xiàng)研究表明[2,16,18-19],多種大孔樹脂對大豆異黃酮的吸附洗脫均效果良好，表明大孔樹脂純化大豆異黃酮作為一項(xiàng)有效技術(shù)無可質(zhì)疑。但是其上柱樣品的原料來源、提取和分離工藝等均會造成樣品中所含雜質(zhì)的種類、多少不同。洗脫劑的多寡、種類和濃度，大孔樹脂的種類、交聯(lián)度、孔的大小、雜質(zhì)的多少、前處理的效果、機(jī)械強(qiáng)度、極性和疏水性等均影響大豆異黃酮的吸附洗脫效果。大豆乳清水制備大豆素是新工藝，利用大孔樹脂吸附洗脫該樣品制備高純度的大豆素存在諸多不確定因素，必須探討此工藝的相關(guān)參數(shù)。通過查閱資料，我們選擇了5種大孔樹脂對大豆素進(jìn)行分離純化，ADS-21吸附洗脫效果最好，所制備的大豆素純度達(dá)98%以上。

本研究只從大豆乳清水中提取了大豆素，實(shí)際上大豆乳清水中還有其他大豆異黃酮成分存在值待進(jìn)一步研究。大豆乳清水為原料生產(chǎn)大豆異黃酮，簡化了以豆粕為原料生產(chǎn)大豆異黃酮的工藝，是對大豆乳清水的有效利用。把大豆乳清水中的大豆異黃酮全部提取、分離、純化出來作為食品、藥品和標(biāo)準(zhǔn)品等，不僅可以豐富大豆產(chǎn)品加工廠的高附加值產(chǎn)品品種，助推蛋白生產(chǎn)企業(yè)的發(fā)展，同時(shí)易于廢水的后續(xù)處理，能夠改善動(dòng)植物的生存環(huán)境。因此，大豆乳清水是生產(chǎn)大豆異黃酮優(yōu)質(zhì)且低價(jià)的原料，該研究能夠?qū)崿F(xiàn)經(jīng)濟(jì)、社會效益的雙贏。