基于特征圖譜和多指標(biāo)成分含量測(cè)定的不同產(chǎn)地天葵子質(zhì)量分析

孫志強(qiáng)，王笑

(1.山東禹澤藥康產(chǎn)業(yè)技術(shù)研究院有限公司，山東 德州 2512001；2.山東中醫(yī)藥大學(xué) 藥學(xué)院，山東 濟(jì)南 250355)

天葵子為毛茛科植物天葵Semiaquilegiaadoxoides(DC.) Makino的干燥塊根，有清熱解毒、消腫止痛、利尿等作用[1-2]?，F(xiàn)代藥理研究表明，天葵子具有治療乳腺炎、扁桃體炎、癰腫、瘰疬、小便不利等功效[3]。天葵子主要分布于四川、貴州、湖北、湖南、廣西北部、江西、福建、浙江、江蘇、安徽、陜西南部等地[4]。目前已知天葵子中主要成分為氰苷類成分，在現(xiàn)行的2015年版《中國(guó)藥典》中，天葵子藥材的質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)僅限于薄層定性[5]。天葵中含有多種類型的化學(xué)成分，其中內(nèi)酯類和氰苷類化合物為主要成分，并顯示出顯著的藥用活性；格列風(fēng)內(nèi)酯和紫草氰苷，對(duì)二甲苯致小鼠耳腫脹的抑制率分別為64%和20%，表明這兩個(gè)成分均有很好的抗炎活性，且對(duì)乙酰膽堿酯酶有很好的抑制作用，表明其具有較強(qiáng)抑制乙酰膽堿酯酶的活性[6]。

中藥的整體作用及多成分、多靶點(diǎn)的特點(diǎn)，決定了任何一個(gè)單一成分作為指標(biāo)都不能體現(xiàn)中藥的整體質(zhì)量[7]。而現(xiàn)在的特征圖譜用于中藥材或中藥飲片質(zhì)量控制，更能從宏觀上全面地反映中藥所含化學(xué)成分的種類以及數(shù)量[8]。因此，本文對(duì)不同產(chǎn)地天葵子中紫草氰苷、格列風(fēng)內(nèi)酯含量進(jìn)行測(cè)定，并建立天葵子藥材特征圖譜，為天葵子藥材標(biāo)準(zhǔn)化種植及藥材質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)全面提升提供數(shù)據(jù)支撐。

1 實(shí)驗(yàn)儀器與材料

1.1藥材

實(shí)驗(yàn)用藥材經(jīng)濟(jì)南市藥檢所宋希貴主任鑒定為中藥天葵子Semiaquilegiae Radix，全部為人工種植藥材。藥材主要來源于安徽、河南、湖北3個(gè)地區(qū)，詳見表1。

表1 天葵子藥材來源信息表

1.2 儀器與試劑

LC-2030高效液相色譜儀(日本島津制作所)；METTLER TOLEDO XS105電子分析天平(瑞士梅特勒-托利多儀器有限公司)；KDM型可調(diào)控溫電熱套(山東鄄城華魯電熱儀器有限公司)；高速萬能粉碎機(jī)(天津市泰斯特儀器有限公司)。

色譜甲醇、色譜乙腈(SIGMA-ALORICH)為色譜純；其他試劑為分析純。紫草氰苷(111847-201102)對(duì)照品、格列風(fēng)內(nèi)酯(111883-201102)對(duì)照品(中國(guó)食品藥品檢定研究院)。

2 方法與結(jié)果

2.1 天葵子中紫草氰苷與格列風(fēng)內(nèi)酯含量測(cè)定

2.1.1 天葵子供試品溶液的制備

取天葵子藥材粉末(過三號(hào)篩)0.2 g，精密稱定，置錐形瓶中，精密加50%的乙醇20 mL，稱定質(zhì)量，超聲處理30 min，放冷，再稱定質(zhì)量，以50%的乙醇補(bǔ)足減失的質(zhì)量，搖勻，濾過，取濾液，即得。

2.1.2 色譜條件

色譜柱：TSKgel ODS-100V(250 mm×4.6 mm，5 μm)；流動(dòng)相：乙腈-0.2%磷酸溶液，梯度洗脫程序見表2。流速0.4 mL·min-1；檢測(cè)波長(zhǎng)258 nm；柱溫25 ℃；進(jìn)樣量5 μL。

表2 HPLC梯度洗脫程序表

2.1.3 混合對(duì)照品溶液的制備

精密稱取紫草氰苷對(duì)照品15.45 mg，格列風(fēng)內(nèi)酯對(duì)照品11.25 mg，置50 mL容量瓶中，加50%乙醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，得到混合對(duì)照品溶液，置于4 ℃冰箱保存。

2.1.4 線性關(guān)系考察

精密量取2.1.3項(xiàng)下混合對(duì)照貯備液1,1,1,1,1,3 mL，分別置于100,50,25,10,5,10 mL量瓶中，加50%乙醇至刻度，搖勻。分別進(jìn)樣5 μL，測(cè)得峰面積，計(jì)算回歸方程[8]。紫草氰苷的線性方程與回歸系數(shù)分別為Y=9 015 954.59X-8 072.90(r=0.999 8)，結(jié)果表明紫草氰苷進(jìn)樣量在0.015 45～0.463 50 μg范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。格列風(fēng)內(nèi)酯的線性方程與回歸系數(shù)分別為Y=14 143 459.42X+11 219.74(r=0.999 9)，結(jié)果表明格列風(fēng)內(nèi)酯進(jìn)樣量在0.011 25～0.337 50 μg范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.1.5 精密度實(shí)驗(yàn)

取混合對(duì)照品溶液，進(jìn)樣5 μL，連續(xù)進(jìn)樣6次，測(cè)得峰面積值。紫草氰苷的峰面積相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.19%, 格列風(fēng)內(nèi)酯的峰面積相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.25%，表明儀器精密度良好。

2.1.6 穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)

取天葵子藥材粉末約0.2 g，精密稱定，按2.1.1項(xiàng)下的制備方法，制備供試品溶液，分別測(cè)定在0,2,4,6,8,10,12,24 h不同時(shí)間的峰面積。不同時(shí)間點(diǎn)紫草氰苷與格列風(fēng)內(nèi)酯含量的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.87%、0.93%，表明本品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.1.7 重復(fù)性實(shí)驗(yàn)

取天葵子藥材粉末約0.2 g，取6份，精密稱定，按2.1.1項(xiàng)下的制備方法，制備供試品溶液，按照2.1.2色譜方法測(cè)定。不同樣品中紫草氰苷與格列風(fēng)內(nèi)酯含量的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.69%和0.84%，表明本測(cè)定方法重復(fù)性良好。

2.1.8 加樣回收實(shí)驗(yàn)

取天葵子藥材(已知紫草氰苷含量為3.44 mg·g-1，格列風(fēng)內(nèi)酯含量為0.39 mg·g-1)6份，每份約0.1 g，精密稱定，分別精密加入混合對(duì)照品的50%乙醇溶液各20 mL，其中紫草氰苷共0.325 mg，格列風(fēng)內(nèi)酯共0.040 4 mg，按2.1.1項(xiàng)下的制備方法，制備供試品溶液，按照2.1.2色譜方法測(cè)定[9]。紫草氰苷平均回收率為 98.47%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為1.02%，格列風(fēng)內(nèi)酯平均回收率為 99.21%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為1.57%，表明本方法合理可靠。

2.1.9 樣品測(cè)定

取15個(gè)產(chǎn)地的天葵子藥材粉末各約0.2 g，精密稱定，按2.1.1項(xiàng)下方法制備樣品溶液，測(cè)定紫草氰苷與格列風(fēng)內(nèi)酯的含量，每個(gè)產(chǎn)地平行測(cè)定2份，計(jì)算其含量及相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差。樣品中紫草氰苷與格列風(fēng)內(nèi)酯含量測(cè)定結(jié)果見表3。

表3 不同產(chǎn)地天葵子藥材中紫草氰苷與格列風(fēng)內(nèi)酯質(zhì)量分?jǐn)?shù)

2.2 天葵子藥材特征圖譜

2.2.1 精密度實(shí)驗(yàn)

取同一批次天葵子藥材供試品溶液，按已定色譜條件進(jìn)行測(cè)定，連續(xù)進(jìn)樣6次，采用中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)對(duì)精密度實(shí)驗(yàn)的圖譜進(jìn)行分析，計(jì)算共有峰的相對(duì)保留時(shí)間與相對(duì)峰面積的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差，考察儀器的精密度。運(yùn)用中藥指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)計(jì)算[10]，結(jié)果相似度均大于0.90，1～8號(hào)共有色譜峰的相對(duì)保留時(shí)間的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差依次分別為：0.00%，0.17%，0.29%，0.02%，0.26%，0.26%，0.26%，0.26%，相對(duì)峰面積的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差依次分別為：0.00%，0.15%，1.16%，1.15%，0.67%，0.58%，0.29%，0.30%，表明儀器精密度良好(圖2)。

圖2 精密度實(shí)驗(yàn)圖譜匹配結(jié)果Fig.2 Fingerprint matching results of precision experiment

2.2.2 重復(fù)性實(shí)驗(yàn)

按2.1.1項(xiàng)下方法分別制備6份供試品溶液，按已定色譜條件進(jìn)行測(cè)定，同上法進(jìn)行分析，考察實(shí)驗(yàn)方法重復(fù)性。結(jié)果相似度均大于0.97，所得的6個(gè)色譜圖中1～8號(hào)共有色譜峰的相對(duì)保留時(shí)間的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差依次分別為：0.00%，0.03%，0.02%，0.01%，0.09%，0.05%，0.05%，0.05%，相對(duì)峰面積的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差依次分別為：0.00%，0.47%，0.41%，0.09%，0.30%，0.79%，0.49%，0.77%，表明該方法的重復(fù)性良好(圖3)。

圖3 重復(fù)性實(shí)驗(yàn)圖譜匹配結(jié)果Fig.3 Fingerprint matching results of repeatability experiment

2.2.3 穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)

取同一批次供試品溶液，分別在0，2，4，6，8，10，12，24 h進(jìn)行檢測(cè)，同上法進(jìn)行分析，考察樣品的穩(wěn)定性。結(jié)果相似度均大于0.96，所得的8個(gè)色譜圖中1～8號(hào)共有色譜峰的相對(duì)保留時(shí)間的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差依次分別為：0.00%，0.15%，0.60%，0.18%，0.67%，0.70%，0.77%，0.74%，相對(duì)峰面積的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差依次分別為：0.00%，0.57%，1.66%，1.91%，0.61%，0.69%，0.60%，0.71%，表明供試品溶液在24 h的實(shí)驗(yàn)過程內(nèi)保持穩(wěn)定(圖4)。

圖4 穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)圖譜匹配結(jié)果Fig.4 Fingerprint matching results of stability experiment

2.2.4 建立天葵子藥材特征圖譜

依次測(cè)定15批天葵子藥材供試品溶液，采用高效液相色譜儀記錄40 min的色譜圖。根據(jù)15批次天葵子藥材供試品測(cè)定結(jié)果所顯示的峰個(gè)數(shù)、相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積等相關(guān)參數(shù)進(jìn)行分析比較，制定優(yōu)化的特征圖譜。實(shí)驗(yàn)測(cè)得15批次天葵子藥材特征圖譜，可分離出近11個(gè)色譜峰．與共有模式對(duì)照?qǐng)D譜比較，可以得到8個(gè)共有峰，作為特征圖譜特征峰(圖5、圖6)，并指認(rèn)2個(gè)色譜峰(圖7)。以1號(hào)峰為S峰，1～8號(hào)共有色譜峰的相對(duì)保留時(shí)間依次分別為：1.00，1.04，1.13，1.18，1.27，1.34，1.36，1.60，相對(duì)峰面積依次分別為：1.00，0.45，0.15，0.08，0.15，0.20，0.19，0.06。圖6為15批次不同產(chǎn)地天葵子藥材供試品的特征圖譜，與生成的對(duì)照?qǐng)D譜比較，15批次相似度均大于0.9，證明不同批次間藥材比較穩(wěn)定，相似度見表4。

圖5 天葵子藥材對(duì)照特征圖譜Fig.5 Control characteristic fingerprint of Semiaquilegiae Radix

圖6 15批次不同產(chǎn)地天葵子藥材特征圖譜Fig.6 Characteristic fingerprint of 15 batches of Semiaquilegiae Radix of different origins

圖7 混合對(duì)照品特征圖譜Fig.7 Characteristic fingerprint of mixed reference materials

表4 15批樣品相似度結(jié)果

2.3 系統(tǒng)聚類分析

運(yùn)用SPSS 22.0統(tǒng)計(jì)軟件以15批天葵子紫草氰苷與格列風(fēng)內(nèi)酯含量為變量，以歐氏距離(Euclidean 距離)為區(qū)間，采用組內(nèi)均連法，對(duì)15批天葵子進(jìn)行系統(tǒng)聚類分析[11-14]，結(jié)果如圖8所示。由聚類分析樹狀圖可知，15批天葵子可分為3類，1,2,3,4為一類，5,6,7,8,15為一類，9,10,11,12,13,14為一類。由此可知，經(jīng)過聚類分析可以將安徽、湖北、河南的天葵子有效地區(qū)分開來。

圖8 聚類分析樹狀圖Fig.8 Tree diagram of cluster analysis

3 討論

本實(shí)驗(yàn)分別對(duì)提取溶劑、藥材-溶液比以及超聲提取時(shí)間等條件進(jìn)行了系統(tǒng)考察，以提取方法穩(wěn)定可行、提取效率最優(yōu)、色譜峰響應(yīng)、分離度良好為指標(biāo)，最終選擇的提取溶劑為50%乙醇、藥材-溶液比為1∶100、超聲提取時(shí)間為0.5 h。用 PDA 檢測(cè)器對(duì)樣品進(jìn)行 190 ～ 800 nm 全波長(zhǎng)掃描[15-16]，比較各波長(zhǎng)下色譜圖，以峰個(gè)數(shù)多、峰形好、分離度好為基準(zhǔn)，發(fā)現(xiàn)在258 nm下紫草氰苷與格列風(fēng)內(nèi)酯均有較大吸收，且峰個(gè)數(shù)多，故選此波長(zhǎng)為檢測(cè)波長(zhǎng)。本實(shí)驗(yàn)的梯度洗脫條件參考文獻(xiàn)[17]天葵子藥材項(xiàng)下方法，采用100%水相進(jìn)行洗脫，發(fā)現(xiàn)對(duì)色譜柱填料傷害較大，考察了99%水相，發(fā)現(xiàn)并不能使紫草氫苷峰與格列風(fēng)內(nèi)酯峰分開，故本文選用表2的梯度洗脫程序。

本實(shí)驗(yàn)采用HPLC對(duì)不同產(chǎn)地天葵子藥材中2個(gè)成分進(jìn)行含量測(cè)定，發(fā)現(xiàn)每個(gè)產(chǎn)地的天葵子為一類，結(jié)合特征圖譜，對(duì)不同批次天葵子藥材質(zhì)量進(jìn)行了較為系統(tǒng)、整體和全面的分析，15批天葵子特征圖譜相似度較高，說明天葵子各產(chǎn)地藥材質(zhì)量較穩(wěn)定。本文建立的天葵子藥材含量測(cè)定及特征圖譜方法，可以為天葵子藥材的全面質(zhì)量評(píng)價(jià)研究奠定基礎(chǔ)。