2017年和2018年江蘇省水生動(dòng)物氣單胞菌分離鑒定及耐藥分析

吳亞鋒 王楠楠 王晶晶 方蘋 姚俊宇 劉肖漢

摘要：為調(diào)查江蘇省水生動(dòng)物感染氣單胞菌（Aeromonas）的流行規(guī)律和發(fā)病特征，本研究于2017年和2018年在全省范圍內(nèi)采集魚、蝦、蟹等發(fā)病樣品1 375批次，并進(jìn)行細(xì)菌分離鑒定和體外藥敏試驗(yàn)。結(jié)果表明，共分離得到氣單胞菌1 364株，其中以嗜水氣單胞菌最多，占67.23%。最小抑菌濃度（MIC）試驗(yàn)結(jié)果表明，氣單胞菌分離株對8種抗菌素均表現(xiàn)出不同程度的耐藥性，其中喹諾酮類藥物、氟苯尼考對分離株的MIC最低，均為0.39 μg/mL。從耐藥性角度分析，氣單胞菌分離株對恩諾沙星的耐藥率最低，為8.58%。與2017年相比，2018年氣單胞菌分離株對恩諾沙星、硫酸新霉素、甲砜霉素、氟苯尼考、鹽酸環(huán)丙沙星、鹽酸土霉素等6種抗菌素的耐藥率均有所提高。綜上，作為治療水生動(dòng)物細(xì)菌性疾病的常用藥物，恩諾沙星和氟苯尼考目前仍有良好的效果，但須要警惕細(xì)菌耐藥性的進(jìn)一步提高。

關(guān)鍵詞：江蘇省;水生動(dòng)物;氣單胞菌;分離鑒定;抗菌素;耐藥性

中圖分類號(hào)： S941.42 ?文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A ?文章編號(hào)：1002-1302（2020）24-0156-07

氣單胞菌（Aeromonas）廣泛分布于池塘、水庫等不同的水體環(huán)境中[1-2]，在健康人體和魚類體內(nèi)也有分布[3]，為條件致病菌，在應(yīng)激條件（如飼料不佳、溶解氧含量較低、氣候劇變等）下，能引起大宗淡水魚、蝦蟹類等水生動(dòng)物發(fā)生細(xì)菌性出血性敗血癥[4]，造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失。近年來，因?yàn)橐恢睙o法真正做到有針對性地科學(xué)用藥，在生產(chǎn)實(shí)踐中則反映出在疾病防治過程中的亂用、濫用藥物現(xiàn)象比較普遍，極易產(chǎn)生耐藥菌株，加劇了氣單胞菌感染的防治難度[5]。

據(jù)統(tǒng)計(jì)，2017年江蘇省水產(chǎn)養(yǎng)殖面積為 4.21萬hm2，水產(chǎn)品養(yǎng)殖產(chǎn)量為520.1萬t，漁業(yè)產(chǎn)值為1 730億元，占農(nóng)業(yè)經(jīng)濟(jì)總產(chǎn)值的22.51%。2018年江蘇省漁業(yè)經(jīng)濟(jì)總產(chǎn)值達(dá)到3 386億元，同比增長5.1%，水產(chǎn)養(yǎng)殖在農(nóng)業(yè)中的地位和作用凸顯[6-7]。江蘇省2017年因水產(chǎn)病害造成的直接經(jīng)濟(jì)損失高達(dá)47 312萬元，其中細(xì)菌性疾病發(fā)生比率占50.51%。為進(jìn)一步提高水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)的經(jīng)濟(jì)產(chǎn)值和指導(dǎo)養(yǎng)殖戶科學(xué)用藥，十分有必要進(jìn)行細(xì)菌性疾病的監(jiān)測工作。

為探究江蘇省水生動(dòng)物氣單胞菌感染的流行規(guī)律及發(fā)病特征，本研究于2017年、2018年采集了江蘇省主要水產(chǎn)養(yǎng)殖區(qū)常見養(yǎng)殖品種樣品，分離鑒定得到氣單胞菌，并進(jìn)行藥物感受性分析，以監(jiān)測其變化趨勢，同時(shí)繪制分離株對常見藥物的耐藥譜，以期為指導(dǎo)養(yǎng)殖戶規(guī)范用藥提供一定的科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 樣本采集 根據(jù)江蘇省各地水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)發(fā)展情況和養(yǎng)殖規(guī)模，于2017年、2018年采集水生動(dòng)物發(fā)病樣品。樣本采集地區(qū)信息見表1。樣品來源涵蓋大宗淡水魚類如青魚、草魚、鰱、鳙、鯉、鯽、鳊等，特色養(yǎng)殖品種如凡納濱對蝦、暗紋東方鲀、克氏原螯蝦、中華絨螯蟹、脊尾白蝦等。采樣部位包括肝、脾、腎、鰓、腹水等。

1.1.2 主要試劑 細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒、DL2000 DNA marker、核酸染料、瓊脂糖、瓊脂粉等，均購自生工生物工程（上海）股份有限公司;2×PCR Mix液，購自寶生物工程（大連）有限公司;腦心浸液肉湯（BHI），購自英國Oxoid公司;革蘭氏染色液、細(xì)菌生化微量鑒定管，均購自杭州天和微生物試劑有限公司;硫酸新霉素、氟苯尼考、恩諾沙星、甲砜霉素、鹽酸環(huán)丙沙星、紅霉素、鹽酸土霉素和鹽酸多西環(huán)素等8種抗菌素藥物標(biāo)準(zhǔn)品均購自南京鼎國生物技術(shù)有限公司。其他相關(guān)試劑均購自國藥集團(tuán)上?；瘜W(xué)試劑有限公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 菌株分離純化、革蘭氏染色和生化鑒定 氣單胞菌的分離純化按照曹青等的方法[8]進(jìn)行，革蘭氏染色及各項(xiàng)生化指標(biāo)的檢測和結(jié)果判定參照文獻(xiàn)[9]進(jìn)行。

1.2.2 16S rRNA和gyrB基因PCR擴(kuò)增及序列分析 采用16S rRNA和氣單胞菌屬看家基因DNA促旋酶B亞單位合成基因（gyrB）進(jìn)行分子生物學(xué)鑒定，引物序列見表2。細(xì)菌基因組的DNA提取、PCR擴(kuò)增和序列分析按照曹青等的方法[8]進(jìn)行，菌株系統(tǒng)發(fā)育樹用MEGA 5進(jìn)行制作。

1.2.3 最小抑菌濃度（MIC）測定 根據(jù)陳昌福等依據(jù)日本化學(xué)療法學(xué)會(huì)改良的方法[10]進(jìn)行細(xì)菌最小抑菌濃度的測定和判讀。根據(jù)美國國家臨床實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)委員會(huì)（clinical and laboratory standards institute，簡稱CLSI）頒布的判斷標(biāo)準(zhǔn)和趙姝等的方法[11]，進(jìn)行藥物的敏感性結(jié)果判定。判定標(biāo)準(zhǔn)如表3所示，并以大腸桿菌ATCC 25922作為質(zhì)控菌株。

2 結(jié)果與分析

2.1 氣單胞菌分離鑒定結(jié)果

在BHI固體培養(yǎng)基上，氣單胞菌分離株的菌落呈圓形、中央微凸、表面光滑、淡黃色，鏡檢為革蘭氏陰性短桿菌。部分氣單胞菌生化試驗(yàn)結(jié)果見表4，對分離菌進(jìn)行16S rRNA擴(kuò)增，將條帶大小跟預(yù)期目的條帶大小一致（圖1-A）的PCR產(chǎn)物送樣測序，利用Blast比對確定到種。確定為氣單胞菌的菌株，再進(jìn)行g(shù)yrB基因PCR檢測，將條帶大小為 1 100 bp 的樣品（圖1-B）進(jìn)行測序分析和遺傳演化分析（圖2）。

2.2 氣單胞菌分離株種類及組成

2017年和2018年從發(fā)病水產(chǎn)樣品中共分離得到氣單胞菌1 364株，涉及11個(gè)種（表5），其中嗜水氣單胞菌占大多數(shù)，為67.23%，在全省主要水產(chǎn)養(yǎng)殖地區(qū)都能分離到;其次是維氏氣單胞菌和溫和氣單胞菌，分別占17.45%、12.02%;此外還分離到A. culicicola、舒氏氣單胞菌和異嗜糖氣單胞菌等屬內(nèi)不常見菌種，表明氣單胞菌在江蘇省水生環(huán)境中分布廣泛且種類較多。

2.3 菌株來源情況

對氣單胞菌分離株來源情況進(jìn)行分析，由表6可知，鯽源株最多，占38.56%，其次為草魚源和中華絨螯蟹源分離株，分別占22.36%、11.58%。從以青魚、草魚、鰱、鳙、鯉、鯽、鳊為主的大宗淡水魚中共分離到各種氣單胞菌1 018株，占總數(shù)的74.63%。

2.4 氣單胞菌分離株對抗菌藥物的感受性

2.4.1 抗菌藥物對氣單胞菌分離株的MIC 2017年、2018年共分離得到氣單胞菌屬細(xì)菌1 364株，抗菌藥物對其的MIC如表7所示。喹諾酮類藥物、氟苯尼考對氣單胞菌分離株的MIC最低，均為 0.39 μg/mL，其次為硫酸新霉素、鹽酸土霉素、鹽酸多西環(huán)素;紅霉素對氣單胞菌分離株的MIC最高，為50.00 μg/mL。

2.4.2 氣單胞菌對抗菌藥物感受性的變化 根據(jù)抗菌藥物對氣單胞菌分離株的MIC，判定菌株對不同藥物的感受性。如圖3所示，氣單胞菌分離株對恩諾沙星的耐藥率最低，為8.58%，其次為鹽酸多西環(huán)素;除紅霉素外，分離株對甲砜霉素的耐藥率最高，為29.84%。與2017年相比（表8），2018年分離的氣單胞菌分離株對恩諾沙星、硫酸新霉素、甲砜霉素、氟苯尼考、鹽酸環(huán)丙沙星、鹽酸土霉素等6種抗菌素的耐藥率都有所提高，最高提高了17.91%，最低提高1.56%;而對恩諾沙星、甲砜霉素、氟苯尼考、鹽酸環(huán)丙沙星、鹽酸土霉素等5種抗菌素的敏感率下降，其中對氟苯尼考的敏感率下降了10.63%。

2.4.3 抗菌藥物對不同種氣單胞菌分離株的MIC 對抗菌藥物對不同種氣單胞菌分離株的MIC進(jìn)行比較。如表9所示，8種抗菌素對維氏氣單胞菌的MIC均不低于對嗜水氣單胞菌和其他幾種氣單胞菌的MIC，其中恩諾沙星、鹽酸環(huán)丙沙星對它的MIC均為嗜水氣單胞菌的7.8倍;而8種抗菌素對嗜水氣單胞菌的MIC均為最低值，但與溫和氣單胞菌的相差不大。這表明維氏氣單胞菌在氣單胞菌屬中耐藥性較強(qiáng)，具有潛在的威脅，也與近期維氏氣單胞菌引起發(fā)病的報(bào)道越來越多有一定相關(guān)性[12]。

2.5 不同地區(qū)鯽源氣單胞菌分離株對恩諾沙星和氟苯尼考的感受性

恩諾沙星和氟苯尼考在江蘇水產(chǎn)養(yǎng)殖上使用較多。為探究地域差異對恩諾沙星和氟苯尼考耐藥性的影響，以樣本量較大的鯽為研究對象，比較江蘇省13個(gè)地級市鯽源氣單胞菌分離株對這2種抗菌素的耐藥性。

由圖4可知，揚(yáng)州地區(qū)氣單胞菌分離株對恩諾沙星的耐藥率遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于其他地級市，達(dá)到62.5%;其次是徐州市，為25.0%;宿遷、南通、無錫、南京、蘇州、 連云港等市的最低，均為0。南京和鎮(zhèn)江地區(qū)氣單胞菌分離株對氟苯尼考的耐藥率較高，分別為74.19%、71.43%;其次為徐州市，為50.0%;無錫、蘇州、揚(yáng)州、淮安、連云港等市的最低，均為0。鑒于某些地級市鯽源氣單胞菌菌株數(shù)略少，地區(qū)耐藥性趨勢的準(zhǔn)確性還有待持續(xù)監(jiān)測。

揚(yáng)州地區(qū)氣單胞菌分離株對恩諾沙星最耐藥，但對氟苯尼考較敏感;而南京地區(qū)氣單胞菌分離株對氟苯尼考較耐藥，但對恩諾沙星較敏感。這表明不同地區(qū)的養(yǎng)殖用藥習(xí)慣對病原菌分離株的耐藥性有較大影響。

3 討論

氣單胞菌在江蘇省水生環(huán)境中分布廣泛且種類較多，本研究在江蘇省各地采集樣本1 375批次，分離得到氣單胞菌1 364株。丁正鋒等對江蘇省水產(chǎn)養(yǎng)殖主要病原菌開展監(jiān)測工作，通過生化鑒定、分子生物學(xué)鑒定和高通量測序等方法，均發(fā)現(xiàn)在發(fā)病樣品分離菌中以氣單胞菌屬細(xì)菌最多[13-15]。本研究共鑒定出11種氣單胞菌，其中嗜水氣單胞菌在江蘇省主要養(yǎng)殖區(qū)的水生環(huán)境中最常分離到，占總數(shù)的67.23%，其次是維氏氣單胞菌，這與Figueras等的研究結(jié)果[3，16]一致。崔丙健等發(fā)現(xiàn)嗜水氣單胞菌、溫和氣單胞菌和維氏氣單胞菌三者的豐度相差不大[15];而Ghenghesh等則認(rèn)為在水生環(huán)境中溫和氣單胞菌在氣單胞菌中占很大的比例[17];Li等檢測了閩江流域中氣單胞菌的分布，發(fā)現(xiàn)豚鼠氣單胞菌和水族箱氣單胞菌占很大的比例，而維氏氣單胞菌幾乎沒有分離到[18]。造成這些差異的原因可能有地域和樣品來源的不同以及細(xì)菌鑒定方法的不同等。

抗菌藥物對分離株的MIC測定結(jié)果表明，所得到的氣單胞菌分離株對8種抗菌藥物呈現(xiàn)不同程度的耐藥性。其中，喹諾酮類藥物、氟苯尼考對分離株的MIC最低，均為0.39 μg/mL。分離株對恩諾沙星和鹽酸環(huán)丙沙星最敏感，但同時(shí)對恩諾沙星、鹽酸多西環(huán)素等6種抗菌素的耐藥率持續(xù)上升，這提醒我們須要注意抗生素的合理使用，以防止耐藥性的進(jìn)一步上升。本研究中氣單胞菌分離株對鹽酸環(huán)丙沙星的敏感率為76.96%，而汪永祿等對馬鞍山地區(qū)66株環(huán)境源氣單胞菌進(jìn)行藥敏試驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)病原菌對環(huán)丙沙星的敏感率達(dá)100%[19];肖丹等研究發(fā)現(xiàn)94%以上的菌株對新霉素敏感[20]，而黃玉萍等發(fā)現(xiàn)復(fù)合水產(chǎn)養(yǎng)殖環(huán)境中57株氣單胞菌對新霉素的耐藥率達(dá)33.33%[21]。不同地區(qū)、不同養(yǎng)殖品種、不同用藥習(xí)慣，對水生動(dòng)物病原菌的耐藥性均有一定的影響。后續(xù)將開展耐藥基因的檢測，以探討氣單胞菌基因型與耐藥性的相關(guān)性。

作為相關(guān)檢驗(yàn)領(lǐng)域的“金標(biāo)準(zhǔn)”，CLSI初期公布的判定標(biāo)準(zhǔn)主要針對人醫(yī)以及人類抗生素。隨后，該機(jī)構(gòu)在2013年發(fā)布了獸醫(yī)藥物敏感性試驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)。該標(biāo)準(zhǔn)與歐盟藥敏試驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)委員會(huì)（EUCAST）公布的標(biāo)準(zhǔn)一起成為目前我國獸用抗菌藥耐藥判定標(biāo)準(zhǔn)的主要依據(jù)。然而數(shù)據(jù)并不完整，尤其是針對對象不同、藥物種類與判別依據(jù)更是存在一定差異[22]。本研究中紅霉素的判定折點(diǎn)標(biāo)準(zhǔn)是參考其他菌株進(jìn)行的，恩諾沙星的標(biāo)準(zhǔn)也是參考其他喹諾酮類藥物。因此，目前仍沒有符合我國國情的、符合漁業(yè)不同養(yǎng)殖品種的耐藥判定標(biāo)準(zhǔn)，這給水產(chǎn)藥物的科學(xué)使用帶來一定的困擾。本研究通過對江蘇省水生動(dòng)物氣單胞菌分離株開展耐藥性監(jiān)測，了解了氣單胞菌耐藥情況，以期為制定耐藥判定標(biāo)準(zhǔn)和指導(dǎo)水產(chǎn)科學(xué)用藥提供一定的數(shù)據(jù)基礎(chǔ)。

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