AA3型連續(xù)流動(dòng)分析儀測(cè)定植株全氮的方法研究與優(yōu)化

王雪

摘要：為探討采用AA3型流動(dòng)分析儀測(cè)定植株全氮的可行性和方法，以水稻為研究對(duì)象進(jìn)行測(cè)試。通過改變AA3型流動(dòng)分析儀待測(cè)溶液中H2SO4濃度（≥5% 硫酸待測(cè)液），調(diào)節(jié)緩沖液中NaOH的量，保持反應(yīng)混合液的pH值為13，并檢驗(yàn)測(cè)定結(jié)果的穩(wěn)定性及準(zhǔn)確性。結(jié)果表明，調(diào)整NaOH用量后，不同H2SO4用量下，樣品的檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)曲線相關(guān)系數(shù)均在0.9996以上，加標(biāo)回收率在95.40%～104.2%之間。通過調(diào)整NaOH用量，可實(shí)現(xiàn) AA3型流動(dòng)分析儀測(cè)定植物全氮的方法進(jìn)一步完善，從而達(dá)到測(cè)試準(zhǔn)確的目的。

關(guān)鍵詞：AA3型流動(dòng)分析儀;植株全氮;測(cè)試方法

中圖分類號(hào)： S132 ?文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A ?文章編號(hào)：1002-1302（2020）24-0215-05

氮素是植株生長(zhǎng)不可缺少的大量營(yíng)養(yǎng)元素，其含量能夠反映植物的生長(zhǎng)狀況，對(duì)指導(dǎo)農(nóng)業(yè)生產(chǎn)實(shí)踐有著極其重要的意義[1-2]。對(duì)于植物全氮的測(cè)定主要采用凱氏定氮法，即用濃硫酸-催化劑對(duì)樣品進(jìn)行消煮分解，使氮素轉(zhuǎn)化為銨根離子，然后對(duì)銨離子進(jìn)行測(cè)定[3]。目前消煮液中銨離子的定量分析主要有蒸餾滴定法和比色法[4-5]。蒸餾滴定法一般采用人工手段，向消煮液加入過量氫氧化鈉并加熱，將銨離子蒸出并用硼酸液吸收，再經(jīng)過滴定得出銨離子濃度，目前自動(dòng)凱氏定氮儀可以實(shí)現(xiàn)自動(dòng)消煮、蒸餾、滴定等過程。比色法包括銨離子與納氏試劑反應(yīng)生成黃色物質(zhì)，用分光光度計(jì)在420 nm波長(zhǎng)下比色測(cè)定。比色法也包括次氯酸鈉-水楊酸鈉法，銨離子與次氯酸鈉和水楊酸鈉在堿性條件下反應(yīng)生成藍(lán)綠色物質(zhì)，在波長(zhǎng)660 nm處檢測(cè)。

目前，連續(xù)流動(dòng)分析儀（Continuous Flow Analyzer，簡(jiǎn)稱CFA）在分析實(shí)驗(yàn)室被大量使用，并逐漸替代復(fù)雜的手工操作。關(guān)于AA3流動(dòng)分析儀的研究也有報(bào)道，溫云杰等使用AA3流動(dòng)分析儀測(cè)定小麥秸稈全氮含量，并與自動(dòng)凱氏定氮儀進(jìn)行比較[6]。武娟等利用AA3流動(dòng)分析儀測(cè)量復(fù)混肥料中的氨態(tài)氮含量，并對(duì)AA3流動(dòng)分析儀法和國(guó)標(biāo)法進(jìn)行了比較研究[7]。以上都表明2種方法的測(cè)定結(jié)果沒有顯著差異，且流動(dòng)分析儀穩(wěn)定性更高。貝美容等通過改進(jìn)AA3型連續(xù)流動(dòng)分析儀的試劑配制方法，實(shí)現(xiàn)橡膠葉片H2SO4-H2O2消煮樣品中氮、磷、鉀的同時(shí)測(cè)定[8]。張英利等提出植物全氮和土壤AA3流動(dòng)分析儀的測(cè)定方法，并與蒸餾滴定法、FLAstar5000方法進(jìn)行比較，結(jié)果表明，利用AA3流動(dòng)分析儀測(cè)量植株和土壤的全氮含量無(wú)顯著差異[9-10]。

AA3流動(dòng)分析儀在一定領(lǐng)域內(nèi)被許多人員研究使用，但在實(shí)際操作中，不同測(cè)定方法的消煮過程中濃硫酸用量是不同的，從而導(dǎo)致待測(cè)樣品背景酸度不一致。但是AA3型連續(xù)流動(dòng)分析儀測(cè)定植株全氮時(shí)所附試劑配制方法以4%的硫酸濃度為樣品背景來保證反應(yīng)pH值在12.8～13.1之間，因此測(cè)定時(shí)根據(jù)不同的硫酸用量須要調(diào)整試劑配制以達(dá)到測(cè)定所需的pH值。張麗萍等針對(duì)1%～5%的硫酸濃度對(duì)試劑進(jìn)行調(diào)整，來達(dá)到植物全氮的準(zhǔn)確測(cè)定[10]，但是對(duì)于高于5%硫酸濃度的待測(cè)液的研究并未報(bào)道，因此本研究針對(duì)高于5%硫酸濃度待測(cè)液，對(duì)所附試劑配制方法和管路進(jìn)行調(diào)整改進(jìn)，對(duì)AA3型流動(dòng)分析儀測(cè)定植物全氮的方法作進(jìn)一步探索，以達(dá)到準(zhǔn)確測(cè)試的目的。

1 材料與方法

1.1 樣品

供試樣品為水稻分蘗期植株樣品，樣品烘干后粉碎，過0.50 mm篩。

1.2 樣品消煮

稱取0.200 0 g樣品至消煮管中，每個(gè)樣品稱量3份，分別加入5、8、10 mL濃硫酸，搖動(dòng)使硫酸與樣品混勻，放入催化劑（硫酸鉀和硒粉混合物），利用自動(dòng)程序消解系統(tǒng)加熱，升溫速度5 ℃/min，升溫至200 ℃，保持30 min，繼續(xù)加熱至360 ℃，保持 120 min。冷卻至室溫后用去離子水定容至100 mL。

1.3 測(cè)定不同硫酸用量消煮液中的氮濃度

1.3.1 儀器及原理 連續(xù)流動(dòng)分析儀主要由進(jìn)樣器、蠕動(dòng)泵、化學(xué)分析模塊、檢測(cè)器組成，采用片段連續(xù)流動(dòng)分析技術(shù)，即將樣品和試劑混合液被空氣泡均勻分割成小片段，以降低液體的擴(kuò)散及樣品之間的帶過污染[11]。AA3型流動(dòng)分析儀測(cè)定全氮采用多功能MT7模塊見圖1，圖1中括號(hào)中數(shù)字單位為mL/min。此模塊包括透析器和加熱池，樣品和試劑通過蠕動(dòng)泵被同時(shí)輸送到MT7模塊中，經(jīng)過透析器過濾雜質(zhì)并有一定的稀釋，后依次與試劑反應(yīng)，經(jīng)過加熱池加速反應(yīng)，最終的化合物進(jìn)入檢測(cè)器，在特定波長(zhǎng)下進(jìn)行比色。

測(cè)定原理：在堿性條件下（pH值12.8～13.1），樣品消解液中的銨離子與水楊酸鈉和次氯酸鈉吸收反應(yīng)生成藍(lán)色化合物，在660 nm波長(zhǎng)處測(cè)定，顯色液體進(jìn)入比色計(jì)中進(jìn)行比色，測(cè)定峰高值，與標(biāo)準(zhǔn)曲線比較，計(jì)算得到氮濃度[12]。

1.3.2 試劑配制 水楊酸鈉溶液：稱量40 g 水楊酸鈉溶于600 mL去離子水中，加入1 g硝普鈉，定容至1 000 mL。

次氯酸鈉溶液：取3 mL 有效氯含量為5.25%的次氯酸鈉溶液于60 mL去離子水中，定容至 100 mL，現(xiàn)配現(xiàn)用。

緩沖溶液：分別溶解35.8 g Na2HPO4·12H2O、50 g酒石酸鉀鈉及一定量NaOH（根據(jù)待測(cè)液的硫酸濃度確定）于600 mL 去離子水中，定容至 1 000 mL，再加2 mL 22%的Brij-35（非離子表面活性劑，起潤(rùn)滑管路作用）溶液混合均勻。

進(jìn)樣清洗液：與待測(cè)液濃度相同的硫酸溶液。以上所用試劑均為分析純。

標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液：將4.717 g硫酸銨溶解于600 mL去離子水中，定容至1 000 mL，此為1 000 mg/L的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液。

工作標(biāo)準(zhǔn)溶液：從標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液中分別吸取0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 mL到100 mL容量瓶中，用進(jìn)樣清洗液定容。則得到5、10、15、20、25 mg/L氮的標(biāo)準(zhǔn)溶液。

1.3.3 儀器參數(shù)設(shè)置 進(jìn)樣速率為50個(gè)樣品/h;進(jìn)樣時(shí)間與清洗時(shí)間比為2 ∶ 1，即進(jìn)樣48 s，清洗24 s。

1.3.4 回收率測(cè)定 回收率的測(cè)定采用標(biāo)準(zhǔn)加入法。將同一干燥樣品分別稱取2份0.200 0 g，其中1份加入已知氮濃度的硫酸銨標(biāo)準(zhǔn)液，相同條件下進(jìn)行前處理，分別得到樣品氮濃度和檢測(cè)氮濃度。回收率計(jì)算公式：

氮回收率=（檢測(cè)氮濃度-樣品氮濃度）/加標(biāo)氮濃度×100%。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同消解硫酸用量下AA3流動(dòng)分析儀的測(cè)定參數(shù)

針對(duì)消解樣品時(shí)不同的硫酸用量，以最終反應(yīng)條件pH值為13為標(biāo)準(zhǔn)，對(duì)緩沖液中NaOH的量進(jìn)行調(diào)整，不同硫酸用量下AA3流動(dòng)分析儀的測(cè)定參數(shù)見表1。隨著H2SO4用量的增大，NaOH用量相應(yīng)增大，以此將樣品背景中過量的硫酸中和，使最終的反應(yīng)pH值保持在13左右。3種不同硫酸用量的標(biāo)線參數(shù)見圖2，經(jīng)過NaOH用量的調(diào)整，3種不同的硫酸用量消解樣品，AA3流動(dòng)分析儀所測(cè)定的標(biāo)線呈良好的線性，相關(guān)系數(shù)均達(dá)到0.999 6以上。同時(shí)，由表1可知，3種情況的增益均為10，增益即AA3流動(dòng)分析儀測(cè)定濃度時(shí)軟件對(duì)檢測(cè)信號(hào)的放大倍數(shù)，與顯色反應(yīng)的靈敏度相關(guān)。當(dāng)標(biāo)液最高濃度一致且增益相同，說明3種情況下銨離子顯色反應(yīng)的靈敏度沒有顯著差異。

2.2 連續(xù)流動(dòng)分析儀準(zhǔn)確度與精密度分析

將編號(hào)為1、2的2個(gè)水稻植株樣品消煮液分別進(jìn)行5次全氮測(cè)定。AA3流動(dòng)分析儀測(cè)定水稻植株全氮含量重復(fù)性試驗(yàn)結(jié)果見表2。標(biāo)準(zhǔn)偏差在0.07～0.15 g/kg之間;相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差在0.72～0.99%之間，均小于1%。水稻植株全氮含量的5次測(cè)量結(jié)果重復(fù)性較好。而且，樣品1、2被不同硫酸用量消解后，經(jīng)儀器檢測(cè)，其結(jié)果無(wú)顯著差異。

用標(biāo)準(zhǔn)加入法測(cè)定回收率。每個(gè)不同的硫酸用量處理分別取3個(gè)已知濃度的樣品消解液，分別加入5、10、15 mg/L的硫酸銨標(biāo)準(zhǔn)溶液，AA3流動(dòng)分析儀回收率測(cè)定結(jié)果見表3。由表3可知，從低到高的原始氮濃度樣品，在3種不同硫酸用量下，加標(biāo)回收率均在95.40%～104.20%之間。

3 討論與結(jié)論

3.1 AA3流動(dòng)分析儀與其他儀器比較

AA3流動(dòng)分析儀采用的是水楊酸鈉和次氯酸鈉與銨離子產(chǎn)生有色化合物并在特定波段下進(jìn)行比色的原理。這種方法與一般自動(dòng)凱氏定氮儀的滴定原理不同。本研究并未與其他儀器進(jìn)行測(cè)定比較，但目前已經(jīng)有研究表明流動(dòng)分析儀與自動(dòng)凱氏定氮儀所測(cè)樣品含量無(wú)顯著差異[6]，這2種方法優(yōu)缺點(diǎn)比較明顯。常見的全自動(dòng)凱氏定氮儀通過預(yù)設(shè)程序控制蒸餾和滴定等過程，每個(gè)樣品測(cè)定時(shí)間5～10 min，每樣品消耗試劑20～30 mL。AA3流動(dòng)分析儀測(cè)定速率可設(shè)定為50個(gè)/h，每樣品試劑消耗為5～8 mL，因此AA3流動(dòng)分析儀具有更高效、更低成本的優(yōu)勢(shì)。

3.2 AA3流動(dòng)分析儀測(cè)定參數(shù)設(shè)置

AA3流動(dòng)分析儀測(cè)定參數(shù)有很多，最主要的包括進(jìn)樣速率、進(jìn)樣清洗比（單位進(jìn)樣周期內(nèi)進(jìn)樣針吸樣時(shí)間和吸清洗液時(shí)間的比值）和平滑。儀器所帶方法中給定的進(jìn)樣速率為60個(gè)樣品/h，進(jìn)樣清洗比為3 ∶ 1。但是在實(shí)際操作中，由于中外藥品純度差異等因素，直接采用方法給定的參數(shù)并不能帶來良好的測(cè)定效果。進(jìn)樣速率和進(jìn)樣清洗比值不宜過高，否則會(huì)導(dǎo)致樣品間相互干擾，造成樣品出峰異常，根據(jù)經(jīng)驗(yàn)，本研究采用的進(jìn)樣速率為50個(gè)樣品/h，進(jìn)樣時(shí)間與清洗時(shí)間比為2 ∶ 1。平滑的概念是對(duì)應(yīng)的連續(xù)數(shù)據(jù)點(diǎn)數(shù)的平均值，一般平滑設(shè)置為16或30，它可以有效消除峰值噪音帶來的數(shù)據(jù)波動(dòng)。因此適宜的參數(shù)既能保證較高的檢測(cè)速度，也能保證檢測(cè)準(zhǔn)確性。

3.3 針對(duì)不同氮含量待測(cè)液的管路調(diào)整

由于樣品氮含量差異較大，而且方法中原管路測(cè)試范圍是0～25 mg/L。當(dāng)待測(cè)液及標(biāo)液氮含量超出范圍，反應(yīng)顯色會(huì)較深，影響標(biāo)線的線性，進(jìn)而影響結(jié)果的準(zhǔn)確性。

因此，需要對(duì)管路進(jìn)行相應(yīng)的調(diào)整，使測(cè)試范圍擴(kuò)大。調(diào)整內(nèi)容：將原來的進(jìn)樣泵管用更細(xì)型號(hào)泵管代替。這樣減少了待測(cè)液的進(jìn)量，當(dāng)試劑進(jìn)量不變的情況下，檢測(cè)濃度就能夠提升。原來進(jìn)樣泵管為blk/blk型號(hào)，流速為0.32 mL/min，檢測(cè)范圍是0～25 mg/L，當(dāng)換成orn/wht泵管（0.23 mL/min）或orn/gre（0.1 mL/min）泵管時(shí)，檢測(cè)范圍分別擴(kuò)大到0～50 mg/L、0～75 mg/L。

3.4 試劑用量的估算

AA3流動(dòng)分析儀測(cè)定酸消解凱氏氮的試劑都有一定的保質(zhì)期，比如次氯酸鈉溶液需要現(xiàn)配現(xiàn)用，水楊酸鈉溶液保質(zhì)期為1周。為避免試劑配制過少不夠用或配制過多造成浪費(fèi)，可以根據(jù)泵管流速對(duì)試劑用量進(jìn)行估算。公式如下：

試劑用量=樣品數(shù)量÷進(jìn)樣速率×泵管流速。

每種型號(hào)的泵管都對(duì)應(yīng)固定的流速，測(cè)定酸消解凱氏氮常用泵管包括：blu/blu（1.60 mL/min）、red/red（0.80 mL/min）、blk/blk（0.32 mL/min）、orn/wht（0.23 mL/min）。若測(cè)200個(gè)樣品，進(jìn)樣速率為50個(gè)樣品/h，可推算需配制緩沖液384 mL，次氯酸鈉76.8 mL，水楊酸鈉 76.8 mL。但是考慮到前期運(yùn)行試劑基線以及突發(fā)事件，需要在此基礎(chǔ)上再預(yù)留1～2 h的試劑用量，因此測(cè)定200個(gè)樣品所需試劑用量分別為500、100、100 mL。

AA3流動(dòng)分析儀測(cè)定植株全氮時(shí)，根據(jù)樣品前處理的硫酸用量不同，須要對(duì)試劑中緩沖液的NAOH濃度進(jìn)行調(diào)整，從而達(dá)到檢測(cè)pH值為13。調(diào)整后測(cè)定的標(biāo)線相關(guān)系數(shù)均在0.999 6以上;不同硫酸用量處理下，相同樣品檢測(cè)結(jié)果無(wú)明顯差異;檢測(cè)的回收率均在95.40%～104.2%之間;在檢測(cè)過程中，不同的調(diào)整都能夠達(dá)到良好的重復(fù)性，重復(fù)5次的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差均小于1%。因此，針對(duì)不同的硫酸用量消解方法，本研究基于AA3流動(dòng)分析儀對(duì)檢測(cè)植株全氮含量的方法進(jìn)行改進(jìn)，最終滿足檢測(cè)需求。對(duì)比自動(dòng)凱氏定氮儀，具有更高效率及低試劑消耗的AA3流動(dòng)分析儀能夠成為實(shí)驗(yàn)室分析的更優(yōu)選擇，同時(shí)本研究介紹了擴(kuò)大測(cè)試范圍和試劑用量估算方法，為更有效測(cè)定提供一些經(jīng)驗(yàn)。

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