山豆根內(nèi)生菌發(fā)酵苦參的化學(xué)成分研究

宋娜麗 張葦 張毅 張菊 楊麗萍 馬克堅(jiān) 蔡樂 趙霞

[摘要] 目的 研究苦參經(jīng)山豆根內(nèi)生菌發(fā)酵后，其化學(xué)成分的變化，分析山豆根內(nèi)生真菌對苦參化學(xué)成分變化的影響。 方法 利用硅膠柱色譜、薄層層析硅膠板從發(fā)酵苦參中分離得到7個(gè)化合物并利用波譜技術(shù)鑒定其結(jié)構(gòu)。結(jié)果 從發(fā)酵的苦參中分離得到7個(gè)化合物，分別是1H-3-醛基-吲哚（1）、β-谷甾醇（2）、苦參堿（3）、槐定堿（4）、N-苯乙基乙酰胺（5）、氧化苦參堿（6）、胡蘿卜苷（7）。 結(jié)論 1H-3-醛基-吲哚（1）、N-苯乙基乙酰胺（5）首次從發(fā)酵苦參中得到，可能為發(fā)酵后產(chǎn)生的化合物。

[關(guān)鍵詞] 苦參;內(nèi)生菌發(fā)酵;化學(xué)成分;中藥轉(zhuǎn)化

[中圖分類號] R285.5? ? ? ? ? [文獻(xiàn)標(biāo)識碼] B? ? ? ? ? [文章編號] 1673-9701（2020）33-0048-07

[Abstract] Objective To research the changes of chemical composition of sophora flavescens after fermentation by endophyte from radix sophorae tonkinensis， and to analyze the impacts of endophytic fungi from sophora tonkinensis on the changes of chemical composition of sophora flavescens. Methods Seven compounds were isolated from fermented sophora flavescens by silica gel column chromatography and thin layer chromatography silica gel plate， and their structures were identified by spectrum technology. Results Seven compounds were isolated from fermented sophora flavescens， which were 1H-3-aldehyde-indole （1）， β-sitosterol （2）， matrine （3）， sophoridine （4）， N-phenylethylacetamide （5）， oxymatrine （6） and carotene （7）. Conclusion 1H-3-aldehyde-indole （1） and N-phenylethylacetamide （5） were obtained from the fermented sophora flavescens for the first time， which may be compounds produced after fermentation.

[Key words] Sophora flavescens; Endophytic fermentation; Chemical composition; Transformation of traditional Chinese medicine

苦參為豆科植物苦參Sophora flavescens Ait.的干燥根，具有清熱燥濕、殺蟲、利尿的功能，用于熱痢、便血、黃疸尿閉、赤白帶下、陰腫陰癢、濕疹、濕瘡、皮膚瘙癢、疥癬麻風(fēng);外治滴蟲性陰道炎[1-2]。生物堿苦參堿（Matrine）和氧化苦參堿（Oxymatrine）是苦參中的主要活性成分?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究表明，苦參具有燥濕、殺蟲、利尿、抑菌、抗病毒、抗腫瘤等多種藥理活性[3-5]。在醫(yī)藥衛(wèi)生領(lǐng)域的應(yīng)用主要為抑菌、清熱解毒、燥濕、抗炎、抗腫瘤、治療失眠作用[6]?？鄥⒊Ｓ玫奶幏郊爸苿┯锌鄥?fù)方苦參洗液、復(fù)方苦參注射液、苦參堿注射液、氧化苦參堿注射液等[7]。中藥材經(jīng)微生物發(fā)酵后，其化學(xué)成分及含量容易發(fā)生變化[8]，本研究對苦參進(jìn)行微生物發(fā)酵，并分離鑒定其化學(xué)成分，以期討論山豆根內(nèi)生真菌對苦參化學(xué)成分變化及轉(zhuǎn)化的影響。

1 材料與方法

1.1 儀器、試劑與材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)儀器? 核磁共波譜振儀（Bruker AVANCE 400 MHz， Bruker DRX-500 MHz， Brucker AVANCE Ⅲ 600 MHz，德國Bruker公司）;立式壓力滅菌鍋（YXQ-LS-SII系，上海博訊）;垂直層流潔凈工作臺（HKPL，深圳市華控凈化有限公司）;電子天平（HCB-900V，海爾）;OSB-2200旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器（上海愛朗儀器有限公司）;DLSB-5/25低溫冷卻液循環(huán)泵（鄭州凱鵬實(shí)驗(yàn)儀器有限公司）;SHB-3循環(huán)水多用真空泵（鄭州杜甫儀器廠）;ZF-1三用紫外分析儀（上海京工實(shí)業(yè)有限公司）;DBS-40電腦全自動部分收集器（上海瀘西分析儀器廠有限公司）;隔水式恒溫培養(yǎng)箱（GSP-9160MBE，上海博迅）;數(shù)控超聲波清洗器（KQ-700DB型，昆山市超聲儀器有限公司）。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)試劑? 二氯甲烷、甲醇、丙酮、乙酸乙酯、磷酸、石油醚均為分析純試劑。以上試劑均購自西隴科學(xué)股份有限公司。

1.1.3 實(shí)驗(yàn)材料? GF254薄層層析硅膠板（20 cm×20 cm，青島海洋化工有限公司）、色譜柱填充硅膠（200～300目，青島海洋化工有限公司），葡聚糖凝膠（Sephadex LH-20，美國默克公司）;反相硅膠 RP-18（德國 Merck 公司）;薄層層析硅膠板（制備型，1 mm涂層，煙臺江友硅膠開發(fā)有限公司）。

1.1.4 菌株材料? 苦參干燥根，購于云南采云堂藥業(yè)有限公司（批號170701），由云南省中醫(yī)中藥研究院陸宇惠主任藥師鑒定為苦參。植物內(nèi)生真菌（代號：SDG-15）為從山豆根中提取分離得到，各內(nèi)生菌分別發(fā)酵苦參。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 菌株培養(yǎng)發(fā)酵[9]? 取山豆根中分離得到的內(nèi)生菌，使之在馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基（PDA培養(yǎng)基）上進(jìn)行活化，隨后進(jìn)行擴(kuò)大發(fā)酵，在28℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)7 d后備用。苦參藥材用粉碎機(jī)打碎至蓬松狀態(tài)，每份稱取10 g裝于發(fā)酵瓶。加超純水充分浸潤，使藥材剛好完全濕潤。設(shè)空白對照和陰性對照，粉碎藥材后不加水、不進(jìn)行高壓滅菌處理為空白對照。粉碎藥材，加水隔夜放置，充分浸潤藥材后，高壓滅菌不接種內(nèi)生真菌為陰性對照。設(shè)置每瓶編號分別為A1～A10，空白對照1、空白對照2、陰性對照1、陰性對照2，隔夜放置。除空白1、空白2外，高壓蒸汽滅菌（121℃、30 min）后取出冷卻備用。再取山豆根內(nèi)生真菌，在潔凈工作臺中，將活化后的內(nèi)生菌菌絲分別接種到冷卻的苦參藥材上，為防止操作過程中被空氣中雜菌污染等原因，每株內(nèi)生菌分別接種2瓶苦參藥材，于28℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)30 d。

1.2.2 發(fā)酵物的提取分離? 待30 d固體發(fā)酵完成，查看每瓶發(fā)酵物狀態(tài)，肉眼觀察，查看菌落和菌絲形態(tài)、分布是否均勻、顏色是否一致等，取未被雜菌污染且發(fā)酵狀態(tài)良好的發(fā)酵藥材，于每瓶發(fā)酵物中加入200 mL甲醇和5 mL氨水。過夜浸泡，超聲提取30 min/次，3次/樣（功率：1700 W）。合并提取液，減壓除去溶解得到提取物7.2 g。提取物進(jìn)行硅膠柱層析，依次以二氯甲烷/甲醇/氨水的混合溶劑（50∶1∶0.1;20∶1∶0.1;5∶1∶0.1）洗脫，得到三個(gè)餾分Fr.1（1.6 g）、Fr.2（2.7 g）、Fr.3（1.8 g）。分別對三個(gè)餾分進(jìn)行凝膠柱層析除去色素，進(jìn)一步用制備型薄層層析硅膠板分離。從餾分Fr.1分離、濃縮、干燥得到化合物1（3.1 mg）、化合物2（3.5 mg）;從餾分Fr.2中分離得到化合物3（3.6 mg）、化合物4（4.8 mg）、化合物5（2.9 mg）;從餾分Fr.3中分離得到化合物6（6.7 mg）、化合物7（4.8 mg）。

2 結(jié)果

2.1 化合物結(jié)構(gòu)鑒定

化合物1：淡黃色油狀，1H-NMR（600 MHz，MeOD，δ，ppm，J/Hz） 9.89（1H，s，-CHO），8.17（1H，d，J=7.74 Hz，H-8），8.10（1H，s，H-3），7.48（1H，d，J=8.04 Hz，H-5），7.28（1H，dt，J=7.08，1.14），7.24（1H，td，J=7.86，1.02）。13C-NMR（600 MHz，MeOD，δ，ppm，J/Hz）187.4（s，-CHO），139.7（s，C-2，C-9），130.9（d，C-7），125.0（d，C-5），123.6（d，C-6），122.4（d，C-3）。以上波譜數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[10]報(bào)道一致，鑒定該化合物為1H-3-醛基-吲哚。見圖1。

化合物2：白色針晶。其分子式：C29H50O;分子量：414。1H-NMR（400 MHz，CDCl3，δ，ppm）：3.51（1H，m，H-3），5.35（1H，rn，H-6），0.67（3H，s，H-18），1.02（3H，s，H-19），0.92（d，J=6.4 Hz，Me-21）;13C-NMR（100 MHz，CDCl3，δ，ppm）：37.2（t，C-1），31.6（t，C-2），71.8（d，C-3），42.4（s，C-4），140.9（s，C-5），121.8（d，C-6），31.7（t，C-7），31.8（d，C-8），51.1（d，C-9），36.4（s，C-10），21.0（t，C-11），39.6（t，C-12），42.2（s，C-13），56.7（d，C-14），24.2（t，C-15），28.2（t，C-16），55.9（d，C-17），11.9（q，C-18），19.3（q，C-19），36.1（d，C-20），18.7（q，C-21），33.9（t，C-22），26.0（t，C-23），45.8（d，C-24），29.6（d，C-25），19.8（q，C-26），19.0（q，C-27），23.0（t，C-28），12.0（q，C-29）。以上核磁數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[11]報(bào)道一致，鑒定該化合物為[β-谷甾醇（β-sitosterol）][1]。見圖2。

化合物3：黃色粉末，取標(biāo)準(zhǔn)品，經(jīng)薄層色譜（TLC）點(diǎn)板，比較比移值，經(jīng)碘顯色、硫酸顯色反應(yīng)判斷，鑒定為苦參堿。

化合物4：黃色粉末，取標(biāo)準(zhǔn)品，經(jīng)TLC點(diǎn)板，比較比移值，經(jīng)碘顯色、硫酸顯色反應(yīng)判斷，鑒定為槐定堿。

化合物5：淡黃色液體，1 H-NMR（600 MHz，CD3OD， δ，ppm，J/Hz）7.25～7.28（2H，m，Ar 2，6-H），7.17-7.20（3H，m，Ar 3，4，5-H），3.37（2H，m，H-α），2.78（2H，m，H-β），1.90（3H，s，CH3）;13C-NMR（150 MHz，CD3OD，δ，ppm）172.9（CO），140.5（s，C-1），129.7（d，C-3，C-5），129.5（d，C-2，6），127.3（C-4），42.1（t，C-α），36.3（t，C-β），22.6（CH3）。經(jīng)文獻(xiàn)[12]對比，鑒定該化合物為N-苯乙基乙酰胺。見圖3。

化合物6：黃色粉末，經(jīng)TLC比較，取標(biāo)準(zhǔn)品，經(jīng)TLC點(diǎn)板，比較比移值，經(jīng)碘顯色、硫酸顯色反應(yīng)判斷，鑒定為氧化苦參堿。

化合物7：白色粉末。其分子式：C35H60O6，分子量：576。1H-NMR（400 MHz，C5D5N，δ，ppm）：5.34（1H，brs，H-6），5.01（1H，d，J=7.2 Hz，H-1′），0.99（3H，d，J=4.5 Hz，H-21），0.93（3H，s，H-19），0.88（6H，d，J=6.3 Hz，H-26，27），0.67（3H，s，H-18）;13C-NMR（100 MHz，C5D5N，δ，ppm）：38.4（t，C-1），29.4（t，C-2），79.42（d，C-3），40.25（t，C-4），141.86（s，C-5），122.7（d，C-6），33.1（t，C-7），33.0（d，C-8），51.2（d，C-9），37.8（s，C-10），22.2（t，C-11），40.9（t，C-12），43.4（s，C-13），57.7（d，C-14），25.4（t，C-15），27.3（t，C-16），57.2（d，C-17），13.0（d，C-18），20.8（t，C-19），37.3（t，C-20），19.9（d，C-21），35.1（d，C-22），24.3（q，C-23），46.9（q，C-24），31.1（q，C-25），20.3（q，C-26），20.17（t，C-27），30.4（q，C-28），12.9（q，C-29），103.5（d，C-1′），76.2（d，C-2′），79.2（d，C-3′），72.6（d，C-4′），79.1（d，C-5′），63.7（t，C-6′）。以上核磁數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[13]報(bào)道一致，鑒定該化合物為胡蘿卜苷。見圖4。

3 討論

本研究對苦參經(jīng)山豆根內(nèi)生菌發(fā)酵后的化學(xué)成分變化進(jìn)行初步研究。經(jīng)TLC比較，在苦參飲片提取物中未檢測到1H-3-醛基-吲哚（1）和N-苯乙基乙酰胺（5）。對苦參中是否含有這兩個(gè)化合物，相關(guān)文獻(xiàn)中也未見報(bào)道?；诖耍P者認(rèn)為1H-3-醛基-吲哚（1）和N-苯乙基乙酰胺（5）的產(chǎn)生很可能與內(nèi)生真菌的代謝作用有關(guān)。

微生物轉(zhuǎn)化是降低中藥毒性、提高中藥活性成分的重要途徑之一[14]。研究發(fā)現(xiàn)菌株種屬不同，中藥種類不同，轉(zhuǎn)化效果也不一樣[15-17]。生物堿是一類含氮有機(jī)化合物，存在于植物中，具有鎮(zhèn)痛、抗菌抗炎、抗病毒、抗腫瘤等多種藥理作用，但直接從植物中提取生物堿產(chǎn)量低、浪費(fèi)中藥資源。研究發(fā)現(xiàn)，植物內(nèi)生真菌如青霉、曲霉、格孢菌等轉(zhuǎn)化生物堿能力強(qiáng)。同時(shí)，真菌轉(zhuǎn)化可使生物堿的毒性降低，藥效增強(qiáng)，如毒性較大的烏頭堿、馬錢子堿等成分的轉(zhuǎn)化，其過程或與真菌釋放的多種活性酶有重要關(guān)系。如筆者所在實(shí)驗(yàn)室前期發(fā)現(xiàn)的羅杰斯無性穗霉，促使卟啉生物堿轉(zhuǎn)化為4R-羥基卟啉生物堿，采用液體發(fā)酵耗時(shí)短，轉(zhuǎn)化率極好，產(chǎn)物抗腫瘤效果好，水溶性大大增加，解決了抗腫瘤藥物水溶性不好的難題，為研發(fā)水溶性乙酰膽堿酯酶（AChE）抑制劑提供了新途經(jīng)[18]。另外，有利用短刺小克銀漢霉AS3.0970轉(zhuǎn)化苦參堿的報(bào)道，使之轉(zhuǎn)化成羥基苦參堿、13，14-二羥基苦參堿、13-羥基苦參堿的報(bào)道[8]，得到的苦參堿衍生物具有抗腫瘤活性，這也為抗腫瘤等新藥研發(fā)提供了很好的基礎(chǔ)支撐。后期本課題將對發(fā)酵后的苦參藥理作用及活性方面做進(jìn)一步的深入研究。

通過對內(nèi)生菌的鑒定發(fā)現(xiàn)，產(chǎn)喹諾里西啶類生物堿菌株多為鐮刀菌屬。文獻(xiàn)報(bào)道[19]，苦豆子多種內(nèi)生菌誘導(dǎo)子能提高宿主中喹諾里西啶生物堿的含量，篩選出8株優(yōu)勢菌，增長最高的是對照組的2.07倍，與對照組相比差異明顯。可見，內(nèi)生菌種屬的多樣性及自身特點(diǎn)，會使不同的發(fā)酵中藥在種類和含量方面產(chǎn)生不同的轉(zhuǎn)化結(jié)果。

本研究重點(diǎn)探索主要成分及有效成分為生物堿的山豆根中內(nèi)生真菌發(fā)酵轉(zhuǎn)化苦參后，苦參中已知生物堿化學(xué)成分的改變、變化及是否產(chǎn)生新穎結(jié)構(gòu)的生物堿。生物堿是微生物發(fā)酵后次生代謝產(chǎn)物中產(chǎn)生的重要化學(xué)成分之一，目前已經(jīng)從代謝產(chǎn)物中分離到不同類型的生物堿，并且具有較好的生物活性[20]。從研究的情況來看，植物內(nèi)生真菌發(fā)酵后次生代謝產(chǎn)物的研究是植物化學(xué)成分研究及資源開發(fā)利用領(lǐng)域的重要拓展和補(bǔ)充，已經(jīng)成為發(fā)現(xiàn)結(jié)構(gòu)新穎、活性較強(qiáng)生物堿的一個(gè)重要來源，也為新藥的前期開發(fā)提供有效的思路。筆者隨后將對發(fā)酵后的苦參化學(xué)成分及生物活性進(jìn)行更深入的研究。

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（收稿日期：2020-07-31）