COX-2基因多態(tài)性與慢性精神分裂癥患者臨床精神癥狀的關(guān)系

侯文龍 尹曉莉 侯先芹 殷旭圓 惠李 吳競勤 蔣彩霞 賈秋放 蔣萍

[摘要] 目的 探討COX-2基因rs5275多態(tài)性是否會影響慢性精神分裂癥的發(fā)病，并進(jìn)一步檢測是否影響慢性精神分裂癥患者的陰性、陽性等精神癥狀。 方法 本研究于2014～2016年收集564例慢性精神分裂癥受試者及419例健康對照志愿者。采用CRF（Case report form）表收集所有受試者的一般社會人口學(xué)和臨床資料。采用陽性、陰性癥狀量表（Positive and negative syndrome scale，PANSS）對慢性精神分裂癥患者的精神癥狀進(jìn)行評測。采用TaqMan SNP方法對COX-2基因rs5275多態(tài)性進(jìn)行基因分型為CC、CT、TT。比較兩組rs5275等位基因和基因型分布頻率的差異，并分析基因型與慢性精神分裂癥患者臨床精神癥狀之間的關(guān)系。 結(jié)果 在健康對照組和慢性精神分裂癥組之間，COX-2基因rs5275位點(diǎn)的等位基因、基因型頻率分布比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=1.33，df=1，P=0.25;χ2=1.45，df=2，P=0.49）。按COX-2基因rs5275位點(diǎn)的基因型對慢性精神分裂癥組進(jìn)行分組分析，患者陽性癥狀在組間存在顯著差異（P=0.02）。 結(jié)論 COX-2基因rs5275位點(diǎn)可能不影響慢性精神分裂癥的發(fā)病機(jī)制，但可能影響慢性精神分裂癥患者的陽性癥狀。

[關(guān)鍵詞] 慢性精神分裂癥;COX-2基因;rs5275;陽性癥狀;精神癥狀

[中圖分類號] R749.3? ? ? ? ? [文獻(xiàn)標(biāo)識碼] A? ? ? ? ? [文章編號] 1673-9701（2020）36-0028-04

[Abstract] Objective To explore whether the COX-2 gene rs5275 polymorphism can affect the onset of chronic schizophrenia and to further detect whether it affects the negative and positive mental symptoms of patients with chronic schizophrenia. Methods A total of 564 chronic schizophrenia subjects and 419 healthy control volunteers from 2014 to 2016 were collected. CRF（Case report form） was used to collect general sociodemographic and clinical data of all subjects. The Positive And Negative Syndrome Scale（PANSS） was used to evaluate the mental symptoms of patients with chronic schizophrenia. The COX-2 gene rs5275 polymorphism was genotyped into the CC， CT， TT using the TaqMan SNP method. The differences in the distribution frequency of rs5275 alleles and genotypes between the two groups were compared. The relationship between genotypes and clinical mental symptoms in patients with chronic schizophrenia was analyzed. Results There was no significant difference in the distribution of alleles and genotype frequencies at the rs5275 locus of the COX-2 gene between the healthy control group and the chronic schizophrenia group（χ2=1.33， df=1， P=0.25; χ2=1.45， df=2， P=0.49）. The chronic schizophrenia group was analyzed according to the genotype at the rs5275 locus of the COX-2 gene. There were significant differences in the positive symptoms of patients between the groups（P=0.02）. Conclusion The rs5275 locus of COX-2 gene may not affect the pathogenesis of chronic schizophrenia， but may affect the positive symptoms of patients with chronic schizophrenia.

[Key words] Chronic schizophrenia; COX-2 gene; rs5275; Positive symptoms; Mental symptoms

目前研究已經(jīng)證實(shí)遺傳和環(huán)境因素的共同作用導(dǎo)致精神分裂癥的發(fā)生[1]。精神分裂癥為復(fù)雜的多基因遺傳性疾病，并且遺傳因素在精神分裂癥發(fā)病中的影響作用高達(dá)70%～85%[2-3]。近年來，精神分裂癥的免疫炎癥系統(tǒng)功能異常也已經(jīng)被發(fā)現(xiàn)[4]。因此，精神分裂癥免疫炎癥系統(tǒng)及其基因或可影響免疫系統(tǒng)的通路及其炎癥蛋白的表達(dá)。

環(huán)氧化酶-2（COX-2）是炎癥介質(zhì)前列腺素生物合成的一種限速酶，在組織損傷、炎癥發(fā)生等情況下表達(dá)增強(qiáng)[5]。COX-2與各種急性和慢性精神和神經(jīng)退行性疾病，包括帕金森病、阿爾茨海默病、精神分裂癥的發(fā)病和疾病進(jìn)展有關(guān)[4，6-7]。COX-2基因3'非轉(zhuǎn)錄區(qū)域內(nèi)的8473T>C（rs5275）是其功能性位點(diǎn)，可以通過信使RNA穩(wěn)定性及翻譯情況對該基因的表達(dá)進(jìn)行調(diào)控[8]。本研究選取COX-2基因rs5275位點(diǎn)，探討該位點(diǎn)多態(tài)性是否參與及影響慢性精神分裂癥的發(fā)病和臨床精神癥狀。

1 資料與方法

1.1 一般資料

本研究于2014～2016年共收集564例慢性精神分裂癥受試者的血液標(biāo)本。納入標(biāo)準(zhǔn)：（1）精神分裂癥的診斷依據(jù)國際疾病分類標(biāo)準(zhǔn)第10版（ICD-10）來進(jìn)行診斷;（2）受試者年齡16～40歲;（3）接受初中（7年）教育水平以上;（4）可以順利評估精神科臨床癥狀;（5）受試者自愿參加本研究，簽署受試者知情同意書;（6）慢性精神分裂癥受試者要求病程超過2年。排除標(biāo)準(zhǔn)：（1）不符合ICD-10中精神分裂癥診斷標(biāo)準(zhǔn);（2）合并中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病等;（3）合并嚴(yán)重的軀體疾病;（4）處于妊娠期、哺乳期的女性。419名健康對照受試者來自溫州康寧醫(yī)院健康體檢中心，健康對照組納入標(biāo)準(zhǔn)：（1）目前或既往無精神疾病史，無家族精神病史，無藥物成癮依賴史，無嚴(yán)重軀體疾病;（2）自愿參與本研究。健康對照組排除標(biāo)準(zhǔn)：（1）合并各種精神疾病;（2）合并中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病;（3）合并嚴(yán)重的軀體疾病等;（4）處于妊娠期、哺乳期的女性。本研究通過醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會批準(zhǔn)，所有入組受試者均簽署受試者知情同意書。

1.2 研究方法

1.2.1 收集臨床資料? 采用自制病例報告表（Case report form，CRF）收集受試者的臨床癥狀和人口學(xué)數(shù)據(jù)（包括年齡、性別、受教育年限等）。由兩名通過專業(yè)培訓(xùn)的精神科醫(yī)師同時采用PANSS量表評測慢性精神分裂癥患者的臨床精神癥狀。兩名評測醫(yī)師經(jīng)過PANSS量表一致性培訓(xùn)（Kappa=0.82）。

1.2.2 DNA提取? 采集所有受試者的5 mL靜脈血，使用DNA提取試劑盒（Promega公司）并按其操作說明提取DNA。操作步驟如下：將靜脈抗凝血進(jìn)行血漿分離→將900 μL細(xì)胞裂解液加入1.5 mL EP離心管中→加入分離后剩余全血200 μL后，顛倒混勻，常溫下裂解20 min→10 000 rpm離心4 min，去除上清液，再次振蕩懸浮沉淀物→加入300 μL細(xì)胞核裂解液，輕柔振蕩混勻，37℃水浴30 min→加入RNA降解酶1.5 μL，振蕩混勻，37℃水浴15 min→加入100 μL蛋白沉淀液，混勻，常溫下放置20 min→12 000 rpm離心4 min，將上清液轉(zhuǎn)移至新的EP離心管中→加入300 μL異丙醇，輕柔顛倒，靜置20 min→12 000 rpm離心4 min，去除上清，加入300 μL 70%乙醇，輕柔混勻，洗脫異丙醇→12 000 rpm離心4 min，去除上清，晾干EP管→加入100 μL DNA溶解液，溶解DNA，置于4℃冰箱內(nèi)過夜備用→應(yīng)用超微量分光光度計(jì)檢測DNA溶液濃度，并標(biāo)準(zhǔn)化DNA溶液濃度至20 ng/μL，儲存于-80℃冰箱。

1.2.3 COX-2基因rs5275位點(diǎn)的檢測? 使用實(shí)時熒光定量PCR儀（QuantStudioDx，Thermo公司）以及COX-2基因rs5275的引物和熒光探針（Thermo公司），采用TaqMan探針技術(shù)對rs5275多態(tài)性進(jìn)行基因分型檢測，分型為CC、CT和TT。操作步驟如下：由Thermo公司生產(chǎn)合成rs5275位點(diǎn)引物和熒光探針。用1xTE緩沖液按1∶1稀釋引物探針混合物，將稀釋后在引物探針混合物、2 x PCR Master Mix和無菌水按1∶10∶5比例配置PCR反應(yīng)液。在PCR反應(yīng)板每孔中加入4 μL配置的PCR反應(yīng)液，用排槍在每孔中加入1 μL標(biāo)準(zhǔn)化DNA溶液，封板，離心，放入熒光定量PCR儀。通過收集反應(yīng)過程中的熒光信號信息，利用序列檢測系統(tǒng)分析可以得出多態(tài)性位點(diǎn)的基因分型。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

使用SPSS22.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件對本研究的數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。計(jì)量資料符合正態(tài)分布的用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，采用方差分析統(tǒng)計(jì);數(shù)據(jù)不符合正態(tài)分布，用中位數(shù)（四分位數(shù)間距）[M（QR）]表示，采用非參數(shù)統(tǒng)計(jì)分析;計(jì)數(shù)資料采用卡方檢驗(yàn)。采用遺傳統(tǒng)計(jì)軟件SHEsis進(jìn)行哈代-溫伯格（Hardy-Weinberg）遺傳平衡檢驗(yàn);采用χ2檢驗(yàn)分析健康對照組和慢性精神分裂癥組中rs5275位點(diǎn)的等位基因、基因型分布頻率的差異。根據(jù)基因型進(jìn)行分組，由于臨床精神癥狀評分?jǐn)?shù)據(jù)不符合正態(tài)分布，用中位數(shù)（四分位數(shù)間距）表示，對分組后的患者臨床精神癥狀分?jǐn)?shù)進(jìn)行克魯斯卡爾-沃利斯秩檢驗(yàn)（Kruskal-Wallis test），并進(jìn)行事后組間兩兩比較，檢驗(yàn)水準(zhǔn)為P<0.05。

2 結(jié)果

2.1 COX-2基因rs5275多態(tài)性在健康對照組和慢性精神分裂癥組中的Hardy-Weinberg遺傳平衡檢驗(yàn)

根據(jù)遺傳統(tǒng)計(jì)軟件SHEsis分析結(jié)果，COX-2基因rs5275的多態(tài)性位點(diǎn)基因型頻率分布在慢性精神分裂癥組（χ2=0.33，P>0.05）和健康對照組（χ2=1.21，P>0.05）中均符合Hardy-Weinberg遺傳平衡定律。

2.2 COX-2 基因rs5275等位基因、基因型與慢性精神分裂癥的關(guān)聯(lián)分析

在健康對照組和慢性精神分裂癥組的COX-2基因rs5275位點(diǎn)的等位基因、基因型總體分布并未顯示出明顯差異（χ2=1.33，P=0.25;χ2=1.45，P=0.49），見表1。說明rs5275位點(diǎn)的等位基因可能與慢性精神分裂癥發(fā)病不相關(guān)。

2.3 COX-2基因型rs5275與慢性精神分裂癥臨床癥狀

COX-2基因rs5275位點(diǎn)的基因型與慢性精神分裂癥患者臨床精神癥狀之間的關(guān)系，見表2。結(jié)果表明rs5275位點(diǎn)三組基因型的慢性精神分裂癥患者PANSS陽性癥狀分存在顯著差異（P=0.02）;進(jìn)一步兩兩組間分析表明，CT組與TT組PANSS陽性癥狀分存在顯著差異（P=0.02）。說明該基因位點(diǎn)與慢性精神分裂癥的陽性癥狀有關(guān)。

3 討論

本研究發(fā)現(xiàn)，在中國漢族人群中COX-2基因rs5275位點(diǎn)不是慢性精神分裂癥的疾病易感性基因位點(diǎn)，提示該基因位點(diǎn)的多態(tài)性可能不影響中國漢族人群慢性精神分裂癥的發(fā)病。研究表明，精神分裂癥的病理生理學(xué)與免疫系統(tǒng)異常有關(guān)，炎癥是神經(jīng)精神癥狀的驅(qū)動因素，對神經(jīng)元的增殖、存活和分化產(chǎn)生負(fù)面影響[9-10]。炎癥狀態(tài)可以影響中樞單胺遞質(zhì)效應(yīng)、下丘腦-垂體-腎上腺軸和小膠質(zhì)細(xì)胞激活等，這些機(jī)制是精神疾病發(fā)病機(jī)制的重要途徑。研究表明，一些抗炎藥物能夠有效降低精神分裂癥患者精神癥狀的嚴(yán)重程度[11]。COX通路可被IL-2、IL-6和IL-10等炎癥細(xì)胞因子激活，增強(qiáng)和調(diào)節(jié)炎癥過程，并能加劇炎癥介導(dǎo)的神經(jīng)變性。COX-2抑制劑可以減少炎癥負(fù)荷，從而減少了這些途徑對大腦的影響。在動物研究中，COX-2抑制劑可以減少應(yīng)激源對小鼠的影響，以及多巴胺能毒素對小鼠的神經(jīng)退行性作用[12-13]。在臨床試驗(yàn)中也證實(shí)COX-2抑制劑對精神分裂癥具有明顯的療效[14-15]。Müller[4]發(fā)現(xiàn)精神分裂癥的炎癥狀態(tài)與前列腺素和COX-2的增加有關(guān)，并且在精神分裂癥早期階段使用COX-2抑制劑進(jìn)行抗炎治療對精神分裂癥是有利的。Müller等[16]在6周的塞來昔布（一種COX-2抑制劑）聯(lián)合氨磺必利治療精神分裂癥的臨床雙盲對照試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，聯(lián)合用藥治療組的陰性癥狀、臨床癥狀總分及臨床療效總體印象均出現(xiàn)顯著改善。Akhondzadeh等[17]在8周的塞來昔布聯(lián)合利培酮治療慢性精神分裂癥患者的臨床雙盲研究中也發(fā)現(xiàn)，聯(lián)合用藥治療組的陽性癥狀、一般病理癥狀及臨床癥狀總分均得到顯著改善。同樣Müller等[18]也研究發(fā)現(xiàn)塞來昔布聯(lián)合利培酮用藥組的臨床癥狀總分改善明顯。并且其隨后的研究中發(fā)現(xiàn)COX-2抑制劑可以改善精神分裂癥患者的臨床癥狀總分和認(rèn)知水平[19]。上述研究表明，COX-2基因可能與精神分裂癥發(fā)病、精神癥狀、認(rèn)知水平及藥物療效相關(guān)，并且其機(jī)制可能涉及精神分裂癥的免疫炎癥異常假說，為精神分裂癥的免疫治療提供了重要證據(jù)。因此，有必要進(jìn)行COX-2基因rs5275的多位點(diǎn)交互作用對精神分裂癥癥狀、認(rèn)知功能和免疫治療影響的全面性研究。

本研究還發(fā)現(xiàn)，COX-2基因rs5275的多態(tài)性與慢性精神分裂癥的臨床陽性癥狀有關(guān)。該基因位點(diǎn)影響患者臨床陽性精神癥狀的原因可能是該基因位點(diǎn)的多態(tài)性參與調(diào)節(jié)了慢性精神分裂癥患者的多巴胺等神經(jīng)遞質(zhì)的傳遞和異常變化，從而影響了其精神癥狀[20]。因此，全面研究COX-2基因功能性位點(diǎn)、基因表達(dá)水平和腦神經(jīng)遞質(zhì)水平變化與精神分裂癥臨床精神癥狀的關(guān)系是有意義的。

本研究仍有幾點(diǎn)不足：（1）分析單個位點(diǎn)的多態(tài)性，不能準(zhǔn)確充分地反映出基因位點(diǎn)與精神分裂癥的真實(shí)關(guān)系。rs5275位點(diǎn)是COX-2基因多個功能性位點(diǎn)之一，未來需要全面檢測該基因的其他功能位點(diǎn)，采用多位點(diǎn)聯(lián)合分析，進(jìn)一步研究COX-2基因與精神分裂癥的關(guān)系;（2）種族、地域?qū)蚨鄳B(tài)性影響明顯，導(dǎo)致不同人群，甚至不同地域的同種人群其基因多態(tài)性等位基因頻率存在差異，從而可能出現(xiàn)不同的結(jié)論。因此，需要在不同地域和種族中開展COX-2基因rs5275多態(tài)性的研究來驗(yàn)證本研究的結(jié)果;（3）慢性精神分裂癥患者的病程和用藥情況等混雜因素可能干擾患者臨床精神癥狀的評估，并會影響最終結(jié)果。

總之，初步研究發(fā)現(xiàn)，COX-2基因rs5275多態(tài)性可能不影響慢性精神分裂癥的發(fā)病，但可能會影響慢性精神分裂癥的陽性癥狀。未來需要在不同種族中收集大樣本量來研究和驗(yàn)證COX-2基因的多個功能性位點(diǎn)與精神分裂癥的關(guān)系。

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（收稿日期：2020-10-27）